4種豬源病毒多重PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

王 瑩，劉雨田，孫成友，遲田英，宋芳芳，于小靜，吳曉東，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）、尼帕病毒病（Nipahvirus disease，NiVD）、口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）和豬水皰病（swine vesicular disease，SVD）都是豬的高度易感性傳染病，其中ASF、NiVD和FMD屬于烈性傳染病。ASF是當(dāng)今世界上養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴(yán)重的豬病之一，其病原非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是雙鏈DNA病毒，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種蟲媒傳播的DNA病毒[1]。軟蜱作為傳播媒介能夠攜帶ASFV使其在野豬和家豬之間傳播[2]。NiVD是由尼帕病毒（Nipahvirus，NiV）引起的主要侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的急性高度致死性人獸共患病[3-4]。1998年，它被發(fā)現(xiàn)于馬來西亞，次年在尼帕鎮(zhèn)的一名患者體內(nèi)首次分離到病毒并得以命名[5]。在當(dāng)時為控制疫情，馬來西亞政府撲殺了上百萬頭豬。21世紀(jì)初期新加坡因與馬來西亞有生豬貿(mào)易往來，也暴發(fā)過NiVD。豬水皰病病毒（swine vesicular disease virus，SVDV）屬于小RNA病毒科腸病毒屬，與人的柯薩奇B5病毒有密切抗原關(guān)系[6]。該病毒傳染性強(qiáng)，致病率高，可引起各品種、各日齡豬只發(fā)病[7]。FMD是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性并可快速遠(yuǎn)距離傳播的動物疫病。大多數(shù)國家屬于“FMD疫區(qū)”，已消滅FMD的國家或區(qū)域僅占少數(shù)。針對FMD，我國主要采取監(jiān)測和預(yù)防免疫措施，其中Asia I型已退出免疫，實(shí)現(xiàn)了全國免疫無疫水平[8]。目前我國主要流行A型和O型FMDV。

集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖方式使豬群之間的接觸概率大大增加，豬群發(fā)生病毒混合感染的比例也相對上升，這給養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大經(jīng)濟(jì)損失。要加強(qiáng)對動物疫病的認(rèn)識，特別是加強(qiáng)對新發(fā)病和外來病的了解，疫病診斷技術(shù)研發(fā)十分關(guān)鍵。目前，操作性強(qiáng)且能同時檢測ASFV、NiV、SVDV和FMDV 4種重要豬源病毒的多重PCR檢測方法還未見報(bào)道。分子生物學(xué)雖然在不斷發(fā)展，但PCR方法仍是病原檢測的首選。本研究根據(jù)GeneBank登錄的相關(guān)病毒序列，篩選出保守序列進(jìn)行人工合成，將合成序列插入pMD-19T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，以此作為PCR反應(yīng)模板，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，建立了ASFV、NiV、FMDV和SVDV的多重PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和樣品

根 據(jù)GeneBank中登錄的ASFV、NiV、FMDV和SVDV全基因組序列，選擇各自保守基因ASFVP72（KF303314.1）、NiVN（FJ648082.1）、SVDVVP1（AB716937.1）和FMDV全基因組（KY234501.1）中3D基因（7 797～8 071 bp）進(jìn)行人工合成，以pMD-19T為載體進(jìn)行陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建。用于臨床樣品檢測的核酸以及豬圓環(huán)病毒（PCV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）核酸樣本，由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心國家外來動物疫病診斷中心保存。

1.2 主要試劑和儀器

2×Phusion U Green Multiplex PCR Master Mix（Thermo scientific），MinElute Virus Spin Kit（QIAGEN），PrimeScript ? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），PCR儀（GeneMax），電泳儀（Bio-Red）以及凝膠成像系統(tǒng)（上海天能）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)合成的基因序列，利用Primer 5.0軟件進(jìn)行初步分析并設(shè)計(jì)引物，對引物通過在線Blast確定引物特異性。引物序列由寶生物（大連）有限公司合成。引物序列、目的基因、擴(kuò)增片段長度詳見表1。

表1 多重PCR引物詳細(xì)信息

1.4 多重PCR方法建立與條件優(yōu)化

在單一PCR基礎(chǔ)上，對多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化：一是優(yōu)化引物濃度。根據(jù)多重PCR擴(kuò)增條帶明暗程度，設(shè)置ASFV、NiV、FMDV、SVDV引物體積比分別為1:1:1:1、2:1:1:1、2:2:1:1。二是優(yōu)化退火溫度。設(shè)置退火溫度分別為45、48、51、54、57、60 ℃。通過優(yōu)化，篩選出多重PCR最適反應(yīng)條件，并將最適條件下的多重PCR產(chǎn)物送測序。

1.5 敏感性試驗(yàn)

利用紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒初始濃度并計(jì)算每種質(zhì)粒拷貝數(shù)；將質(zhì)粒用EASY Dilution溶液進(jìn)行10倍倍比稀釋，作為敏感性試驗(yàn)反應(yīng)模板；用優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證敏感性。

1.6 特異性試驗(yàn)

以PCV、PPV、PRV、PEDV、CSFV和PRRSV cDNA為模板進(jìn)行多重PCR檢測，同時設(shè)立ASFV、NiV、FMDV、SVDV陽性對照和無菌水陰性對照，用優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證特異性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的多重PCR方 法，對ASFV+NiV+FMDV+SVDV、ASFV+NiV+FMDV、ASFV+NiV+SVDV、ASFV+FMDV+SVDV、NiV+FMDV+SVDV、ASFV+NiV、ASFV+FMDV、ASFV+SVDV、NiV+FMDV、NiV+SVDV、FMDV+SVDV、ASFV、NiV、FMDV和SVDV樣本進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，驗(yàn)證多重PCR方法穩(wěn)定性。

1.8 臨床樣品檢測

48份臨床樣品采集自全國各地養(yǎng)豬場，包括組織勻漿液、全血和拭子。將提取的樣品核酸經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后以cDNA為模板進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR條件優(yōu)化

為獲得最佳試驗(yàn)效果對引物擴(kuò)增條件進(jìn)行摸索和調(diào)整，確定了多重PCR最佳反應(yīng)體系：最適退火溫度為57 ℃（圖1），ASFV、NiV、FMDV、SVDV引物最佳體積比為2:1:1:1；PCR Master Mix 12.5 μL，按優(yōu)化比例混合上下游引物各2.5 μL，每種病毒模板0.5 μL，然后無菌水補(bǔ)足至25.0 μL。最佳擴(kuò)增條件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。測序結(jié)果與參考基因序列同源性在98% 以上。

圖1 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

2.2 敏感性試驗(yàn)

由紫外分光光度計(jì)測得ASFV、NiV、FMDV、SVDV質(zhì)粒初始濃度分別為132、154、491、154 ng/μL。根據(jù)換算公式：質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝/μL）=[6.02×1023× 質(zhì)粒濃度（ng/μL）×10-9]/（660×質(zhì)粒堿基數(shù)），換算為拷貝數(shù)。通過換 算，ASFV、NiV、FMDV和SVDV質(zhì)?？截悢?shù)分別為3.90×1010、4.60×1010、2.09×1011和3.70×1010copies/μL。按照最佳反應(yīng)條件和體系，將上述質(zhì)粒10倍倍比稀釋液混合后作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果（圖2）顯示，本試驗(yàn)建立的多重PCR方法檢測ASFV、NiV、FMDV和SVDV 4種 病毒的最低檢出量分別為390.0、46.0、20.9和37.0 copies/μL。

圖2 多重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 特異性試驗(yàn)

采用優(yōu)化的多重PCR體系及反應(yīng)條件，以常見豬源病毒PCV、PPV、PRV、PEDV、CSFV和PRRSV核酸或cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果（圖3）顯示，PCV、PPV、PRV、PEDV、CSFV和PRRSV模板擴(kuò)增后均未見到擴(kuò)增產(chǎn)物，只有ASFV、NiV、FMDV和SVDV擴(kuò)增出了相應(yīng)目的條帶。

圖3 多重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

不同組合的核酸模板均能擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的目的條帶（圖4），表明建立的多重PCR方法重復(fù)性好。

圖4 多重PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

利用建立的多重PCR方法對本實(shí)驗(yàn)室保存的48份臨床樣品進(jìn)行檢測，沒有發(fā)現(xiàn)混合感染情況，檢測到ASFV陽性25份、FMDV陽性1份，未檢出NiV以及SVDV。隨機(jī)選取23份樣品進(jìn)行單一PCR復(fù)檢，檢測結(jié)果與多重PCR一致（圖5、表2）。

圖5 部分臨床樣品多重PCR檢測結(jié)果

表2 23份臨床樣品多重PCR與單一PCR檢測結(jié)果比較

3 討論

2018年ASF傳入我國，隨后疫情蔓延至所有省份，對養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊。由于沒有相應(yīng)ASFV疫苗和治療藥物，履行嚴(yán)格的檢疫程序和撲殺病死豬是ASF主要防控措施[9]。2020年，我國共報(bào)道18起ASF疫情，其中16起與生豬調(diào)運(yùn)有關(guān)，2起發(fā)生于養(yǎng)殖場[10]，說明防控ASFV傳播仍然非常必要。雖然我國目前尚未有關(guān)于NiVD的報(bào)道，但是在我國南部邊境城市的蝙蝠血液、尿液中均能檢測到NiV抗體[11]。SVD和FMD均以豬口部、鼻部、乳頭以及蹄冠等處發(fā)生水皰為主要癥狀，從臨床癥狀上對這兩種水皰性疫病不易識別，需要通過實(shí)驗(yàn)室檢測進(jìn)行診斷區(qū)分。FMD是我國重點(diǎn)防治的動物疫病，目前還沒有SAT型FMD的報(bào)道，但SAT2型FMDV已由非洲擴(kuò)散至西亞、中東地區(qū)[12]。由于從國外進(jìn)口豬肉、人員往來以及經(jīng)濟(jì)貿(mào)易等因素存在，SAT2型FMDV傳入風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。現(xiàn)有養(yǎng)殖模式下，生豬同時感染2種或2種以上病原體也很常見[13]，因此建立可同時檢測上述4種病毒的方法，對于保證生豬生產(chǎn)健康發(fā)展具有重要意義。

多重PCR在單一PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來，在1次反應(yīng)中加入2對或2對以上引物，可達(dá)到1次擴(kuò)增檢測多種病原的目的。多重PCR在試驗(yàn)原理上與單一PCR相同，但并不是簡單綜合，反應(yīng)體系中組成成分的濃度用量與反應(yīng)條件都需要經(jīng)過試驗(yàn)摸索，還要在瓊脂糖凝膠上區(qū)分不同大小的目的片段。引物設(shè)計(jì)對多重PCR檢測成敗至關(guān)重要，直接影響多重PCR反應(yīng)的特異性與敏感性。多對引物在同一體系中同時反應(yīng)時，不同引物之間不可避免存在相互競爭和干擾，這就要求引物必須高度特異，避免PCR反應(yīng)的非特異性擴(kuò)增。各組引物退火溫度要盡量接近，只有這樣，在同一反應(yīng)條件下每種病毒才都能做到最大限度擴(kuò)增，同時也容易篩選最適退火溫度。

本研究首次建立了ASFV、NiV、FMDV、SVDV多重PCR檢測方法，分別針對ASFVP72、NivN、FMDV3D和SVDVVP1基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，對ASFV、NiV、FMDV、SVDV核酸可分別擴(kuò)增出115、188、275和540 bp的基因片段。片段擴(kuò)增大小與預(yù)期相符，測序結(jié)果與目的基因序列一致，表明設(shè)計(jì)的引物特異性良好，適用于FMDV 7個血清型的通用檢測以及與ASFV、NiV、SVDV的鑒別檢測。敏感性試驗(yàn)表明，ASFV、NiV、FMDV、SVDV 4種病毒檢測敏感性較高，可有效避免低病毒含量樣品出現(xiàn)假陰性情況。4對引物在擴(kuò)增每種病毒DNA/cDNA或進(jìn)行多重PCR時，只能檢測到相應(yīng)病毒目的片段，對PCV、PPV、PRV、PEGV、CSFV和PRRSV核酸擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，說明本研究建立的多重PCR具有良好的特異性。以4種病毒質(zhì)粒的不同排列組合為模板進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段與預(yù)期大小一致，表明建立的多重PCR方法重復(fù)性好。在多重PCR中，各引物使用相同物質(zhì)的量參與反應(yīng)時，擴(kuò)增效果并非均一[14]。本研究對4種病毒引物比例進(jìn)行了優(yōu)化，在不產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和過多引物二聚體的前提下，最終得到當(dāng)ASFV、NiV、FMDV、SVDV引物體積比為2:1:1:1時，多重PCR能達(dá)到最好的擴(kuò)增效果。

利用本方法對48份臨床樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與4種病毒普通PCR方法復(fù)檢一致，符合率為100%。對ASFV樣品檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，所用樣品已通過OIE推薦的熒光定量PCR方法確診，檢測到ASFV陽性26份。在本研究中檢測到25份ASFV陽性，經(jīng)查證，未檢出的那份ASFV陽性樣品是豬糞便拭子，說明本研究建立的多重PCR檢測方法具有較高的實(shí)用價(jià)值，能夠滿足基本的臨床檢測需求。

經(jīng)驗(yàn)證，本研究建立的多重PCR方法敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，可在1份樣品中同時檢測ASFV、NiV、FMDV和SVDV 4種病原，為我國ASF、NiVD、FMD和SVD監(jiān)測、流調(diào)等活動提供了新的技術(shù)支持。