高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定萊蕪香腸中3種β-受體激動劑殘留

王燕紅

（濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟南 250000）

萊蕪香腸舊稱“南腸”，是飲譽山東省內(nèi)外的傳統(tǒng)名吃，在萊蕪有“肴上肴”美稱。萊蕪香腸以“萊蕪黑”豬肉或精選豬肉為主要原料，制作精良，并耐儲存。

克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇都屬于苯乙醇胺類，其中克倫特羅屬于苯胺型，萊克多巴胺、沙丁胺醇屬于苯酚型[1-3]。它們都屬于β-受體激動劑，俗稱“瘦肉精”。將“瘦肉精”添加于飼料中，可促進蛋白質(zhì)合成，加速脂肪轉(zhuǎn)化和分解，從而明顯提高脂肪型動物瘦肉率?！笆萑饩痹趧游矬w內(nèi)殘留時間較長，短期內(nèi)殘留量較大，可通過食物鏈進入人體，給消費者身體健康帶來危害[1，4-5]。我國明確禁止使用β-受體激動劑，然而受經(jīng)濟利益驅(qū)使，其濫用仍然禁而不止[6-7]。動物源性食品中違禁藥物殘留已成為世界范圍內(nèi)的食品衛(wèi)生難題，因此研究快速測定克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇殘留量檢測方法具有十分重要的意義。

目前，β-受體激動劑檢測方法主要有高效液相色譜（HPLC）[8-10]、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）[11-14]、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）[15-17]、放射免疫（RIA）[18]和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）[19]。其中GC-MS和HPLC法樣品前處理過程較為繁瑣、檢測靈度低，且GC-MS法需要衍生化；ELISA法假陽性率較高；而LC-MS法能實現(xiàn)多種β-受體激動劑同時檢測，具有高通量、高效等優(yōu)點。以往藥物殘留研究對象主要集中于豬、牛、羊的鮮肉、肝臟及尿液等，對于肉制品則未見報道。本研究針對克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等3種β-受體激動劑，首次以萊蕪香腸為對象，建立快速簡便、專屬性強、靈敏度高的LC-MS/MS方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1標(biāo)準品與試劑 鹽酸克倫特羅標(biāo)準物質(zhì)（純度98.5%）、萊克多巴胺標(biāo)準物質(zhì)（純度95.5%）、沙丁胺醇標(biāo)準物質(zhì)（純度99.0%），購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護監(jiān)測所；HLB固相萃取柱（6 mL/50 0 mg）、MCX固相萃取柱（3 mL/60 mg），為美國Waters公司產(chǎn)品；β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶，為美國Sigma公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純），為德國Merck公司產(chǎn)品；氨水（分析純）、乙酸銨（分析純）、高氯酸（分析純），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；Thermo scientific 25002-052130色譜柱（50 mm×2.1 mm），購自上海精瑞科學(xué)儀器有限公司；水，來自實驗室超純水機，電導(dǎo)率大于18 MΩ。

1.1.2主要儀器 M3000-TSQ Endura液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，購自Thermo公司；恒溫水浴振蕩器，購自上海精密儀器儀表公司；漩渦混合器，購自上海苑勝儀器設(shè)備有限公司；低溫高速離心機，購自美國貝克曼公司。

1.2 標(biāo)準溶液配制

準確量取適量上述標(biāo)準品，用甲醇溶解并定容，配置成1 μg/mL的單標(biāo)儲備液，置于4 ℃冰箱保存。各吸取一定量上述濃度的單標(biāo)儲備液，用95%甲醇水溶液配置成0.5、1.0、5.0、12.5、25.0、50.0 ng/mL的混合標(biāo)準工作液。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Thermo scientific 25002-052130（50 mm×2.1 mm）；柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量5 μL，流動相甲醇-0.1%甲酸水。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫條件

1.3.2質(zhì)譜條件 串聯(lián)四極桿電噴霧ESI離子源，選擇正離子電離模式；噴霧電壓3 500 V，霧化室溫度350 ℃，鞘氣流量35 mL/min，輔助氣流量5 mL/min，毛細管溫度350 ℃。檢測條件如表2。

1.4 樣品處理

1.4.1提取 準確稱取研磨均勻樣品2.0 g置于50 mL離心管中，加入8 mL pH5.2的0.2 mol/L乙酸銨緩沖液，再加入β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液40 μL，渦旋混勻，于37 ℃電熱恒溫振蕩水槽中水解過夜；取出冷卻后，用高氯酸調(diào)節(jié)pH至1.0，超聲振蕩20 min，取出置于80 ℃水浴30 min；10 000 r/min 10 ℃冷凍離心10 min，收集上清液；殘渣用0.1 mol/L高氯酸重復(fù)提取1次，10 000 r/min離心10 min，合并上清液；用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，準備過小柱凈化。

1.4.2凈化 HLB小柱依次用6 mL甲醇、水活化，將提取液以2 mL/min速度過柱，棄去濾液，用2 mL 5%甲醇淋洗；待小柱抽干后，再用6 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮氣吹至近干；用3 mL 0.1 mmol/L高氯酸溶液溶解殘渣，供MCX小柱凈化用；MCX小柱依次用3 mL 5%甲醇氨、水、0.1 mmol/L高氯酸（pH4.0）溶液活化，將上述凈化液過柱；棄去濾液，再依次用1 mL甲醇、2%甲醇水溶液淋洗，抽干后用7 mL 5%甲醇氨洗脫；洗脫液用氮氣吹至近干后，用1 mL甲醇-0.1%甲酸水（V:V=1:9）復(fù)溶，旋渦混合1 min，過0.2 μm濾膜后上機測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

為使組分獲得更好分離效果，本試驗對流動相進行了優(yōu)化選擇。依據(jù)文獻[5]研究結(jié)果，本試驗通過比較不同流動相組成對信號強度的影響，最終選擇以0.1%甲酸水和甲醇為流動相進行梯度洗脫，分離效果好，靈敏度高、重現(xiàn)性好，分離時間短。在正離子模式下，進行母離子全掃描，確定分子離子，并對儀器電離電壓、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化。經(jīng)過優(yōu)化得到3種β-受體激動劑的全掃描總離子流（TIC）質(zhì)譜色譜圖及MRM色譜圖、二級質(zhì)譜圖（圖1～2）。

表2 β-受體激動劑檢測條件

圖1 TIC質(zhì)譜色譜圖

圖2 β-受體激動劑MRM色譜圖及二級質(zhì)譜圖

2.2 標(biāo)準曲線繪制

按選定的儀器條件對已配置好的系列標(biāo)準溶液進行測量，以組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。標(biāo)準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表3所示，標(biāo)準曲線見圖3。結(jié)果顯示，在此濃度范圍內(nèi)濃度和峰面積之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 6。

表3 線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)

圖3 沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅標(biāo)準曲線

2.3 加標(biāo)回收率及精密度測定

檢出限以3倍噪聲水平計算，使儀器處于走基線狀態(tài)；將衰減調(diào)為最小，使其變?yōu)閯↓X波動狀。將3種β-受體激動劑標(biāo)準溶液稀釋后進樣，計算可得出克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇檢出限均為0.25 μg/kg。采用對陰性樣品進行加標(biāo)回收試驗來考察方法的準確度和精密度。

對本底不含3種β-受體激動劑的萊蕪香腸樣品，分別加入不同體積的1 μg/mL的β-受體激動劑標(biāo)準混合溶液，按1.4步驟進行處理。處理成分別添加相當(dāng)于5、25、45 ng/mL的3種β-受體激動劑標(biāo)準溶液，計算樣品加標(biāo)回收率。每個質(zhì)量濃度水平設(shè)6個平行樣品，計算其相對標(biāo)準偏差（relative standard deviation，RSD）。結(jié)果如表4所示。

由表4可知，方法加標(biāo)平均回收率鹽酸克倫特羅為97.89%～100.21%，RSD為0.14%～1.64%；萊克多巴胺為99.53%～104.07%，RSD為0.13%～1.34%；沙丁胺醇為99.53%～101.27%，RSD為0.10%～1.67%。

表4 3種β-受體激動劑平均回收率和RSD（n=6）

2.4 樣品測定

利用本方法對40份萊蕪香腸制品進行檢測，均未檢出β-受體激動劑殘留，添加回收率均為90.0%～110.0%，相對標(biāo)準偏差為0.1%～2.0%，表明該方法適用性良好。

3 討論

β-受體激動劑通常以游離和結(jié)合兩種形式存在，為將其提取完全，本研究用β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液酶解，使結(jié)合型的β-受體激動劑游離出來。同時，本研究通過固相萃取法對樣品進行凈化，降低了脂肪等雜質(zhì)干擾，起到了良好凈化效果。固相萃取法不僅操作方便，也大大降低了試驗成本。

本試驗研究了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測萊蕪香腸中克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種β-受體激動劑的方法，通過對色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化，建立了可靠且可同時測定萊蕪香腸中3種β-受體激動劑的HPLC-MS/MS分析方法。經(jīng)樣品測定，該方法精密度和準確度高，可用于萊蕪香腸中β-受體激動劑的快速檢測。