馬冠狀病毒感染：馬的新發(fā)病毒性傳染病

朱來華，吳 華，王 群，趙麗青，鄭小龍，鄧明俊，肖西志，孫明君

（青島海關(guān)，山東青島 266002）

1999年，在美國北卡羅來納州腹瀉馬駒的糞便中分離到馬冠狀病毒（equine coronavirus，ECoV）毒株（NC99）[1]。自2010年以來，日本、美國、巴西以及部分歐洲國家（法國、愛爾蘭、英國等）均有發(fā)現(xiàn)零星病例的報道[2-3]。雖然我國尚無ECoV感染的報道，但仇鈺等[4]用自制的ELISA方法，從711份國內(nèi)馬血清中檢出13份陽性（1.83%）。目前尚缺乏詳細(xì)的ECoV流行情況的調(diào)查資料。據(jù)有限的文獻(xiàn)[5]推測，ECoV可能以無癥狀感染形式廣泛分布于全世界馬群。

目前尚不清楚ECoV危害情況。幼齡馬駒和成年馬均可被感染，其他動物是否可以感染ECoV，目前還沒有相關(guān)調(diào)查或報道。通過熒光定量PCR（qPCR）檢測發(fā)現(xiàn)，健康馬駒和臨床發(fā)病馬駒的ECoV陽性檢出率相似[6]。成年馬ECoV感染的發(fā)病率為10%～83%[7-10]，臨床癥狀多表現(xiàn)為發(fā)燒、嗜睡、厭食，較少見到腹痛和腹瀉。大多數(shù)的馬ECoV感染是自限性疾病，死亡很少，通常不需要或只需要有限的支持性治療就會康復(fù)。目前還沒有可供使用的ECoV疫苗。該病預(yù)防僅限于基本的生物安全措施。本文綜述了ECoV的病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床診斷、實驗室診斷以及感染的治療和預(yù)防等內(nèi)容，以期為防控該病提供參考。

1 病原學(xué)

1.1 分類和命名

冠狀病毒科（Coronaviridae）所有成員均為單鏈、正股、不分節(jié)段、包有囊膜的RNA病毒，主要引發(fā)哺乳動物和鳥類的呼吸道、腸道、肝臟或神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在冠狀病毒科正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae）內(nèi)，根據(jù)血清學(xué)交叉反應(yīng)性和遺傳同源性可細(xì)分為4個屬：α 冠狀病毒、β 冠狀病毒、δ 冠狀病毒和γ 冠狀病毒[11]。

ECoV是β 冠狀病毒屬成員，同屬的還有牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）、豬血凝性腦脊髓炎病毒（porcine haemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV）、犬呼吸道冠狀病毒（canine respiratory coronavirus）、非洲羚羊冠狀病毒（bubaline coronavirus）、小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus）和大鼠涎腺淚腺炎冠狀病毒（sialodacryoadenitis rat coronavirus）以及人冠狀病 毒（human coronaviruses，HCoV）OC43、4408和HKU1等[12]。

1.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成

冠狀病毒的核衣殼蛋白與基因組RNA一起在病毒囊膜內(nèi)形成螺旋狀衣殼結(jié)構(gòu)。纖突蛋白（spike protein）的三聚體（trimers）形成嵌入在囊膜中的膜粒突起（peplomers），使其具有冠狀或類冠狀形態(tài)。

此外，病毒粒子的兩個結(jié)構(gòu)蛋白，分別稱為膜蛋白和小膜蛋白，是完全跨膜蛋白[13]。血凝素酯酶蛋白在ECoV膜上形成較小的纖突。

1.3 生物學(xué)特性

目前尚不清楚ECoV作為感染源在環(huán)境中持續(xù)的時間。在室溫下，其他冠狀病毒，如嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒（SARS-CoV），可在醫(yī)院廢水、生活污水和脫氯自來水中持續(xù)2 d，在糞便中持續(xù)3 d，在PBS中持續(xù)14 d，在20 ℃的尿液中持續(xù)17 d。在較低溫度下生存時間可能更長。4 ℃時，SARS-CoV可在廢水中持續(xù)14 d，在糞便或尿液中持續(xù)至少17 d[14]。

ECoV對次氯酸鈉、聚維酮碘、葡萄糖酸氯己定、酚類、季銨化合物、過氧化氫和過氧化合物等常用消毒劑敏感。

1.4 基因組結(jié)構(gòu)和功能

ECoV基因組長為30 992個核苷酸（不包括poly A尾），5'和3'端均有短的非翻譯區(qū)（UTR），GC含量為37.2%。ECoV可能有11個開放閱讀框（1a、1b、2～8、9a和9b），分別編碼2個復(fù)制酶多聚蛋白、5個結(jié)構(gòu)蛋白（血凝素酯酶、纖突、囊膜、膜蛋白和核衣殼）和4個輔助蛋白（NS2、p4.7、p12.7和I）。據(jù)預(yù)測[12]，2個復(fù)制酶多聚蛋白被由3個病毒編碼的蛋白酶分解為16個非結(jié)構(gòu)蛋白（nsp1～16）。ECoV的基因組結(jié)構(gòu)模式見圖1。

圖1 ECoV基因組結(jié)構(gòu)模式[12]

1.5 病毒遺傳變異

ECoV與同屬的3種冠狀病毒（BCoV、HCoV-OC43和PHEV）系統(tǒng)發(fā)育最密切相關(guān)，與其同源性分別為67%、67%和45%。比較這4種冠狀病毒，ECoV nsp3蛋白具有大量的氨基酸缺失和插入。ECoV在1999年從美國的腹瀉馬駒中分離出來，出現(xiàn)時間早于PHEV、BCoV和HCoV-OC43[12]。已發(fā)現(xiàn)4個ECoV分離株的全基因組序列，其中1株來自美國，3株來自日本[12，15]。來自日本的3個分離株與來自美國北卡羅來納州的分離株（NC99）密切相關(guān)，序列同源性為98.2%～98.7%[15]。

1.6 致病機(jī)制

多年以來一直懷疑ECoV可引起馬駒腸炎，實際在健康或腹瀉的馬駒中均可檢測到ECoV，這表明ECoV通常在表現(xiàn)亞臨床癥狀的幼齡馬群內(nèi)流行。ECoV感染后的馬駒缺乏臨床體征的原因可能是宿主因素，如馬駒缺乏特定的受體結(jié)合位點或結(jié)腸內(nèi)存在ECoV特異性母源抗體，可阻止腸炎發(fā)生。所有患有胃腸道疾病的馬駒都與ECoV和其他病原的合并感染有關(guān)，而大多數(shù)無癥狀馬駒則是ECoV單一感染[6]。這一結(jié)果表明，ECoV感染可能會導(dǎo)致繼發(fā)性病毒、細(xì)菌或原蟲感染[16-17]。在臨床感染的成年馬中，主要為ECoV單一感染。這說明感染動物的年齡會影響ECoV的致病性。

據(jù)報道[18]，貓冠狀病毒（feline coronavirus，F(xiàn)CoV）致病性與宿主年齡有關(guān)，2歲以下的貓多發(fā)展成貓傳染性腹膜炎（FIP），年齡較大的貓多表現(xiàn)為慢性病例。FCoV強(qiáng)毒基因型對體液、細(xì)胞介導(dǎo)或混合免疫反應(yīng)，明顯影響冠狀病毒感染的臨床癥狀。另外，自然殺傷細(xì)胞和T調(diào)節(jié)細(xì)胞的嚴(yán)重抑制與臨床癥狀相關(guān)，即細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)減弱與強(qiáng)毒基因型感染有關(guān)[19]。

Fielding等[10]報告了一例出現(xiàn)腦病跡象的嚴(yán)重高氨血癥病例（677 μmol/L，參考區(qū)間≤60 μmol/L）。與ECoV感染相關(guān)的高氨血癥可能是由于胃腸道屏障破壞，導(dǎo)致氨從胃腸道吸收增加。另外，與ECoV感染有關(guān)的細(xì)菌微生態(tài)變化，也可能使腸道氨產(chǎn)量增加。試驗[9-10，20]證明，死亡率與內(nèi)毒素血癥、敗血癥和高氨血癥引起的相關(guān)腦病有關(guān)。

2 流行病學(xué)

2.1 傳染源

病馬或無癥狀感染馬可通過糞便排出病毒，是潛在的傳染源。

2.2 傳播途徑

ECoV通過糞—口途徑傳播，馬直接攝入被糞便污染的飼料和飲水或間接接觸病毒污染的物品而受到感染。

初步流行病學(xué)觀察支持糞—口傳播途徑，并得到了實驗性研究支持。該項研究[15]用ECoV感染馬的糞便材料，通過鼻食管插管成功感染3匹9～10月齡的日本挽馬，其中2匹發(fā)生了臨床疾病，并在糞便中排出了大量ECoV。

在患有傳染性上呼吸道疾病的馬鼻腔分泌物中很少檢測到ECoV，表明ECoV與呼吸道上皮缺乏親嗜性。3匹實驗感染的日本挽馬中，在糞便排毒高峰期間，鼻腔分泌物為ECoV PCR陽性，但無法確定這是由于病毒在鼻腔復(fù)制和排出，還是來源于陽性糞便污染的環(huán)境，或兩者兼而有之[15]。

2.3 易感動物

幼齡馬和成年馬均易感，但ECoV臨床感染主要見于成年馬。據(jù)報道[7-10]：ECoV感染主要在騎乘、比賽和展覽馬匹中暴發(fā)；而育種動物發(fā)病率較低，只發(fā)現(xiàn)紐約州的兩個育種養(yǎng)殖場發(fā)生了ECoV感染。

不同年齡馬的ECoV感染率明顯不同，0～6月齡為20.5%，＞6月齡～5歲為25.3%，5歲以上為54.2%。

在健康或腹瀉的馬駒中均可檢測到ECoV。在兩項研究[16-17]中，來自兩個地理區(qū)域的結(jié)果卻有所不同。在日本北海道日高地區(qū)，所有337匹腹瀉馬駒直腸拭子ECoV均為陰性，而健康馬駒的3/120（2.5%）直腸拭子為ECoV陽性。然而，在美國肯塔基州中部進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，在健康和腹瀉馬駒糞便中檢測到ECoV的比例相似。

研究[9]顯示，用qPCR檢測6月齡以下馬駒的糞便病毒載量似乎低于超過12月齡的馬，盡管這一差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.307），但表明馬駒和大齡馬在腸道中的病毒復(fù)制情況不同。在HCoV感染中，病毒載量是臨床癥狀和死亡率的一個強(qiáng)有力的預(yù)后指標(biāo)[21]。

2.4 流行特點

ECoV感染的發(fā)病率不一，為10%～83%[7-10]。據(jù)報告[7-9]，ECoV感染死亡率很低。但Fielding等[10]報道，美國小型馬的死亡率為27%。2015年，在美國另一微型馬育種養(yǎng)殖農(nóng)場發(fā)生嚴(yán)重但非致命的ECoV感染[10]。美國微型馬對ECoV易感性明顯增加，其原因有待進(jìn)一步研究。

一年四季均有ECoV感染散發(fā)病例，但寒冷季節(jié)更常見。在較冷月份（10月至來年4月），ECoV qPCR檢測陽性數(shù)量較高，表現(xiàn)為糞便樣本陽性率和臨床發(fā)病率較高，這與BCoV所見的季節(jié)性疾病模式相似。

在法國對患有呼吸道或胃腸道癥狀的幼年和成年馬研究中，qPCR檢測發(fā)現(xiàn)2.8%（11/395）的糞便樣本和0.5%（1/200）的鼻拭子呈ECoV陽性[22]?；加邪l(fā)燒和呼吸道癥狀馬的2 437份鼻分泌物中有常見的呼吸道病毒，其中17匹馬（0.7%）呈qPCR陽性[9]。來自沙特阿拉伯和阿曼無癥狀馬的5份直腸拭子（1.6%）經(jīng)PCR證實ECoV陽性，但未在鼻拭子中檢出陽性[23]。這些研究表明，健康馬和呼吸道感染馬的鼻分泌物中很少檢測到ECoV。

ECoV潛伏期短，常在自然暴露或?qū)嶒灨腥竞?8～72 h內(nèi)發(fā)展成臨床疾病[10，15]。臨床癥狀持續(xù)幾天到1周，通常在最低限度的支持性治療下痊愈。偶爾，臨床癥狀可以持續(xù)更長時間（如14 d）。

2.5 分子流行病學(xué)

ECoV的分子流行病學(xué)研究尚處于空白狀態(tài)。冠狀病毒變異可以影響其復(fù)制能力和病毒載量。FCoV有兩種基因型：溫和基因型為貓腸道冠狀病毒（feline enteric coronavirus，F(xiàn)ECV），在腸細(xì)胞中的復(fù)制能力較低；強(qiáng)毒基因型為貓傳染性腹膜炎病 毒（feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV），在不同細(xì)胞系中的復(fù)制能力較強(qiáng)[18-19]。纖突基因上的單位點突變可導(dǎo)致細(xì)胞親嗜性、復(fù)制能力和臨床表現(xiàn)的顯著變化[18]。

3 臨床診斷

3.1 臨床癥狀

ECoV以隱性感染為主，即使出現(xiàn)臨床癥狀也比較溫和，如出現(xiàn)胃腸道癥狀，而且臨床癥狀不具有特征性。

從2011年11月至2014年12月期間的16次暴發(fā)中收集了406匹馬的臨床信息，結(jié)果有122匹馬（30%）表現(xiàn)出臨床癥狀[8]，主要表現(xiàn)為厭食（98%）、嗜睡（89%）和發(fā)熱（84%）。發(fā)熱馬的直腸溫度為38.6～41.0 ℃。出現(xiàn)臨床癥狀時，25%的馬糞便呈稀軟狀到水泄?fàn)睿?8%的馬出現(xiàn)腹痛。胃腸道癥狀一般在厭食和發(fā)熱等全身癥狀后出現(xiàn)。

這些與日本2013年暴發(fā)的成年挽馬ECoV感染一致，其主要臨床體征是嗜睡、厭食和發(fā)熱，在約10% 的感染馬匹中觀察到了特定的胃腸道體征[6-7]。據(jù)報道[9-10]，3%的臨床感染馬出現(xiàn)腦病跡象，如轉(zhuǎn)圈、壓頭、共濟(jì)失調(diào)、本體感受障礙、眼球震顫、躺臥和癲癇等。因此，對疑似ECoV感染和并發(fā)腦病跡象的馬進(jìn)行血氨測定也有診斷意義。

ECoV感染后，部分馬表現(xiàn)為無癥狀感染，應(yīng)用qPCR從糞便中可檢測出ECoV[7-10]。ECoV感染暴發(fā)期間，無癥狀感染的比例為11%～83%[9]。

3.2 剖檢病變

Giannitti等[20]觀察了3匹成年馬ECoV感染后的病理學(xué)變化，主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的彌漫性壞死性腸炎、絨毛尖端上皮細(xì)胞壞死、中性粒細(xì)胞和纖維蛋白外滲進(jìn)入小腸腔（假膜形成），并出現(xiàn)隱窩壞死、微血栓和出血。在所有病例的小腸組織、胃腸道內(nèi)容物和/或糞便中，采用qPCR可檢測到冠狀病毒核酸；在所有病例的小腸上，采用免疫組織化學(xué)和/或直接熒光抗體可檢測到冠狀病毒抗原。

3.3 病理變化

ECoV感染的血液學(xué)異常表現(xiàn)為白細(xì)胞減少，即中性粒細(xì)胞減少和/ 或淋巴細(xì)胞減少。來自73例懷疑ECoV感染的臨床病例血象表明，有核細(xì)胞計數(shù)范圍為0.5～7.891 09/L（中位數(shù)為3.491 09/L，參考區(qū)間5.0～11.691 09/L）。73匹患病馬白細(xì)胞血計數(shù)顯示，白細(xì)胞減少25%，中性粒細(xì)胞減少66%，淋巴細(xì)胞減少72%。這些馬的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計數(shù)分別為0.2～5.191 09/L（中位數(shù)1.691 09/L，參考區(qū)間2.6～6.891 09/L）和0.8～3.691 09/L（中位數(shù)1.191 09/L，參考區(qū)間1.6～5.891 09/L）。僅在11%的馬匹中，總血細(xì)胞計數(shù)（complete blood count，CBC）和分型白細(xì)胞計數(shù)變化都不顯著[9]。

3.4 鑒別診斷

馬的胃腸道疾病可能有多方面原因?qū)е拢扔胁≡⑸锔腥?，也有非炎性疾?。ǚ晴摅w抗炎藥中毒）引起。馬的胃腸道致病性微生物包括病毒（ECoV、馬輪狀病毒）、細(xì)菌（產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌、毛狀梭菌、沙門氏菌、馬紅球菌、胞內(nèi)勞森菌）、寄生蟲（隱孢子蟲、大圓形線蟲、小圓形線蟲）、立克次體等。飼料改變、腸道菌群或環(huán)境改變以及中毒等因素引起腸內(nèi)正常生理過程的破壞，也可能導(dǎo)致腹瀉。

由于ECoV感染引起的臨床癥狀不是特征性的，因此確診需要通過PCR、免疫組化和/或電鏡檢測糞便、腸內(nèi)容物、腸組織中的ECoV核酸或抗原。

4 實驗室診斷

ECoV實驗室診斷主要包括血液學(xué)檢測和糞便中ECoV的分子檢測。

4.1 血象檢測

ECoV感染的血象檢測表現(xiàn)為白細(xì)胞減少，如中性粒細(xì)胞減少和/或淋巴細(xì)胞減少。

4.2 血清學(xué)檢測

目前尚無可靠的ECoV血清學(xué)檢測技術(shù)。Guy等[1]、仇鈺等[4]、Davis[24]建立了檢測ECoV抗體的ELISA，但沒有商品化ELISA檢測試劑盒。

4.3 病毒分離鑒定

活動物可采集胃腸道內(nèi)容物和/或糞便，死亡動物可采集小腸組織、胃腸道內(nèi)容物和/或糞便。利用人直腸腺癌細(xì)胞分離ECoV，盡管很困難，但也有報道[1]。病毒分離鑒定繁瑣耗時，使得ECoV感染的診斷局限于生物樣品中的病毒抗原或特異性核酸的直接檢測。

最初一般使用負(fù)染電鏡（EM）和抗原捕獲ELISA來檢測糞便中的冠狀病毒[1，24]，后來用免疫化學(xué)和直接熒光抗體試驗來檢測小腸組織ECoV抗原[20]，現(xiàn)在多用qPCR方法來檢測病毒核酸。

4.4 分子生物學(xué)技術(shù)

Tsunemitsu等[25]、姜焱等[26]建立了ECoV的RT-PCR檢測方法，Pusterla等[9]、Fielding等[10]、Nemoto等[15]建立了qPCR方法，但目前沒有商品化PCR檢測試劑盒。Pusterla等[9]評估了qPCR的總體準(zhǔn)確性。在不同的暴發(fā)馬群中，確定ECoV臨床狀態(tài)與qPCR檢測之間具有90%準(zhǔn)確性；在疾病早期階段，幾例ECoV感染呈qPCR陰性，但在24～48 h復(fù)查時，糞便樣本呈現(xiàn)qPCR陽性。

實驗感染馬匹糞便中的ECoV病毒動力學(xué)表明，馬在感染后3 d或4 d開始在糞便排出ECoV RNA，排毒時間持續(xù)到感染后12 d或14 d[15]。排毒高峰一般在出現(xiàn)臨床癥狀3～4 d后。在自然感染的馬中，qPCR檢測到ECoV的時間可以持續(xù)3～25 d[9-10]。

5 預(yù)防與控制

5.1 疫苗

目前尚無ECoV疫苗可供使用。動物冠狀病毒疫苗已應(yīng)用于牛的免疫，如使用減毒BCoV疫苗來預(yù)防牛冬季痢疾[27]。實驗性感染BCoV后，康復(fù)牛保持長期的特異性血清抗體（IgA和IgG）和局部抗體（IgA）[28]。盡管BCoV與ECoV密切相關(guān)，但由于缺乏安全性和有效性數(shù)據(jù)以及零星發(fā)病狀況，目前不推薦使用BCoV疫苗預(yù)防ECoV。

5.2 抗病毒藥物

目前尚無抗ECoV的特性藥物可供使用。大多數(shù)具有ECoV感染臨床癥狀的成年馬在幾天內(nèi)可自發(fā)康復(fù)，而無需特殊治療。體溫持續(xù)升高、厭食和沉郁的馬，如果電解質(zhì)正常，通常使用非甾體抗炎藥物，如氟尼辛·梅洛明、苯基丁酮?；加懈雇?、持續(xù)沉郁和厭食和/或腹瀉的馬，可補(bǔ)充電解質(zhì)。此外，在馬繼發(fā)性內(nèi)毒素血癥和/或敗血癥時，應(yīng)考慮使用抗菌藥物和胃腸道保護(hù)劑。雖然高氨血癥相關(guān)腦病只發(fā)生在很少部分ECoV感染馬，但早發(fā)現(xiàn)和早治療往往可以得到積極的效果。疑似或已有高氨血癥的馬，可使用口服用乳果糖、硫酸新霉素或糞便移植（faecal transfaunation）等進(jìn)行治療。

5.3 其他措施

對于ECoV感染與傳播的控制，沒有特殊的防控措施，只需要實施基本的生物安全措施，減少ECoV傳入馬所在場所的概率。對新引進(jìn)的馬應(yīng)隔離至少3周。根據(jù)具體情況，在外表演或比賽而返回的馬匹也應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)時間的隔離。馬車和拖車在使用前后應(yīng)徹底清潔和消毒。在加強(qiáng)馬所在場所（存養(yǎng)設(shè)施、表演場地或獸醫(yī)院）防控措施時，應(yīng)使用消毒腳墊和個人防護(hù)設(shè)施，及時清理糞便，定期對馬存養(yǎng)或活動場地進(jìn)行清潔和消毒。馬出現(xiàn)腸胃癥狀（腹痛、腹瀉），或全身癥狀，如發(fā)燒（38.5 ℃）、厭食和嗜睡，或通過qPCR確認(rèn)ECoV感染，應(yīng)嚴(yán)格隔離；同群的其他馬或與之密切接觸的馬在其他設(shè)施隔離，每天臨床檢查，并兩次測量體溫。馬僮和其他人員應(yīng)先照護(hù)健康動物，最后照護(hù)感染或疑似感染動物，并對馬靴、馬釘和手進(jìn)行清潔和消毒。感染賽馬的訓(xùn)練時間應(yīng)與健康馬錯開，訓(xùn)練時騎手應(yīng)穿戴防護(hù)服。