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    豬源肺炎克雷伯氏菌耐藥性及毒力基因分析

    2021-06-05 11:48:26歐冠標(biāo)周雨晴陸澤寧廖玉英馬東鑫袁敬知王曉曄
    中國動(dòng)物檢疫 2021年6期
    關(guān)鍵詞:毒力耐藥性抗生素

    歐冠標(biāo),周雨晴,彭 昊,陸澤寧,廖玉英,馬東鑫,袁敬知,葛 強(qiáng),李 珣,王曉曄

    (1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530004;2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530000;3.南寧市武鳴區(qū)雙橋鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站,廣西南寧 530104)

    肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)是一種重要的條件性致病菌,常寄生于人和動(dòng)物的腸道和呼吸道內(nèi),可引起肺炎、腦膜炎、腹膜炎、泌尿系統(tǒng)感染、子宮炎、乳房炎及其他化膿性炎癥,甚至敗血癥[1-2]。目前已從馬、牛、豬、雞、鷓鴣、鴨和魚等多種動(dòng)物體內(nèi)分離到Kp[3-7]。各年齡階段的人均可被Kp感染,免疫缺陷者不但易感且易發(fā)敗血癥。Kp廣泛存在于自然界的土、水、谷類中?;颊吆突疾?dòng)物是其主要傳染源,主要通過呼吸道傳播。畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中,家禽及其產(chǎn)品如蛋、肉用雞及它們所處的環(huán)境,可能是人感染Kp的傳染源。普通公眾感染主要是自身帶菌所致的內(nèi)源性感染,少部分是外源性感染,如醫(yī)療器械、靜脈注射等的侵入性診療措施和醫(yī)務(wù)人員帶菌傳播。人食物中毒主要通過被Kp污染的食物。

    目前,我國對(duì)Kp的研究大多在人醫(yī)方面,而對(duì)豬源Kp的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)對(duì)從廣東省佛山市一家屠宰場采集的125份肛拭子和50份豬肉樣品,通過細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)、耐藥基因及毒力基因檢測,探究屠宰前后豬源Kp的分布及相關(guān)菌株的生物學(xué)特性和耐藥性,以期為防控該菌引起的養(yǎng)殖場生豬感染、抗生素耐藥性及保障豬肉品質(zhì),強(qiáng)化屠宰加工過程中的公共衛(wèi)生管理提供技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1肛棉拭子 分3批采集自佛山市某屠宰場存欄待宰生豬。采用消毒棉拭子插入生豬肛門采取糞便,置入裝有少量滅菌生理鹽水的試管內(nèi),并對(duì)每管標(biāo)記編號(hào),4 ℃保存,共125份。樣品對(duì)應(yīng)生豬分別來自9個(gè)省份,其中福建12份、廣東38份、湖南25份、江西28份、吉林8份、遼寧4份、陜西6份、山西2份、黑龍江2份。

    1.1.2豬肉樣品 采集自該屠宰場屠宰后流水線上的生豬胴體。用滅菌剪子剪取約1 cm×1 cm的肉粒一塊,每份肉樣裝入滅菌離心管內(nèi),-20 ℃存儲(chǔ),共50份。樣品對(duì)應(yīng)生豬來自6個(gè)省份,其中福建8份、江西8份、黑龍江5份、廣東12份、遼寧6份、湖南11份。上述肛棉拭子和豬肉采樣后做好記錄,包括日期、編號(hào)、產(chǎn)地等,然后將樣品冷凍保存送往廣西大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測分析。

    1.1.3主要試劑 麥康凱(MAC)培養(yǎng)基、Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基,均購自O(shè)xoid公司;藥敏試驗(yàn)抗菌素藥粉,購自北京索萊寶科技有限公司;DL 2 000 DNA Marker、2×RapidTaqMaster Mix聚合酶,購自南京諾唯贊生物科技有限公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒,購自天根生化科技有限公司;革蘭氏染色液,購自北京索萊寶科技有限公司;試驗(yàn)所用引物,由北京六合華大基因科技有限公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1細(xì)菌分離培養(yǎng) 將采集的樣品解凍后,于無菌環(huán)境下用接種環(huán)蘸取管內(nèi)液體,劃線接種于MAC培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12~16 h;挑取大小一致、粉紅色黏液性的單個(gè)疑似菌落接種于MAC培養(yǎng)基進(jìn)行純化,37 ℃培養(yǎng)12 h;挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢觀察;最后接種單個(gè)菌落于3 mL LB培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng)。

    1.2.216S rRNA及體外溶血酵素基因(khe)擴(kuò)增鑒定

    1.2.2.116S rRNA細(xì)菌分離純化后提取基因組DNA,以基因組DNA為模板,用16S rRNA基因序列通用引物(上游引物:5'-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3';下游引物:5'-GTTGGCGGACGGGTGAGTAA-3')進(jìn) 行PCR擴(kuò)增。預(yù)期擴(kuò)增片段長度約1 500 bp,引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25.0 μL:上、下游引物各1.0 μL,2×TaqMaster Mix 12.5 μL,DNA模板2.0 μL,最后ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30個(gè) 循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳,驗(yàn)證擴(kuò)增條帶。將目的條帶切膠回收后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將分離株16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

    1.2.2.2khe基因khe基因僅存在于Kp,可作為鑒定的特異性靶標(biāo)[8]。根據(jù)GenBank中khe基因序列(登錄號(hào):CP035202.1)設(shè)計(jì)特異性引物(khe-F:5'-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3';khe-R:5'-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增,預(yù)期擴(kuò)增片段長度為489 bp,引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系與16S rRNA擴(kuò)增體系相同。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    1.2.3毒力基因擴(kuò)增 以細(xì)菌基因組DNA為模板,對(duì)fimH、kfu、aereobactin、wabG、uge等5種毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物信息見表1)和凝膠電泳分析,比較不同來源菌株毒力基因分布。

    表1 毒力基因引物序列信息

    1.2.4耐藥基因擴(kuò)增 以細(xì)菌基因組DNA為模板,對(duì)氨基糖苷類耐藥基因aadA1、aadB,β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaOXA,喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、aac(6')-Ib-cr,四環(huán)素類耐藥基因tet(A),酰胺醇類耐藥基因floR以及硫酸粘桿菌素耐藥基因mcr-1等進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物詳情見表2)和凝膠電泳分析,比較不同來源菌株耐藥基因分布。

    表2 耐藥基因引物序列信息

    1.2.5藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)文件(M100-S21)推薦的微量肉湯稀釋法,對(duì)分離得到的Kp采用9類12種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn),藥物均購自O(shè)xoid公司。12種藥物分別是,慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、美羅培南(MEM)、阿莫西林/克拉維酸鉀(AMC)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢西?。‵OX)、環(huán)丙沙星(CIP)、氯霉素(CHL)、硫酸粘桿菌素(COL)、四環(huán)素(TET)、磷霉素(FOS)。根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)判斷其耐藥性。同時(shí),比較分析不同地區(qū)Kp耐藥情況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細(xì)菌形態(tài)觀察

    分離純化后,在MAC瓊脂平板上呈現(xiàn)粉紅色、中央凸起、表面光滑、大小一致的黏液狀菌落(圖1-A);用接種環(huán)蘸取菌落,隨后向上提起,部分菌落拉動(dòng)成絲;挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢觀察可見單個(gè)、成雙或鏈狀排列的短粗狀革蘭氏陰性菌(圖1-B)。

    圖1 MAC瓊脂平板上的紅色菌落及革蘭氏染色鏡檢結(jié)果(100×)

    2.2 16S rRNA擴(kuò)增

    PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳,部分產(chǎn)物擴(kuò)增出大小約1 540 bp的片段(圖2),與預(yù)期目的片段大小相同。取16S rRNA PCR產(chǎn)物測序分析,將此基因序列與NCBI GenBank中已有序列進(jìn)行BLAST比對(duì),發(fā)現(xiàn)同源性在99%以上。

    圖2 分離菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增電泳圖

    2.3 khe 基因擴(kuò)增

    部分菌株khe基因擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由圖3可知,擴(kuò)增條帶約489 bp,與預(yù)期目的條帶大小一致。

    圖3 khe 基因擴(kuò)增電泳結(jié)果

    2.4 各地區(qū)樣品檢測情況

    經(jīng)16S rRNA、khe基因擴(kuò)增,從125份肛棉拭子樣品、50份宰后生豬肉類樣品中各分離得到32、4株Kp。按采樣日期順序命名為GDKP-1~36(GDKP-1~32分離自肛棉拭子樣品,GDKP-33~36分離自豬肉樣品)。

    由表3可知,在肛棉拭子樣品中,共檢測出32株Kp,涵蓋7個(gè)省份,分別為福建(4株,GDKP-6/GDKP-7/GDKP-30/GDKP-31)、廣東(8株,GDKP-4/GDKP-5/GDKP-8/GDKP-9/GDKP-14/GDKP-21/GDKP-2 2/G D K P-2 3)、湖南(6株,GDKP-2/GDKP-3/GDKP-11/GDKP-12/GDKP-13/GDKP-20)、江 西(9株,GDKP-1/GDKP-10/GDKP-15/GDKP-18/GDKP-19/GDKP-24/GDKP-25/GDKP-26/GDKP-32)、吉 林(2株,GDKP-16/GDKP-17)、遼寧(1株,GDKP-29)、陜西(2株,GDKP27/GDKP-28);豬肉樣品中,有3個(gè)省份檢出4株Kp,分別為江西2株(GDKP-33/GDKP-34)、黑龍江1株(GDKP-35)、福建1株(GDKP-36)。

    表3 各地區(qū)樣品檢測情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    2.5 耐藥基因以及毒力基因擴(kuò)增與分析

    從耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果(表4)來看,36株Kp含耐藥基因比例從大到小依次為tet(A)(83.3%)、floR(63.9%)、mcr-1(27.8%)、aadA1(11.1%)、blaTEM、blaOXA和qnrB(均為8.3%)、aac(6')-Ib-cr(5.6%)、blaCTX-M-1(2.8%),其他耐藥基因無檢出;從毒力基因檢測結(jié)果(表4)來看,比例從大到小依次為wabG(72.2%)、fimH和uge(均為69.4%)、kfu(63.9%)、aereobactin(19.4%)。耐藥基因中,同時(shí)攜帶floR+tet(A)的菌株最多,達(dá)23株(占63.9%);毒力基因中,同時(shí)攜帶kfu+fimH+uge+wabG的菌株最多,達(dá)20株(占55.6%)。詳細(xì)基因型分布見表4和圖4。

    表4 不同地區(qū)肺炎克雷伯氏菌株耐藥基因和毒力基因分布

    圖4 36株肺炎克雷伯氏菌耐藥基因和毒力基因分布

    2.6 藥敏試驗(yàn)

    2.6.1耐藥性分析 對(duì)分離到的36株Kp進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果見表5。由表5可知,36株Kp對(duì)各種抗生素的耐藥率介于0~83.3%。其中對(duì)TET耐藥率最高,為83.3%;對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率依次是CHL(63.9%)>COL(27.8%)>GEN(11.1%)>FOX/CIP(8.3%)>AMC(5.6%)>CTX(2.8%)。分離株對(duì)AMK、MEM、FEP、FOS的耐藥率均為0,敏感性相當(dāng)高。從抗生素大類來看,耐藥率依次是四環(huán)素類(83.3%)>酰胺醇類(63.9%)>多肽類(27.8%)>喹諾酮類(8.3%)>氨基糖苷類(0~11.1%)>β-內(nèi)酰胺類(0~8.3%)>碳青霉烯類和其他(0)。

    表5 分離株耐藥數(shù)據(jù)分析結(jié)果

    2.6.2耐藥性區(qū)域分布 不同地區(qū)Kp耐藥性結(jié)果(表6)顯 示:36株Kp中有6株耐受4種抗生素,耐藥譜和菌株來源分別為GDKP-6/GDKP-7(FOX+CHL+COL+TET)來源于福建,GDKP-9(AMC+CIP+CHL+TET)和GDKP-23(AMC+FOX+CHL+TET)來源于廣東,GDKP-11(GEN+CIP+CHL+TET)和GDKP-13(CTX+CIP+CHL+TET)來源于湖南;有6株耐受3種抗生素,耐藥譜和菌株來源分別為GDKP-8(GEN+CHL+TET)來 源于廣東,GDKP-24(GEN+CHL+TET)和GDKP-18/GDKP-19/GDKP-26(CHL+COL+TET)來源于江西,GDKP-29(CHL+COL+TET)來源于遼寧;有13株耐受2種抗生素,耐藥譜和菌株來源分別為CHL+TET(江西5株:GDKP-1/GDKP-10/GDKP-15/GDKP-25/GDKP-33;湖南2株:GDKP-2/GDKP-3;廣東2株:GDKP-4/GDKP-22;福建1株:GDKP-31;黑龍江1株:GDKP-35)、GEN+TET(陜西1株:GDKP-28)、COL+TET(江西1株:GDKP-32);有8株耐受1種抗生素,耐藥譜和來源分別為TET(廣東2株:GDKP-5/GDKP-21;陜西1株:GDKP-27;福建1株:GDKP-30;江西1株:GDKP-34)、COL(廣東1株:GDKP-14;湖南1株:GDKP-20;福建1株:GDKP-36);有3株不耐受藥物,分別為湖南1株(GDKP-12)、吉林2株(GDKP-16/GDKP-17)。

    表6 不同地區(qū)Kp耐藥情況分布 單位:株

    3 討論

    Kp是醫(yī)院獲得性感染及社區(qū)獲得性感染中常見的條件致病菌,在由革蘭氏陰性菌引起的血流感染中,其分離率僅次于大腸埃希菌[21]。近年來,Kp已成為最重要的條件致病菌之一,并且耐藥性逐漸增強(qiáng)[22]。長期以來,人醫(yī)臨床領(lǐng)域?qū)υ摼叨戎匾?,但是?dòng)物源Kp并未受到廣泛關(guān)注,關(guān)于豬源Kp的報(bào)道較少。本試驗(yàn)從某屠宰場待宰生豬125份肛拭子樣品和50份宰后豬肉樣品中共分離得到36株Kp,檢出率為20.57%(36/175),檢出率較高。杜琳等[23]對(duì)我國部分地區(qū)奶牛乳房炎進(jìn)行分離鑒定,從497份樣本中分離得到46株Kp,分離率為9.26%;張聰?shù)萚24]對(duì)南寧市伴侶動(dòng)物源Kp檢測結(jié)果顯示,犬、貓的分離率分別為5.26%(3/57)、2.44%(1/41)。楊帆等[25]對(duì)醫(yī)源與動(dòng)物源Kp耐藥性分析發(fā)現(xiàn):醫(yī)源菌株耐藥率顯著高于動(dòng)物源菌株;在動(dòng)物源菌株中,雞源和豬源菌株耐藥率高于兔源和犬源菌株;除犬源菌株外均表現(xiàn)多重耐藥。綜上,不同動(dòng)物源Kp檢出率以豬較高,這可能與我國生豬養(yǎng)殖規(guī)模大、數(shù)量多,生產(chǎn)過程常使用抗生素來促進(jìn)生長和預(yù)防疾病有關(guān),而牛和犬接觸抗生素的概率相對(duì)較少,所以牛源、犬源菌株耐藥率較低。

    藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,36株Kp對(duì)AMK、MEM、FEP和FOS耐藥率均為0,表明分離菌株對(duì)這4種藥物非常敏感。分離菌株對(duì)TET、CHL耐藥率(分別為83.3%和63.9%)較高,對(duì)頭孢菌素類、青霉素類、氨基糖苷類和喹諾酮類等受試藥物耐藥性并不嚴(yán)重,導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與養(yǎng)殖期間生豬用藥狀態(tài)有關(guān)。在使用抗生素時(shí),一些新合成的、價(jià)格昂貴的藥物,很少在動(dòng)物中使用,故對(duì)其產(chǎn)生的耐藥性較低,如MEM、FEP、FOS等藥物在動(dòng)物中使用可能較少。

    多黏菌素被認(rèn)為是治療耐碳青霉烯Kp感染聯(lián)合抗菌療法的主要抗生素。一些菌株通過脂多糖修飾多黏菌素耐藥性,并且這些耐多黏菌素分離株的分離頻率逐漸增加[26]。耐藥基因檢測結(jié)果顯示,硫酸粘桿菌素耐藥基因mcr-1檢出率為27.8%(10/36),與張聰?shù)萚24]報(bào)道的mcr-1檢出率呈上升趨勢結(jié)論一致。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extendedspectrum β-lactamase,ESBL)是目前已知的細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制[26],本試驗(yàn)中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaCTX-M-1、blaOXA檢出率分別為8.3%、2.8%、8.3%,與細(xì)菌耐藥表型一致。

    毒力基因檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),參與脂多糖合成的毒力因子wabG攜帶率(72.2%)最高,其次另一個(gè)與脂多糖合成相關(guān)的毒力基因uge攜帶率(69.4%)也超過60%,表明分離菌株攜帶脂多糖相關(guān)毒力因子概率較高。脂多糖通過補(bǔ)體介導(dǎo)所形成的連鎖反應(yīng),在菌體表面聚集成復(fù)合物,從而介導(dǎo)細(xì)菌逃避或抵抗宿主天然免疫的殺傷[9]。黏附素是細(xì)菌傳播定殖的關(guān)鍵因素,檢測結(jié)果顯示黏附素相關(guān)毒力因子fimH和kfu攜帶率(分別為69.4%和63.9%)均超過60%,并且4株來源于宰后豬肉的分離株均攜帶fimH和kfu,表明攜帶黏附素毒力因子更易造成細(xì)菌傳播。

    有研究[27]顯示,不合理使用抗生素會(huì)促進(jìn)耐藥基因傳播。雖然屠宰場能有效降低出場豬肉細(xì)菌攜帶率,但不能完全阻斷耐藥基因傳播。因此,科學(xué)選擇抗生素,交替使用不同類型抗菌藥物,避免耐藥性產(chǎn)生對(duì)于阻止細(xì)菌耐藥性擴(kuò)散極為重要。此外,屠宰場應(yīng)加強(qiáng)屠宰加工環(huán)節(jié)管理,嚴(yán)格執(zhí)行加工過程中各項(xiàng)規(guī)章制度并規(guī)范操作,提高工作人員自身素質(zhì)和安全衛(wèi)生意識(shí),降低細(xì)菌交叉污染的可能性,確保豬肉品質(zhì)安全以降低細(xì)菌病發(fā)生,從而減少經(jīng)濟(jì)損失。

    本研究共分離到36株Kp,分離菌株對(duì)頭孢菌素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類和喹諾酮類等受試藥物表現(xiàn)敏感,而對(duì)四環(huán)素類、酰氨醇類和多肽類等藥物耐藥性較高,尤其以TET和CHL較為嚴(yán)重。共檢測出9種耐藥基因:tet(A)、floR、mcr-1、aadA1、blaTEM、blaCTX-M-1、blaOXA、qnrB和aac(6')-Ib-cr;檢測出5種毒力基因:wabG、fimH、uge、kfu和aereobactin。本研究表明,應(yīng)交替使用不同類型抗菌藥物,最大程度避免細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。同時(shí),屠宰場應(yīng)加強(qiáng)管理,提高安全衛(wèi)生意識(shí),降低細(xì)菌交叉污染,保障豬肉品質(zhì)衛(wèi)生。

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