健康女性與子宮內(nèi)膜異位癥患者腸道菌群微生物組學(xué)研究

韋雅婧 梁炎春 楊如玉 雷舜天 王澤海 牛剛

1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州510080）；2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院（廣州510089）

子宮內(nèi)膜異位癥（簡(jiǎn)稱“內(nèi)異癥”）是一種慢性炎癥性疾病，免疫失衡是異位病灶微環(huán)境最重要的特征之一［1-3］，可導(dǎo)致患者疼痛和不孕的發(fā)生和加?。?］。發(fā)生深部浸潤(rùn)型子宮內(nèi)膜異位癥（deep infiltrating endometriosis，DIE）時(shí)，則會(huì)引起腹瀉或腸道運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀［5］。腸道菌群失調(diào)與多種炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［6］。已有研究［7-10］證實(shí)內(nèi)異癥患者或動(dòng)物模型的宮頸、陰道和腸道存在菌群失調(diào)，但較少研究探究卵巢內(nèi)異癥和DIE 患者的腸道菌群是否存在區(qū)別。本研究擬通過(guò)對(duì)健康女性、卵巢內(nèi)異癥患者及DIE 患者的糞便進(jìn)行測(cè)序、結(jié)果分析及功能預(yù)測(cè)，為下一步探究菌群失調(diào)在內(nèi)異癥發(fā)展的作用提供證據(jù)和研究方向。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本收集經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，期間所有樣本均按倫理標(biāo)準(zhǔn)處理。經(jīng)影像學(xué)檢查和（或）組織學(xué)診斷后，將患有卵巢內(nèi)異癥的患者納入OE 組（n=14），DIE的患者納入DIE 組（n= 12），健康女性納入Control組（n=10）。內(nèi)異癥患者糞便樣本于術(shù)前收集，健康女性的糞便在月經(jīng)結(jié)束后7 d內(nèi)收集。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）18 ～45歲未絕經(jīng)女性；（2）BMI：18.5 ～24 kg/m2；（3）無(wú)腸道疾病家族史；（4）近3 個(gè)月無(wú)抗生素使用史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期婦女；（2）急性或慢性胃腸道疾病或盆腔炎。

1.2 研究方法提取糞便DNA 后對(duì)V3?V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，純化擴(kuò)增片段并構(gòu)建PE2*300 文庫(kù)。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、聚類及物種分類學(xué)注釋。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用R 語(yǔ)言進(jìn)行α多樣性分析（Student′t檢驗(yàn)）、主坐標(biāo)分析（PCoA）、群落組成分析、物種差異分析（Kruskal?Wallis 秩和檢驗(yàn)，F(xiàn)DR校正）。使用PICRUSt 軟件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料OE 組、DIE 組和Control 組的年齡和BMI 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示以上研究組的資料具有可比性。

2.2 物種組成分析Firmicutes、Bacteroidete、Pro?teobacteria 和Actinobacteria 是各組主要組成物種。OE 組以及DIE 組相對(duì)豐度＜1%的菌群（歸為oth?ers）比例增多（圖1），其中Desulfobacterota、Verru?comicrobiata在兩組中均增多。Synergistota在DIE組更高。Fusobacteriota 在OE 組更高（圖2）。

圖1 各組物種組成（門(mén)水平）Fig.1 Microbiome composition among three groups（Phylum）

2.3 多樣性比較常用Shannon、Simpson、Chao 和Ace 指數(shù)來(lái)表示α多樣性。4 個(gè)指數(shù)在OE 組和DIE組均高于Control 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。

PCoA 結(jié)果可用來(lái)反映β多樣性。各組樣本點(diǎn)的距離相近，表示組間的β多樣性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖2 群落Heatmap 圖（門(mén)水平）Fig.2 Heatmap of community in phylum level

圖3 組間微生物群落α多樣性的比較Fig.3 Comparison of α diversity among three groups

2.4 組間物種差異分析門(mén)水平，F(xiàn)irmicutes在DIE組較多；Bacteroidete在Control組最多；Proteobacteria和Actinobacteria 在OE 組最多，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綱水平，Negativicutes 在OE 組最低。屬水平，OE 組 和DIE 組 的Fusicatenibacter顯 著 減 少，NK4A214_group顯著增多。種水平，OE 組和DIE 組的Fusicatenibacter顯著減少；Eubacterium_coprosta?noligenes_group顯著增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

2.5 功能預(yù)測(cè)分析代謝通路預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新陳代謝功能的相對(duì)豐度最高（圖6）。糖代謝和氨基酸代謝的相對(duì)豐度在OE 組最高（表1）。氨基酸的嘌呤代謝相對(duì)豐度最高，嘧啶代謝次之（表2）。在代謝通路水平3，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在OE組豐度最高（表2），與COG 樣本豐度統(tǒng)計(jì)的結(jié)果一致（圖7）。

圖4 組間PCoA 矩陣分析Fig.4 PCoA analysis among three groups

3 討論

對(duì)卵巢內(nèi)異癥患者、DIE 患者和健康女性的糞便測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，OE 組和DIE 組的Negativicutes 和Fusicatenibacter顯著降低，NK4A214_group和Eubac?terium_coprostanoligenes_group顯著增高。氨基酸代謝和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能可能在卵巢內(nèi)異癥的發(fā)展中發(fā)揮著作用。

3.1 子宮內(nèi)膜異位癥與免疫失衡免疫失衡導(dǎo)致異位病灶局部微環(huán)境的改變是內(nèi)異癥疼痛和不孕的重要原因，也是其發(fā)展的關(guān)鍵因素［11-13］。免疫失衡可通過(guò)信號(hào)通路影響病灶新生血管和神經(jīng)的生成，促進(jìn)異位病灶的發(fā)展［14-15］。抑制相關(guān)通路可減少病灶炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)程度，減輕動(dòng)物模型的慢性機(jī)械疼痛［16］。

圖5 菌群組間差異分析Fig.5 Differences of microbiome among three groups

圖6 通路水平1 各功能相對(duì)豐度分析Fig.6 Relative abundance of various functions in Pathway level 1

表1 代謝通路水平2Tab.1 Pathway level 2 of metabolism

3.2 腸道菌群與子宮內(nèi)膜異位癥腸道菌群可提供屏障功能、預(yù)防病原體感染及調(diào)節(jié)免疫等作用，與人類健康狀態(tài)或疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［17-18］。已有研究表明內(nèi)異癥患者及動(dòng)物模型存在菌群失調(diào)。Ⅲ/Ⅳ期內(nèi)異癥患者宮頸的加德納菌屬、腸道埃希菌屬和志賀菌屬增多［10］?；加袃?nèi)異癥的恒河猴腸道乳酸桿菌數(shù)量減少，革蘭陰性菌顯著增加［9］。內(nèi)異癥小鼠腸道菌群放線菌門(mén)、厚壁桿菌門(mén)的豐度增加；“厚壁桿菌/擬桿菌”的比值（被認(rèn)為是菌群失調(diào)的特征）約為對(duì)照組的2 倍［7］。用擬桿菌敏感的甲硝唑處理后的異位病灶，其體積和重量下降，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少［8］。然而，這些證據(jù)僅分析了內(nèi)異癥與健康對(duì)照組菌群的差異，暫無(wú)不同類型內(nèi)異癥的腸道菌群的比較。卵巢內(nèi)異癥是內(nèi)異癥最常見(jiàn)的一種類型，可不伴有癥狀［19］。DIE 是內(nèi)異癥中最復(fù)雜和嚴(yán)重的一種病理類型，常伴嚴(yán)重痛經(jīng)和（或）周期性腸道癥狀［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，OE 組及DIE 組中豐度顯著增高的菌群多為革蘭陰性菌。革蘭氏陰性菌外膜的脂多糖通常能抵抗并清除病原菌。然而，脂多糖也可引起組織損傷，刺激炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)熱、多器官衰竭和死亡［21-23］。OE 組和DIE 組革蘭陰性菌的異常增高可能通過(guò)脂多糖影響異位病灶的免疫微環(huán)境，進(jìn)而疾病的發(fā)展及相關(guān)癥狀的發(fā)生。

表2 代謝通路水平3Tab.2 Pathway level 3 of metabolism

圖7 COG 樣品豐度統(tǒng)計(jì)圖Fig.7 Relative abundance of COG samples

綜上所述，卵巢內(nèi)異癥患者、深部浸潤(rùn)型內(nèi)異癥患者和健康女性的腸道菌群存在不同程度的差異，這可能與內(nèi)異癥的發(fā)展及癥狀的發(fā)生密切相關(guān)。腸道菌群失調(diào)如何介導(dǎo)的免疫失衡參與內(nèi)異癥的發(fā)展，是后續(xù)的重點(diǎn)研究方向。