反復(fù)凍融過程中開背調(diào)味魚品質(zhì) 及蛋白特性的變化

吳晨燕，楊 梅，王珂莉，劉鑫潔，劉思佳，馬儷珍,*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，國家大宗淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（天津），天津 300384；2.天津市強(qiáng)源食品有限公司，天津 301700）

水產(chǎn)品保鮮包括冰藏保鮮、冷海水保鮮、微凍保鮮[1]、 凍結(jié)保鮮[2]、超冷保鮮、氣調(diào)保鮮、化學(xué)保鮮等方式。其中，冷凍保鮮不僅能延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期，且經(jīng)濟(jì)成本較低，是一種比較常見的保鮮方式。冷凍保鮮通過將魚體的水分凍結(jié)成冰，使其體內(nèi)的生化反應(yīng)和微生物活動(dòng)基本處于停滯狀態(tài)[3-4]，從而達(dá)到延長(zhǎng)魚肉貨架期的目的[5-6]。 隨著冷鏈物流業(yè)的發(fā)展，冷凍品在-18 ℃環(huán)境下由生產(chǎn)地配送至全國各地也成為可能，但根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況，冷凍水產(chǎn)品從廠家?guī)旆垦b載至物流車、物流車運(yùn)輸、從物流車卸貨至目的地倉庫房、消費(fèi)者購買產(chǎn)品帶回家這一系列過程中都伴隨著因溫度波動(dòng)而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降的情況。魚肉在經(jīng)歷冷凍-解凍循環(huán)過程中，其蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的變性。研究發(fā)現(xiàn)，隨著冷凍-解凍循環(huán)次數(shù)的增加，斑節(jié)對(duì)蝦和南美白對(duì)蝦[7]、尖吻鱸 魚肉[8]、脆肉鯇魚肉[9]等都存在感官品質(zhì)和風(fēng)味下降、蛋白和脂肪氧化、組織結(jié)構(gòu)和功能特性變化等現(xiàn)象。

隨著市場(chǎng)上調(diào)理食品的興起，調(diào)味魚產(chǎn)品也越來越受到消費(fèi)者的喜愛，因調(diào)味魚產(chǎn)品的保鮮方式以冷凍保鮮更為常見，調(diào)味后的魚肉產(chǎn)品在配送轉(zhuǎn)運(yùn)過程中也伴隨著反復(fù)凍融過程，關(guān)于此過程產(chǎn)品品質(zhì)變化的研究尚不深入。本實(shí)驗(yàn)以調(diào)味開背斑點(diǎn)叉尾鮰為研究對(duì)象，將其速凍后在-18 ℃下凍藏，通過超高壓（ultra high pressure，UHP）和滾揉（tumbling，TB）兩種腌制方式制得開背調(diào)味魚產(chǎn)品，測(cè)定調(diào)味魚肉在5 次凍融循環(huán)過程中菌落總數(shù)、硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reaction substances，TBARS）、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量及肌原纖維蛋白（myofibril protein，MP）相關(guān)指標(biāo)，并通過掃描電子顯微鏡、紫外分光光度計(jì)、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀對(duì)MP的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以探究在凍藏過程中反復(fù)凍融循環(huán)次數(shù)對(duì)調(diào)味魚品質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能特性的影響，為開背調(diào)味魚新產(chǎn)品投入市場(chǎng)提供一定的數(shù)據(jù)支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑點(diǎn)叉尾鮰、香辛料、調(diào)味料、姜、蔥、蒜購于天津市西青區(qū)紅旗農(nóng)貿(mào)水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。

一水檸檬酸（食品級(jí)） 常州百運(yùn)渡化工有限 公司；五香濃縮液 頂興（天津）食品科技發(fā)展有限 公司；硝酸銀、鹽酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP.L1-600/5超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；BVRJ-40真空滾揉機(jī) 嘉興艾博實(shí)業(yè)有限公司；FA25高速剪切分散乳化機(jī) 德國弗魯克 公司；Pro臺(tái)式掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom-Word BV公司；MinI 4電泳儀 美國Bio-Rad公司；UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Spectrum65 FTIR儀 美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 斑點(diǎn)叉尾鮰魚處理

購買鮮活斑點(diǎn)叉尾鮰魚，經(jīng)宰殺（分左右兩半胴體）、減菌化處理后，采用超高壓（UHP組）和滾揉（TB組）方式腌制魚體，將腌制好的魚體真空包裝后放入速凍機(jī)（-35 ℃）至中心溫度達(dá)-18 ℃（大約30 min），然后在-18 ℃冰箱冷凍貯藏，凍藏12 h后測(cè)定新鮮魚肉指標(biāo)，此時(shí)凍融循環(huán)次數(shù)記為0（不同處理樣品分別記為UHP0d和TB0d）?？們霾貢r(shí)間為100 d，每組樣品凍結(jié)數(shù)量為18 袋，期間每隔20 d，將全部樣品取出，置于流動(dòng)水中解凍，直至魚體中心溫度達(dá)0～4 ℃，即完成第一次凍融循環(huán)（不同處理樣品分別記為UHP20d和TB20d），此時(shí)每組樣品留下3 袋用于指標(biāo)的測(cè)定，其余樣品立即放入-18 ℃冰箱中繼續(xù)凍藏，20 d后再次將冰箱中的所有樣品從冰箱中取出，進(jìn)行相同方式的凍融循環(huán)，以此類推進(jìn)行第2、3、4、5次的凍融循環(huán)（UHP組中分別記為UHP40d、UHP60d、UHP80d和UHP100d，TB組中 分別記為TB20d、TB40d、TB60d、TB80d、TB100d）。每次凍融循環(huán)的樣品進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

超高壓腌制條件：食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)11%、超高壓壓力200 MPa、保壓時(shí)間15 min。

滾揉腌制條件：食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、滾揉方式為呼吸式、真空度0.08 MPa、滾揉時(shí)間60 min。此處呼吸式滾揉的具體步驟是：抽真空正轉(zhuǎn)5 min→靜置2.5 min→反轉(zhuǎn)5 min→靜置2.5 min→正壓正轉(zhuǎn)5 min→靜置2.5 min→正壓反轉(zhuǎn)5 min→靜置2.5 min，再一次重復(fù)以上過程。

1.3.2 菌落總數(shù)的測(cè)定

菌落總數(shù)測(cè)定參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[10]。

1.3.3 TBARS值的測(cè)定

TBARS值測(cè)定參考馬儷珍等[11]的方法。

1.3.4 TVB-N含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取5 g絞碎的肉樣，置于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，攪拌均勻，瓶口包上保鮮膜放入搖床振蕩30 min，過濾后濾液放入冷藏柜中備用。待半微量定氮蒸餾裝置加熱沸騰后，吸取5 mL濾液（以蒸餾水作為空白）加入凱氏蒸餾裝置反應(yīng)室，再立即加入5 mL 10 g/L MgO溶液，塞住塞子，加蒸餾水液封。在反應(yīng)裝置末端處用體積分?jǐn)?shù)2%的硼酸作為接收液，液面以下接收5 min，液面以上接收1 min，之后用0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，按式（1）計(jì)算TVB-N含量。

式中：V1表示樣液消耗鹽酸體積/mL；V2表示空白消耗鹽酸體積/mL；cB表示標(biāo)準(zhǔn)鹽酸濃度/（mol/L）；m表示樣品質(zhì)量/g；V4表示樣液體積/mL；V3表示樣液定容后的體積/mL；14表示氮的摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

1.3.5 電子鼻分析氣味成分

稱取10 g剪碎魚肉（精確到0.001 g），放入樣品瓶中，待上機(jī)檢測(cè)。先用空氣清洗傳感器，清洗時(shí)間為300 s，然后通過真空泵將樣品中的氣體吸入到電子鼻中，進(jìn)氣速率為0.8 L/min，檢測(cè)時(shí)間為200 s。每種魚肉樣品5 個(gè)平行，每個(gè)樣品測(cè)定一次。

1.3.6 MP相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

1.3.6.1 MP的提取

參照Xiong Youling L.等[12]的方法進(jìn)行鮰魚MP的提取，提取過程在4 ℃條件下操作。制備好的MP采用雙縮脲法測(cè)定MP的蛋白質(zhì)量濃度，并放置于4 ℃的冰箱內(nèi)備用。

1.3.6.2 總巰基含量的測(cè)定

總巰基含量的測(cè)定參考李鵬[13]的方法。在10 mL離心管中加入0.5 mL 2 mg/mL MP溶液、2.5 mL含8 mol/L 尿素的Tris-甘氨酸溶液（pH 8，每升Tris-甘氨酸溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g甘氨酸、1.2 g 乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））以及0.02 mL Ellman’s試劑，再加入20 μL 5,5’-二硫代雙 (2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）避光室溫反應(yīng)25 min，立即在412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A412nm）。利用公式（2）計(jì)算總巰基含量。

式中：1.36×104表示摩爾吸光系數(shù)/（L/（mol·cm））；ρ為雙縮脲法測(cè)得的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.6.3 二硫鍵含量的測(cè)定

二硫鍵含量的測(cè)定參照Thannhauser等[14]的方法。先取1 mol/L Na2SO310 mL，與100 mg DTNB充分混合，調(diào)節(jié)pH值至7.5，在38 ℃條件下通入氧氣直至溶液顏色從亮紅色變?yōu)榈S色，大約45 min，得到2-硝基-5-硫 代苯磺酸酯（2-nitro-5-thio- sulfobenzoate，NTSB）儲(chǔ)備液；NTSB使用液現(xiàn)配現(xiàn)用。稱取3.755 g甘氨酸、0.88 g EDTA、12.6 g Na2SO3、236.32 g硫氰酸胍，用蒸餾水溶解并定容至1000 mL，再將NTSB儲(chǔ)備液與混合溶液按體積比1∶100稀釋，調(diào)節(jié)溶液pH值至9.5，即得NTSB使用液。在0.25 mL MP溶液中加入3 mL新制備的NTSB使用液漩渦振蕩均勻。將混合溶液避光室溫下放置25 min后測(cè)定其在412 nm波長(zhǎng)處的吸光度，用摩爾吸光系數(shù)13900 L/（mol·cm）計(jì)算二硫鍵含量。

1.3.6.4 紫外光譜測(cè)定

以0.6 mol/L KCl緩沖液為空白，在230～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)建立基線，將MP用0.6 mol/L KCl溶液稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，采用UV-1800紫外分光光度計(jì)在230～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)MP溶液進(jìn)行紫外光譜掃描。使用Origin 8.5軟件計(jì)算二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜[15]。

1.3.6.5 FTIR測(cè)定

參考喻亞麗[16]的方法，將提取的MP凍干，取凍干樣品1 mg，經(jīng)KBr壓片，用Spectrum65 FTIR儀對(duì)樣品進(jìn)行紅外掃描。掃描范圍為1700～1000 cm-1。

1.3.6.6 掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

將提取的MP真空冷凍干燥成凍干粉，取少量?jī)龈煞劬鶆蛲磕ㄔ谀z墊上，鍍金處理60 s，用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。測(cè)定參數(shù)：加速電壓為10 kV，束流強(qiáng)度為能譜點(diǎn)掃，探頭模式為背散射，實(shí)時(shí)觀察參數(shù)為684×684 像素，照片存儲(chǔ)參數(shù)為1024×2048 像素，放大1000 倍。

1.3.6.7 SDS-PAGE分析

參照Laemmli等[17]的方法，在0.25 mL 2 mg/mL MP溶液中分別加入0.25 mL、體積分?jǐn)?shù)10%β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）和0.25 mL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）樣品緩沖液（含4 g/100 mL SDS、20 mL/100 mL甘油、0.125 mol/L Tris-HCl，pH 6.8），使MP質(zhì)量濃度為1 mg/mL，沸水浴中加熱3 min后置于冰中冷卻，加入50 μL溴酚藍(lán)，以10000×g離心3 min。吸取上清液20 μL進(jìn)行點(diǎn)樣，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。樣品在濃縮膠中電流為20 mA，進(jìn)入分離膠后，電流改為40 mA。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，利用Excel軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Simplot 10.0軟件作圖，用SPSS 13.0軟件中的Tukey HSD進(jìn)行差異顯著性分析 （P＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 反復(fù)凍融過程中UHP和TB樣品菌落總數(shù)的變化

圖 1 反復(fù)凍融過程中UHP和TB樣品菌落總數(shù)的變化Fig. 1 Changes in TBC of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

從圖1可以看出，UHP和TB樣品初始菌落數(shù)分別為3.41（lg（CFU/g））和4.86（lg（CFU/g）），前者顯著低于后者，而且在凍藏100 d、反復(fù)凍融5 次的過程中始終為UHP樣品菌落總數(shù)顯著低于TB樣品菌落總數(shù)。這是因?yàn)槌邏禾幚聿粌H能夠提高腌制速率，還具有冷殺菌作用[18]，尤其對(duì)芽孢菌有很顯著的殺滅作用[19]。UHP和TB樣品在凍融1 次后細(xì)菌總數(shù)分別為3.11（lg（CFU/g）） 和4.38（lg（CFU/g）），相比初始菌落總數(shù)均有所下降，這是因?yàn)榧庸ず玫漠a(chǎn)品經(jīng)過速凍、-18 ℃凍藏后，微生物進(jìn)入新的冷藏環(huán)境，在適應(yīng)及滯留期部分被凍死，這與李秀霞等[20]的研究結(jié)果一致。凍融1 次后，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的繼續(xù)增加，UHP和TB樣品的菌落總數(shù)一直維持在較低水平，并沒有顯著增加，這是因?yàn)樵趦霾貤l件下，微生物細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)或膠體脫水，溶質(zhì)濃度增加，促使菌體蛋白質(zhì)變性，同時(shí)冰晶體的形成還會(huì)使微生物細(xì)胞膜遭受機(jī)械性破壞。

2.2 反復(fù)凍融過程中UHP和TB樣品TBARS值的變化

從圖2可以看出，凍融初期，UHP和TB兩組樣品的TBARS值分別為0.04 mg/kg和0.06 mg/kg，兩者均處于 較低水平，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，TBARS值在凍融前3 次整體上變化不顯著（P＞0.05），3 次后有顯著升高趨勢(shì) （P＜0.05），凍融4 次時(shí)，UHP、TB兩組樣品的TBARS值分別為0.065 mg/kg和0.074 mg/kg，前者顯著低于后者 （P＜0.05），這是因?yàn)槌邏禾幚砭哂幸种迫忸愔狙趸淖饔肹21]。即使凍融5 次，UHP、TB兩組樣品的TBARS值也僅分別升高至0.10 mg/kg和0.11 mg/kg，且兩組之間差異不顯著（P＞0.05）。這說明UHP和TB產(chǎn)品在凍藏過程中脂肪氧化得到很好的控制，這可能與五香風(fēng)味腌制液中姜、蒜、香辛料等所含有的天然抗氧化成分有關(guān)。

圖 2 反復(fù)凍融過程中UHP和TB樣品TBARS值的變化Fig. 2 Changes in TBARS values of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

2.3 反復(fù)凍融過程中UHP和TB樣品TVB-N含量的變化

圖 3 反復(fù)凍融過程中UHP和TB樣品TVB-N含量的變化Fig. 3 Changes in TVB-N contents of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

TVB-N含量是評(píng)價(jià)水產(chǎn)制品新鮮程度的重要指標(biāo)之一。TVB-N含量與微生物數(shù)量高度相關(guān)，微生物作用下水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)被分解產(chǎn)生氨及胺類等堿性含氮 物質(zhì)[22]，使TVB-N含量升高，產(chǎn)品新鮮度下降。從圖3可以看出，凍融初期，UHP、TB兩組樣品TVB-N含量分別為5.34 mg/100 g和6.85 mg/100 g，含量較低，說明這兩種腌制方式加工的開背調(diào)味魚新鮮度比較高，這與菌落總數(shù)結(jié)果一致。凍融循環(huán)1 次后，兩組TVB-N含量迅速升高，隨著反復(fù)凍融循環(huán)次數(shù)的繼續(xù)增加，TVB-N含量呈緩慢升高趨勢(shì)，到凍融循環(huán)5 次，UHP、TB樣品的TVB-N含量分別為10.02、10.73 mg/100 g，均低于淡水魚鮮度TVB-N含量的限量（20.00 mg/100 g）[23]。這是因?yàn)閮霾剡^程中微生物作用受到抑制，蛋白質(zhì)被分解為堿性含氮物質(zhì)的過程也被抑制，即使后期凍融循環(huán)次數(shù)增加， 因微生物作用導(dǎo)致的TVB-N含量增加量也較小。在凍融循環(huán)過程中，UHP樣品的TVB-N含量始終顯著低于TB樣品（P＜0.05）。綜上，對(duì)于凍融5 次的開背調(diào)味魚，超高壓腌制比滾揉腌制能更好地保持其鮮度。

2.4 反復(fù)凍融過程中UHP和TB樣品氣味的變化

圖 4 反復(fù)凍融過程中UHP（A）和TB（B）樣品氣味的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis plots for odor changes of UHP (A) and TB (B) samples during repeated freeze-thaw cycles

從圖4A可知，凍融循環(huán)0～3 次的UHP0d、UHP20d、UHP40d、UHP60d樣品較密集地分布在一起，而UHP80d、UHP100d樣品與UHP0d樣品分布距離較遠(yuǎn)，說明當(dāng)將樣品凍融循環(huán)4 次后，UHP樣品的風(fēng)味與新鮮開背調(diào)味魚之間出現(xiàn)顯著差異。從圖4B可以看出，TB樣品中，TB60d、TB80d、TB100d樣品分布在不同的區(qū)域，與TB0d樣品相距較遠(yuǎn)，說明當(dāng)將樣品凍融循環(huán)3 次后，TB樣品的風(fēng)味與新鮮開背調(diào)味魚之間出現(xiàn)顯著差異。以上結(jié)果與TBARS值結(jié)果基本一致，說明脂肪氧化對(duì)調(diào)理魚產(chǎn)品風(fēng)味影響較大。

2.5 反復(fù)凍融過程中UHP、TB 樣品MP總巰基和二硫鍵含量的變化

巰基是蛋白分子中非常重要的功能基團(tuán)，總巰基含量是蛋白氧化的一項(xiàng)重要指標(biāo)，總巰基含量越低，蛋白氧化程度越高[24]?？値€基含量的降低是由于巰基氧化為二硫鍵[25]，所以總巰基含量降低對(duì)應(yīng)著二硫鍵升高。

由圖5可以看出，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，UHP和TB魚肉產(chǎn)品蛋白氧化程度逐漸加強(qiáng)，表現(xiàn)為MP總巰基含量顯著降低（P＜0.05），二硫鍵含量顯著升高 （P＜0.05）。這是因?yàn)榉磸?fù)凍融過程中，冰晶體逐漸增大破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)周邊分散的粒子濃度繼續(xù)增加，加速蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)發(fā)生變性和聚集，會(huì)伴隨著巰基氧化形成二硫鍵[26-28]。在凍融循環(huán)0 次時(shí)，UHP、TB樣品的MP總巰基含量較高，分別為93.10、72.17 nmol/mg，二硫鍵含量較低，分別為26.88、29.11 nmol/mg。但凍融循環(huán)5 次后，總巰基含量顯著降低，二硫鍵含量顯著升高，其中UHP、TB總巰基含量分別為56.88、51.55 nmol/mg，二硫鍵含量分別為35.42、44.00 nmol/mg。UHP和TB樣品在各個(gè)凍融循環(huán)次數(shù)之間的MP總巰基含量和二硫鍵含量差異均達(dá)到顯著水平 （P＜0.05），表明超高壓腌制加工的開背調(diào)味魚蛋白氧化程度顯著低于滾揉腌制方式，這是因?yàn)闈L揉腌制方式會(huì)伴隨著產(chǎn)熱產(chǎn)能的過程，物理狀態(tài)也有會(huì)發(fā)生一定程度的改變，而超高壓方式對(duì)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)影響較小，所以在反復(fù)凍融過程中，超高壓腌制調(diào)味魚產(chǎn)品的蛋白氧化程度低于滾揉腌制方式。

圖 5 反復(fù)凍融過程中UHP、TB樣品MP總巰基和二硫鍵含量的變化Fig. 5 Changes in total sulfhydryl group and disulfide bond contents of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

2.6 反復(fù)凍融過程中UHP、TB樣品MP的二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜變化

圖 6 反復(fù)凍融過程中UHP（A）、TB（B）樣品MP的 二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜變化Fig. 6 Change in second-derivative UV spectra of UHP (A) and TB (B) samples during repeated freeze-thaw cycles

蛋白質(zhì)分子中的部分官能團(tuán)具有特征性的紫外吸收區(qū)域[29]，色氨酸、酪氨酸的R基團(tuán)含有苯環(huán)共軛雙鍵，分別在280 nm和275 nm波長(zhǎng)處有吸收峰[30]。從圖6可以看出，在280～300 nm之間，不同凍融循環(huán)次數(shù)UHP和TB樣品MP的二階導(dǎo)數(shù)吸收光譜均在288、296 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)極大值，在284、292 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)極小值。在288 nm波長(zhǎng)處的峰值是色氨酸、酪氨酸共同作用的結(jié)果，而在296 nm波長(zhǎng)處的峰值可以單獨(dú)歸因于酪氨酸[31]。隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，288 nm和296 nm處的峰值有明顯的藍(lán)移，這說明色氨酸、酪氨酸殘基從內(nèi)部轉(zhuǎn)移到極性更高的區(qū)域，并由于構(gòu)象的改變而暴露在蛋白的表面，這表明蛋白發(fā)生了一定程度的氧化。

2.7 反復(fù)凍融過程中UHP和TB樣品MP的FTIR分析結(jié)果

圖 7 反復(fù)凍融過程中UHP（A）、TB（B）樣品MP的FTIR變化Fig. 7 Changes in FTIR spectra of UHP (A) and TB (B) samples during repeated freeze-thaw cycles

蛋白質(zhì)的肽鍵有幾個(gè)特征振動(dòng)帶，包括酰胺I帶（1600～1700 cm-1）、酰胺II帶（1500～1600 cm-1）和酰胺III帶（1200～1300 cm-1）[32]，其中酰胺I和酰胺III帶對(duì)于探討蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)十分有用[33]，可定量分析獲得各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。酰胺I帶主要來自C＝O 的伸縮振動(dòng)[34]，酰胺III帶來源于肽鍵的C—N伸縮振動(dòng)和N—H面內(nèi)振動(dòng)。圖7為不同凍融循環(huán)次數(shù)的UHP、TB樣品MP的FTIR圖，對(duì)酰胺I帶（1700～1600 cm-1） 譜峰進(jìn)行傅里葉自轉(zhuǎn)積譜分析（半峰寬810，增強(qiáng)因子f＝211），結(jié)合Origin軟件里的Savitsk-Golay函數(shù)得到各個(gè)峰區(qū)對(duì)應(yīng)的相對(duì)面積，即為各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量[35]，凍融過程中UHP、TB樣品MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量見表1。

表 1 凍融過程中UHP、TB樣品MP二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量Table 1 Relative contents of secondary structures in UHP and TB samples during freeze-thaw cycles

由表1可以看出，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，UHP、TB樣品MP的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量降低，β-折疊、無規(guī)卷曲相對(duì)含量升高，并且UHP樣品MP的α-螺旋相對(duì)含量下降趨勢(shì)比TB緩慢。α-螺旋相對(duì)含量的減少表明魚肉蛋白內(nèi)部分子中的疏水基團(tuán)暴露，表面疏水性增大。由于魚肉水分在反復(fù)凍融過程中不斷遷移，因此β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)難以被維持，其相對(duì)含量出現(xiàn)較大幅度的下降，凍融5 次后，UHP、TB樣品MP的β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量分別將至10.21%和11.88%。在4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)中，β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量最低，這可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)在腌制魚肉時(shí)添加了葡萄糖和白糖，小分子的糖類有助于MP形成片層結(jié)構(gòu)，保持蛋白的分散結(jié)構(gòu)[36]。與凍融0 次相比，凍融5 次后UHP樣品的β-折疊相對(duì)含量增加量（3.40%）高于TB樣品的β-折疊增加量（2.44%）。說明利用超高壓和滾揉腌制加工的開背調(diào)味魚在反復(fù)凍融過程中，盡管蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，但魚肉蛋白質(zhì)仍能維持一定的穩(wěn)定性，且超高壓處理效果更優(yōu)。

2.8 反復(fù)凍融過程中的UHP、TB樣品MP的SDS-PAGE分析結(jié)果

由圖8可以看出，UHP、TB樣品MP的條帶包括肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌原蛋白，這些條帶在電泳圖中從上而下依次排列，與Sánchez-Alonso等[37]報(bào)道的結(jié)果一致。在凍融循環(huán)0～2 次，MHC、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌原蛋白條帶變化并不明顯；隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，尤其是凍融循環(huán)4～5 次時(shí)，MHC條帶變細(xì)，肌動(dòng)蛋白條帶變淡，說明反復(fù)凍融使蛋白發(fā)生了降解。因?yàn)樵诩庸ず蛢霾剡^程中MP中MHC比肌動(dòng)蛋白和肌原蛋白更容易氧化[38]， 從圖8中也觀察到MHC條帶比其他條帶變化較為明顯，且TB組的MHC蛋白條帶比UHP組樣品明顯變淡變細(xì)，這一結(jié)果與樣品的總巰基和二硫鍵含量的變化結(jié)果一致，均是凍融循環(huán)次數(shù)對(duì)UHP組樣品的 影響較小。盡管隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，蛋白條帶略有變化，但在凍融5 次時(shí)，仍能清晰可見5 條條帶，說明超高壓和滾揉腌制的開背調(diào)味魚在反復(fù)凍融5 次后產(chǎn)品仍在可接受范圍，沒有發(fā)生明顯的蛋白氧化現(xiàn)象。

圖 8 反復(fù)凍融過程中UHP（A）、TB（B）樣品MP的SDS-PAGE變化Fig. 8 Changes in SDS-PAGE patterns of MPs in UHP (A) and TB (B) samples during repeated freeze-thaw cycles

2.9 反復(fù)凍融過程中的UHP、TB樣品MP的微觀結(jié)構(gòu)變化

圖 9 反復(fù)凍融過程中UHP、TB樣品MP的微觀結(jié)構(gòu)變化Fig. 9 Microstructure changes of UHP and TB samples during repeated freeze-thaw cycles

凍融0 次時(shí)，UHP、TB樣品MP冷凍干燥粉末表面平滑、結(jié)構(gòu)致密、兩者之間沒有明顯差異（圖9A1、B1）。當(dāng)反復(fù)凍融1 次時(shí)，UHP、TB樣品MP表面相對(duì)平整，有微小褶皺，相比較而言，TB樣品的褶皺比UHP樣品更明顯（圖9A2、B2）。當(dāng)反復(fù)凍融2 次時(shí)，UHP樣品MP整體呈現(xiàn)塊狀結(jié)構(gòu)，但出現(xiàn)細(xì)小的孔洞；而TB樣品褶皺增加，表面微小的孔洞也增多，且呈蜂窩狀，表面結(jié)構(gòu)比UHP樣品變得更粗糙（圖9A3、B3）。

隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加（3～5 次），UHP、TB樣品MP表面的褶皺、孔洞變化均不明顯，但TB樣品褶皺程度均比UHP樣品明顯。這說明魚肉經(jīng)反復(fù)凍融循環(huán)，蛋白發(fā)生變性和氧化，會(huì)影響到MP的結(jié)構(gòu)完整性，表現(xiàn)在MP表面會(huì)出現(xiàn)孔洞和褶皺。相比較而言，UHP樣品比TB樣品的結(jié)構(gòu)破壞程度略輕，這與總巰基含量、二硫鍵含量、紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜等分析結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

UHB、TB開背調(diào)味魚在反復(fù)凍融過程（1～5 次）中品質(zhì)變化如下：菌落總數(shù)始終維持在較低水平；隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，TBARS值在凍融前3 次總體變化不顯著（P＞0.05），3 次后有顯著升高趨勢(shì)；TVB-N含量呈緩慢升高趨勢(shì)，但凍融循環(huán)過程中始終低于淡水魚鮮度TVB-N 20.00 mg/100 g的限量；凍融循環(huán)3～4 次后，樣品的風(fēng)味與新鮮開背調(diào)味魚之間出現(xiàn)顯著差異。

UHB、TB開背調(diào)味魚在反復(fù)凍融過程（1～5 次）中MP特性變化如下：總巰基含量顯著降低（P＜0.05），二硫鍵含量顯著升高（P＜0.05）；α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量降低，β-折疊、無規(guī)卷曲相對(duì)含量升高；MHC、肌動(dòng)蛋白條帶均有不同程度的變淺變細(xì)；掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，凍融2 次時(shí)，樣品表面明顯出現(xiàn)孔洞、褶皺，表面結(jié)構(gòu)粗糙。

對(duì)比UHP、TB樣品發(fā)現(xiàn)，UHP樣品的各指標(biāo)變化趨勢(shì)明顯低于TB樣品，說明UHP腌制方式可以延緩開背調(diào)味魚在反復(fù)凍融過程的品質(zhì)變化。