西式熏煮火腿在不同貯藏溫度下細(xì)菌多樣性 和揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

冉 渺，何臘平*，朱秋勁

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

西式熏煮火腿由于其良好的感官特性、健康屬性和便利性成為深受消費(fèi)者喜愛的即食肉制品之一[1]。溫度是貯藏過程微生物生長繁殖的主要驅(qū)動(dòng)力[2]。零售商店開放式冷藏柜等溫度濫用情況使得西式熏煮火腿這類對溫度敏感的肉制品在貯藏后期細(xì)菌大量繁殖，貨架期縮短。溫度濫用會(huì)影響菌群的組成，導(dǎo)致更為復(fù)雜的細(xì)菌多樣性[3]。高通量測序技術(shù)是一種免培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)，在揭示天然發(fā)酵乳制品tarag[4]、不同成熟階段的傳統(tǒng)意大利香腸[5]、不同增菌溫度下的冷鮮雞肉[6]等的細(xì)菌多樣性方面應(yīng)用廣泛。

熏煮火腿的風(fēng)味影響消費(fèi)者購買欲[7]。風(fēng)味變差是火腿貯藏時(shí)最先被發(fā)現(xiàn)的品質(zhì)變質(zhì)[8]。貯藏溫度對于發(fā)酵食品具有重要影響。貯藏溫度濫用使得酸奶中酵母菌快速生長，導(dǎo)致過多的氣體形成和異味產(chǎn)生[9]。Leroy等[10]認(rèn)為在氣調(diào)包裝熟火腿中檢測到的幾種揮發(fā)性化合物可能是細(xì)菌的葡萄糖和氨基酸代謝引起，它們的產(chǎn)生與貯藏溫度有關(guān)。García等[8]建議利用腸桿菌數(shù)量和揮發(fā)性化合物含量來確定肉類的初期變質(zhì)。Martín等[11]發(fā)現(xiàn)變質(zhì)的伊比利亞干腌火腿的微生物顯著改變了其揮發(fā)性化合物。食品的風(fēng)味不僅與風(fēng)味化合物含量有關(guān)，還與感覺閾值有關(guān)[12]。 相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法是一種確定食品中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的方法[13]， ROAV越大對食品中的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)越大[14]。Sun Lingxia等[15]通過ROAV法確定了燉雞的風(fēng)味成分，結(jié)果表明ROAV法是一種可行的選擇方法。然而，人們對溫度濫用情況下西式熏煮火腿貯藏過程中細(xì)菌多樣性及與之有關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味化合物知之甚少。

本研究首先通過高通量測序法測定了4、10、15、20 ℃和25 ℃這5 個(gè)恒定溫度模擬溫度濫用情況下西式熏煮火腿的細(xì)菌群落。同時(shí)通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法檢測在相同過程中的揮發(fā)性化合物，并利用ROAV法確定了揮發(fā)性風(fēng)味化合物。然后使用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對基于細(xì)菌屬的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行樣品分類。最后，對細(xì)菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味化合物進(jìn)行相關(guān)性分析。本研究為確定西式熏煮火腿不同貯藏溫度下的優(yōu)勢菌以及基于細(xì)菌形成的揮發(fā)性風(fēng)味化合物提供數(shù)據(jù)支持和理論支撐，有助于幫助制定新策略以減少因?yàn)E用溫度導(dǎo)致西式熏煮火腿細(xì)菌群落變化或因細(xì)菌群落變化引起的揮發(fā)性風(fēng)味變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后腿肉購自貴州五福坊食品有限公司；煙熏液（C-10-12、C-10-06）購自美國紅箭國際公司。

Mag-Bind Soil DNA Kit 美國Omega公司；Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；2×TaqMaster Mix 美國Vazyme公司；MagicPure Size Selection DNA Beads 北京全式金生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZBJ-40斬拌機(jī)、GR-60間歇式真空滾揉機(jī) 諸城市新得利食品機(jī)械有限公司；GCJ-50灌腸機(jī) 諸城市華剛機(jī)械有限公司；SPX-50B生化培養(yǎng)箱 天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠；Pico-21臺(tái)式離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器 深圳 拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C電泳儀、DYCZ-21電 泳槽 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；Q32866 Qubit?3.0熒光計(jì) 美國Invitrogen公司；T100TMThermal Cyeler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭 美國Supelco公司；456-GC-SQ GC-MS聯(lián)用儀 美國賽里安儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 西式熏煮火腿的制作

根據(jù)Han Yanqing等[16]的方法稍作修改。首先將選自豬后腿的原料肉去除結(jié)締組織、淋巴、脂肪等，將其切成長寬高為3 cm×2 cm×1 cm的肉塊，加入腌制液（食鹽2.0%（以肉塊質(zhì)量計(jì)，后同），亞硝酸鈉0.015%、異抗壞血酸鈉0.06%、多磷酸鈉0.1%、焦磷酸鈉0.2%、白糖0.8%、蒸餾水30%、乳酸鏈球菌素（Nisin）0.02%）混合均勻后在4 ℃冰箱中放置36 h，然后將腌制好的肉塊取少部分?jǐn)匕铻槿饷?，將斬拌好的肉糜、肉塊和配料（鹽0.4%（以肉糜、肉塊總質(zhì)量計(jì)，后同）、味精0.5%、黑胡椒粉0.5%、大豆蛋白2.2%、淀粉6.5%、黃原膠0.2 %、卡拉膠0.3%、紅曲紅0.01%、煙熏液C-10-120.2%、煙熏液C-10-06 0.5%）在間歇式真空滾揉機(jī)中滾揉6 h（工作30 min、間歇10 min），灌腸，最后在80 ℃的恒溫水浴鍋中煮2 h，冰水冷卻，切成薄片，真空包裝。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組

將西式熏煮火腿分別放置在4、10、15、20 ℃ 和25 ℃生化培養(yǎng)箱中，根據(jù)貯藏實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了西式熏煮火腿在4、10、15、20 ℃和25 ℃下貯藏時(shí)間分別為61、61、37、25、21 d，在4 ℃貯藏前期1 d（EH）、貯藏中期31 d（MH4）、貯藏后期61 d（LH4）和其他溫度（10、15、20、25 ℃）的貯藏后期61 d（LH10）、37 d（LH15）、25 d（LH20）、21 d （LH25）這7 個(gè)時(shí)間點(diǎn)參考Liang Huipeng等[17]的方法均收集3 個(gè)樣品并充分混勻后進(jìn)行分析。

1.3.3 細(xì)菌菌落的高通量測序

在無菌環(huán)境下準(zhǔn)確稱取25 g剪碎的樣品放入225 mL滅菌的生理鹽水，振蕩混勻，10000 r/min室溫離心3 min，棄置上層液體。按照Mag-Bind Soil DNA Kit相應(yīng)的操作步驟進(jìn)行細(xì)菌總DNA提取并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。對細(xì)菌16S rDNA的V3～V4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1）第一輪擴(kuò)增體系：2×Taqmaster Mix 15 μL、Bar-PCR Primer F 10 μmol/L 1 μL、Primer R 10 μmol/L 1 μL、Genomic DNA 10～20 ng，加滅菌超純水至30 μL；條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行20 個(gè)循環(huán)；72 ℃完全延伸5 min；PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測；2）第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物，體系：2×Taqmaster Mix 15 μL、Primer F 10 μmol/L 1 μL、Primer R 10 μmol/L 1 μL、上一輪PCR產(chǎn)物20 ng，加滅菌超純水至30 μL；條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)；72 ℃完全延伸5 min。所得擴(kuò)增產(chǎn)物通過Agencourt AMPure XP純化，Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，再通過Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行DNA測序。

1.3.4 揮發(fā)性化合物的測定

揮發(fā)性化合物的測定采用GC-MS法進(jìn)行分析，具體參考趙冰等[18]的方法并稍作修改，在5～10 ℃的環(huán)境中準(zhǔn)確取5 g樣品置于20 mL頂空瓶中，將老化后的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，于60 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入GC進(jìn)樣口，于250 ℃解吸3 min，同時(shí)啟動(dòng)GC-MS儀采集數(shù)據(jù)。

GC條件：色譜柱：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；載氣：He；進(jìn)樣溫度：250 ℃；流速：0.8 mL/min；升溫程序：在40 ℃保持運(yùn)行4 min，然后以5 ℃/min的速率升高到90 ℃，再以10 ℃/min的速率升高到230 ℃，保持運(yùn)行6 min。

MS條件：接口溫度：250 ℃；離子源溫度：200 ℃；電離方式：電子轟擊離子源；發(fā)射電流：80 μA；電子能量：70 eV；檢測器電壓：1000 V。

掃描結(jié)果與Wiley、Wileyregistry8e、Replib和Mainlib 4 個(gè) 譜庫對照進(jìn)行成分鑒定，參考劉登勇等[13]的方法并稍作 修改，分析正、反匹配度均在900以上（最大1000）的化合物，0.1≤ROAV≤100為西式熏煮火腿的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，ROAV計(jì)算公式如下。

式中：C為揮發(fā)性化合物的相對含量/%；CS為定義的標(biāo)準(zhǔn)揮發(fā)性化合物相對含量/%；T為揮發(fā)性化合物的感覺閾值/（μg/kg）；Ts為定義的標(biāo)準(zhǔn)揮發(fā)性化合物的感覺閾值/（μg/kg）。

ROAV≥1的揮發(fā)性化合物為樣品的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，0.1≤ROAV＜1的揮發(fā)性化合物對樣品的總體風(fēng)味具有重要的修飾作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

Illumina Miseq得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列。獲得的高質(zhì)量有效序列按97%相似水平進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）分類，通過Coverage指數(shù)反映各樣品文庫的覆蓋率，Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)反映細(xì)菌群落分布的alpha多樣性[6]。參考Zhang Jian等[19]的方法在SIMCA 14.1軟件中執(zhí)行OPLS-DA，以樣品標(biāo)簽為觀察值，分別以揮發(fā)性化合物、揮發(fā)性風(fēng)味化合物、細(xì)菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味化合物為變量分析分類樣品中變量的相似性及差異性，同時(shí)通過變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）來衡量各變量的表達(dá)模式對各組樣品分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，其中VIP＞1意味著判斷變量對模型的重要性。細(xì)菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味化合物之間滿足顯著相關(guān)（|r|＞0.6，P＜0.05）則表明結(jié)果是可靠的[20]。采用SPSS 20軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，使用Origin 2018、SIMCA 14.1和Cytoscape 3.7.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下細(xì)菌群落變化

表 1 樣品測序結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis of sequencing results

由表1可知，采用高通量測序獲得了西式熏煮火腿4 ℃前、中期，10、15、20、25 ℃后期7 種樣品共245676 條優(yōu)質(zhì)序列，根據(jù)序列之間97%的相似性將序列 分成不同OTU，共獲得個(gè)1639 個(gè)OTU，平均每種樣品含有約234 個(gè)OTU。如表1所示，每種樣品的覆蓋率均在99%以上，表明測序的深度可以準(zhǔn)確反映樣品細(xì)菌群落的真實(shí)情況[21]。所有樣品中，在4 ℃貯藏中期樣品Simpson指數(shù)最低，Shannon指數(shù)最高，分別為0.06和3.42，物種豐富度達(dá)到最高，其次是4 ℃貯藏前期，其Simpson和Shannon指數(shù)分別為0.07、3.32，在25 ℃貯藏末期物種豐富程度最低，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為0.70、0.77。說明西式熏煮火腿貯藏過程中細(xì)菌群落組成到后期趨于單一，貯藏溫度越高，越快趨于單一。

圖 1 不同貯藏溫度下樣品屬水平的菌群變化Fig. 1 Variation in bacterial community composition at the genus level in samples at different storage temperatures

如圖1所示，西式熏煮火腿在不同貯藏溫度下相對豐度大于1%的細(xì)菌屬有21 種，與溫冬玲等[6]的研究結(jié)果相似，不同貯藏溫度下西式熏煮火腿貯藏的各階段優(yōu)勢菌不同。7 種樣品在屬水平上主要分為兩大類：一類為4 ℃下貯藏前、中期的樣品，其品質(zhì)較好，優(yōu)勢菌是不動(dòng)桿菌屬（24.95%～25.89%）、哈夫尼菌屬（10.65%～16.13%）、腸桿菌屬（9.19%～11.50%），各細(xì)菌屬分布較均勻；另一類的品質(zhì)較差，即為4～25 ℃貯藏后期的樣品，菌屬分布不均勻，缺乏競爭微生物[22]，其中4 ℃貯藏后期的優(yōu)勢菌是沙雷氏菌屬（74.97%）和乳桿菌屬（16.70%），10 ℃貯藏后期的優(yōu)勢菌是沙雷氏菌屬（60.87%）和耶爾森菌屬（36.93%），15 ℃貯藏后期的優(yōu)勢菌是乳酸球菌屬（67.64%）和腸桿菌屬（11.15%），而20 ℃和25 ℃貯藏后期的優(yōu)勢菌則均為腸桿菌屬，相對豐度分別為83.22%和82.76%。Denis等[23]認(rèn)為蒸煮火腿中大腸菌群的存在是由于熱處理后的加工污染。與Vasilopoulos等[24]的 研究結(jié)果類似，貯藏溫度越高，腸桿菌相對豐度越高， 與Hu Ping等[25]發(fā)現(xiàn)真空包裝切片火腿在4 ℃貯藏條件下的主要優(yōu)勢菌為乳桿菌不同，這可能是由于本研究中添加的Nisin對其有顯著的抑制作用[26]。Gill等[27]在博洛尼亞大紅腸中添加Nisin等混合抑菌劑后，將其在8 ℃下貯藏3 周后大腸桿菌數(shù)量突然增加，甚至高于空白組。

2.2 不同貯藏溫度下?lián)]發(fā)性化合物相對含量變化

表 2 不同貯藏溫度下樣品中揮發(fā)性化合物相對含量和感覺閾值Table 2 Relative contents and odor thresholds of volatile compounds in samples at different storage temperatures

續(xù)表2

續(xù)表2

圖 2 基于OPLS-DA模型對不同貯藏溫度下樣品中揮發(fā)性化合物的分析Fig. 2 Analysis of volatile compounds in samples at different storage temperatures by OPLS-DA model

如表2所示，不同貯藏溫度下西式熏煮火腿樣品的揮發(fā)性化合物共91 種，主要以烯烴類（58.50%～66.94%）、芳香族化合物（10.97%～15.26%）、醛類（4.47%～12.85%）和醇類（4.89%～6.21%）為主。如圖2所示，與細(xì)菌屬分類一致，揮發(fā)性化合物通過OPLS-DA模型可明顯分為兩類（坐標(biāo)圖中X＜0和X＞0兩部分），包括5 個(gè)主成分，模型參數(shù)R2X為0.983，說明5 個(gè)主成分解釋98.3%的X變量；模型參數(shù)R2Y為0.997，說明5 個(gè)主成分解釋99.7%的Y變量；模型預(yù)測指數(shù)Q2為0.914，說明模型對兩類樣品的預(yù)測能力為91.4%，模型的穩(wěn)定性及預(yù)測能力均較好[28]。在4 ℃前、中期的揮發(fā)性化合物主要以雜環(huán)化合物、醛類、芳香族化合物和醇類等為主，4～25 ℃貯藏后期的揮發(fā)性化合物主要以烯烴類、醚類、酸類、酮類和酯類等為主，貯藏溫度越高，越容易生成酸類、酮類和酯類。Lyte等[29]認(rèn)為烯烴類等碳?xì)浠衔锱c牛肉中不受歡迎的風(fēng)味有一定的聯(lián)系。謝恬等[30]認(rèn)為醚類化合物在肉制品風(fēng)味中起著重要作用。García等[8]認(rèn)為氨基酸可以由具有高蛋白水解活性的微生物（如腸桿菌）釋放，微生物發(fā)酵氨基酸產(chǎn)生乙酸、丁酸等酸類化合物，大量存在于變質(zhì)的火腿中，醛類在腐敗的干腌火腿中的含量較未腐敗的低，同時(shí)他們認(rèn)為變質(zhì)干腌火腿中的揮發(fā)性化合物較未變質(zhì)的產(chǎn)生更高水平的酮類化合物，這可能是由于沙雷氏菌屬、變形桿菌屬等代謝所致。Fulladosa等[31]研究發(fā)現(xiàn)酯類化合物的含量與干腌火腿空心缺陷強(qiáng)度呈正相關(guān)，他們推測高含量的酯類與微生物酯酶活性有關(guān)。

2.3 不同貯藏溫度下?lián)]發(fā)性風(fēng)味化合物ROAV變化

表 3 不同貯藏溫度下樣品中揮發(fā)性化合物的ROAV Table 3 ROAVs of volatile compounds in samples at different storage temperatures

圖 3 基于OPLS-DA模型對不同貯藏溫度下樣品中揮發(fā)性風(fēng)味 化合物的分析Fig. 3 Analysis of volatile flavor compounds in samples at different storage temperatures based on OPLS-DA model

本實(shí)驗(yàn)研究了西式熏煮火腿樣品具有感覺閾值的59 種揮發(fā)性化合物，其總相對含量為73.19%～77.94%（表2）。表3列舉了ROAV≥0.1的所有19 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物。如圖3所示，通過OPLS-DA模型分析發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性風(fēng)味化合物亦可顯著分為兩類，包括5 個(gè)主成分，R2X為0.954，R2Y為1，Q2為0.952，說明模型的穩(wěn)定性及預(yù)測能力均較好[28]。一類是4 ℃貯藏前、中期，其關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物（ROAV＞1）有月桂烯、D-檸檬烯、愈創(chuàng)木酚、正辛醛、壬醛、芳樟醇，其中愈創(chuàng)木酚化合物是木熏風(fēng)味主要風(fēng)味化合物[35]。而4 ℃貯藏前期的揮發(fā)性風(fēng)味化合物以2-正戊基呋喃等為主，其ROAV＜1，Leroy等[10]認(rèn)為2-正戊基呋喃可能起源于火腿烹飪過程中發(fā)生的內(nèi)源性反應(yīng)，Benet等[7]則認(rèn)為其是亞油酸氧化造成的， 導(dǎo)致烤制的肉香氣有細(xì)微差別，增加熟火腿的整體香氣；4 ℃貯藏中期主要以另一種亞油酸氧化產(chǎn)物——正己醛等為主，其ROAV＞1，在含有亞硝酸鹽的熟火腿中呈現(xiàn)草香、青蘋果味等令人愉悅的氣味[36]，然而較高含量的己醛可能會(huì)帶來令人不愉快的腐爛味道[37]。另一類是4～25 ℃貯藏后期的樣品，其關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味化合物有乙酸異戊酯、β-石竹烯、茚等。其中4 ℃后期以4-甲基愈創(chuàng)木酚等為主，這意味著4 ℃后期仍有木熏風(fēng)味[35]，25 ℃后期以乙酸異戊酯、3-羥基-2-丁酮等為主。Lyte等[29]發(fā)現(xiàn)3-羥基-2-丁酮是氣調(diào)包裝牛肉在溫度濫用下的變質(zhì)指示化合物，同時(shí)他們認(rèn)為在溫度濫用下微生物主要貢獻(xiàn)于揮發(fā)性化合物次要的組成部分。

2.4 不同貯藏溫度下細(xì)菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味化合物相關(guān)性分析結(jié)果

圖 5 基于OPLS-DA模型的VIP分析Fig. 5 Variable importance for the projection analysis based on OPLS-DA model

如圖4所示，以細(xì)菌屬的相對豐度為X變量，揮發(fā)性風(fēng)味化合物的ROAV為Y變量，通過OPLS-DA模型可將樣品顯著分為兩類，有4 個(gè)主成分，R2X為0.914，R2Y為1，Q2為0.998，模型穩(wěn)定性及預(yù)測能力均較好[28]。如圖5所示，VIP＞1的不動(dòng)桿菌屬等11 種細(xì)菌屬是兩類樣品中與揮發(fā)性風(fēng)味化合物相關(guān)的差異細(xì)菌屬。這11 種差異細(xì)菌屬主要分布在4 ℃貯藏前、中期，隨著貯藏時(shí)間延長，4～25 ℃貯藏后期差異細(xì)菌屬相對豐度降至不到4 ℃貯藏前期的32.68%。如圖6所示，正己醛的ROAV 與這11 種差異細(xì)菌屬的相對豐度均顯著正相關(guān)（r≥0.776，P＜0.05），到貯藏后期，草香、青蘋果味等令人愉悅的氣味減弱[36]，貯藏溫度越高，減弱得越快，25 ℃貯藏21 d正己醛ROAV降低至4 ℃貯藏初期的44%。由于正己醛ROAV與氣單胞菌屬和鏈球菌屬相對豐度的相關(guān)系數(shù)最大 （r＝0.868），因此正己醛含量降低除了是因?yàn)檎喝┡c其他降解產(chǎn)物反應(yīng)外[38]，還可能是因?yàn)闅鈫伟鷮俸玩溓蚓鷮俚入S著貯藏時(shí)間延長逐漸沒有競爭優(yōu)勢，進(jìn)而抑制它們生長代謝產(chǎn)正己醛，于美娟等[39]也認(rèn)為正己醛的生成與微生物代謝有關(guān)，游離氨基酸通過脫羧和脫氨的微生物降解產(chǎn)生醛等揮發(fā)性化合物[40]。α-蒎烯除了來自火腿腌制過程添加的香料外[41]，因其ROAV與4、10 ℃貯藏后期的優(yōu)勢菌——沙雷氏菌屬的相對豐度極顯著正相關(guān) （r＝0.896，P＜0.01），所以還可能是其代謝產(chǎn)物月桂烯、癸醛的ROAV與10 ℃貯藏后期的優(yōu)勢菌——耶爾森菌屬的相對豐度極顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.938，P＜0.01），月桂烯等單萜烯類因可能作為碳源被耶爾森菌屬等分解而 含量減少[42]。García等[8]認(rèn)為腌漬火腿貯藏過程中醛類由于氧化為相應(yīng)的酸而含量降低，耶爾森菌屬等酯酶活性增加將產(chǎn)生的酸類酯化后使得酯類含量增加。貯藏溫度越高，越有益于腸桿菌屬和腸球菌屬的生長，它們具有很高的變質(zhì)潛力和食品安全風(fēng)險(xiǎn)，氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝水平升高[43]，腸桿菌屬、腸球菌屬相對豐度與茚的ROAV極顯著正相關(guān)（r≥0.952，P＜0.01），腸桿菌的代謝產(chǎn)物還可能包括溫度濫用下的變質(zhì)指示化合物3-羥基-2-丁酮（r＝0.856，P＜0.05）[29]，唐靜等[38]在強(qiáng)化高溫火腿成熟結(jié)束時(shí)也發(fā)現(xiàn)茚含量顯著增加（P＜0.05）。

圖 6 細(xì)菌屬與揮發(fā)性風(fēng)味化合物顯著相關(guān)（P＜0.05）的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)Fig. 6 Network structure showing significant correlation (P ＜ 0.05) between bacterial genera and volatile flavor compounds

3 結(jié) 論

通過高通量測序和GC-MS分別測定了4 ℃前、中期及4、10、15、20 ℃和25 ℃后期西式熏煮火腿的細(xì)菌群落和揮發(fā)性化合物含量。在4 ℃前、中期細(xì)菌群落組成豐富，細(xì)菌屬水平分布均勻，隨著貯藏時(shí)間的延長，到貯藏后期細(xì)菌群落組成單一，4 ℃下優(yōu)勢菌為沙雷氏菌屬和乳桿菌屬，貯藏溫度越高，到后期腸桿菌屬相對豐度越高。研究發(fā)現(xiàn)樣品中揮發(fā)性化合物有91 種，包括烯烴類、芳香族化合物、醛類和醇類等。通過OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)芳樟醇等19 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物（ROAV≥0.1）與細(xì)菌屬分類一致，樣品可顯著分為兩類，分別為4 ℃貯藏前、中期的樣品和4～25 ℃貯藏后期的樣品，兩類樣品間與揮發(fā)性風(fēng)味化合物相關(guān)的差異細(xì)菌屬有不動(dòng)桿菌屬等11 種，它們的相對豐度與正己醛的ROAV顯著正相關(guān)（r≥0.776，P＜0.05），隨著貯藏時(shí)間延長，貯藏溫度越高，正己醛ROAV下降得越快，到貯藏后期不同貯藏溫度下氣單胞菌屬、鏈球菌屬等競爭力減弱，沙雷氏菌屬、乳酸球菌屬和腸桿菌屬等成為優(yōu)勢菌，其中沙雷氏菌屬相對豐度與α-蒎烯的ROAV極顯著正相關(guān) （r＝0.896，P＜0.01），腸桿菌屬相對含量與茚的ROAV呈極顯著正相關(guān)（r＝0.980，P＜0.01）。建議將沙雷氏菌屬、腸桿菌屬等細(xì)菌屬和正己醛等揮發(fā)性風(fēng)味化合物等作為溫度濫用情況下西式熏煮火腿風(fēng)味保鮮的研究重點(diǎn)因素。