細菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因多重實時熒光PCR 檢測體系的建立

劉林 付英梅

近年來，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，多重實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。多重實時PCR越來越多地應(yīng)用于病原體診斷及耐藥基因檢測等方面，如多重實時PCR 結(jié)合熔解曲線檢測15 種呼吸道病原體[1]；通過直接檢測血液中病原體診斷血流感染[2]；多重?zé)晒釶CR 在分枝桿菌鑒定方面應(yīng)用[3]；檢測碳青霉烯酶編碼基因中應(yīng)用[4]； 對鮑曼不動桿菌blaVIM、blaIMP和blaNDM基因進行快速檢測[5]等。多重實時熒光PCR 不僅在臨床檢測方面應(yīng)用廣泛，同時還應(yīng)用于食品安全檢測[6]和畜牧業(yè)檢測等方面[7-8]。其具有高靈敏性，高特異性且操作簡便等優(yōu)點，靈敏度高于經(jīng)典PCR[9]。本研究以五種常見ESBLs 耐藥基因為研究對象，應(yīng)用多重PCR 方法檢測，旨在為革蘭氏陰性菌中普遍存在的ESBLs 基因提供了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株 收集70 株經(jīng)普通PCR 和DNA 測序明確其超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因類型的菌株。

1.1.2 主要試劑 引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成、營養(yǎng)瓊脂、2×PCR Master Mix、瓊脂糖、DNA 上樣緩沖液（6×）及50×TAE Buffer、GelRed 核 酸 染 料、100bp ladder，EvaGreen 2×qPCR Master Mix。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermomixer comfort 舒適型恒溫混勻器、Microfuge 22 R 臺式微量冷凍離心機、T100? Thermal Cycler PCR 儀、DYY-6C 電泳儀、Tanon 1600 電泳凝膠成像系統(tǒng)、LightCycler 定量PCR 儀。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 菌株復(fù)蘇后取單個菌落加入20 μLddH20混勻，99 ℃金屬浴15 min，12000 r/min 離心10 min，取上清液。

1.3.2 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 普通多重PCR 及多重實時熒光PCR反應(yīng)體系：PCR 預(yù)混液10 μL，blaTEM/blaSHV/blaOXA-1/blaCTX-M-1-F/R 各0.32 μL，blaCTX-M-9-F/R 0.64 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 補充至20 μL。普通多重PCR 反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min；30 個循環(huán)，延伸72℃，10 min。熒光定量PCR 反應(yīng)條件：95℃ 300 s；95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃20 s；45 個循環(huán)。

單重實時熒光PCR 反應(yīng)體系各基因上下游引物分別為0.8 μL，其余與多重實時熒光PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件一致。

1.3.3 多重實時熒光PCR 敏感性及特異性檢測 敏感性=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%。特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，與已明確耐藥基因菌株比較，計算敏感性及特異性。

1.3.4 多重實時熒光PCR 靈敏度檢測 將選定用于靈敏度檢測菌株的菌液倍比稀釋，活菌計數(shù)確定細菌濃度，PCR 檢測觀察熔解曲線出現(xiàn)目的峰的最低濃度及瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度即將消失所對應(yīng)濃度，并與多重PCR 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因熔解曲線Tm 值

分別以含blaTEM、blaSHV、blaOXA-1、blaCTX-M-1和blaCTX-M-9基因菌株為模板進行實時PCR 反應(yīng)，blaTEM、blaSHV、blaOXA-1、blaCTX-M-1和 blaCTX-M-9基 因 的 熔 解 曲 線Tm 值 分 別 是77.5 ℃、94.7 ℃、82.8℃、91.6℃、92.6℃（圖1）。

圖1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因熔解曲線Tm 值

2.2 多重實時熒光PCR 敏感性及特異性檢測結(jié)果

多重實時熒光PCR 中blaSHV、blaCTX-M-1、blaCTX-M-9基因特異性和敏感性均為100%，其中blaTEM、blaOXA-1特異性為100%，敏感性分別為85.1%、91.7%（圖2）。

圖2 多重實時熒光PCR 敏感性及特異性檢測結(jié)果

2.3 多重實時熒光PCR 靈敏度檢測結(jié)果

多重實時熒光PCR 靈敏度測定相應(yīng)熔解曲線和擴增曲線（圖3）顯示多重實時熒光PCR 靈敏度可達102cfu/μL。

多重實時熒光PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳的特異性條帶亮度即將消失的對應(yīng)濃度為102cfu/μL，而該菌株多重PCR 相對應(yīng)濃度為104cfu/μL，不同基因型靈敏度無明顯差異（圖4）。

臨床菌株耐藥表型多樣，其中對β- 內(nèi)酰胺類抗生素耐藥最常見，細菌攜帶超廣譜β- 內(nèi)酰胺酶耐藥基因是最常見的耐藥原因，ESBLs 耐藥基因分子生物學(xué)檢測，多數(shù)研究僅應(yīng)用單一的PCR 檢測技術(shù)檢測3 ～4 種耐藥基因。

多重PCR 一次可檢測多個靶標(biāo)，具有快速、靈敏、高通量性等優(yōu)點，實時熒光PCR 實驗結(jié)束后生成一個熔解曲線圖和一個峰圖。熔解曲線圖中可以看到一條隨溫度升高而熒光信號逐漸降低的下降曲線。峰圖中可以看到在標(biāo)本的Tm 值處出現(xiàn)一個峰，根據(jù)峰的高度、寬度、面積及所在位置不同很容易鑒別不同的致病菌。

圖3 多重實時熒光PCR 熔解曲線及擴增曲線分析（A：blaCTX-M-1+blaTEM 基因型熔解曲線；B：blaCTX-M-9 基因型熔解曲線；C：blaCTX-M-1+blaTEM 基因型擴增曲線；D：blaCTX-M-9 基因型擴增曲線）

圖4 不同菌懸液濃度下多重實時PCR 及普通多重PCR 電泳（1.5%膠電泳；M：100bp ladder；C-：陰性對照10n：菌懸液濃度，單位cfu/μL；A、B 為多重實時PCR 產(chǎn)物電泳；C、D 為相應(yīng)的普通PCR 產(chǎn)物電泳）

本研究同時應(yīng)用普通多重PCR 和多重實時PCR 法檢測ESBLs 五種常見耐藥基因，在相同反應(yīng)體系下檢測兩種方法的敏感性、特異性及靈敏度，并結(jié)合熔解曲線進行分析。已有文獻報道利用熔融曲線分析法檢測碳青霉烯酶基因[10]。

本研究中普通多重PCR 反應(yīng)體系已成功建立，而在多重實時PCR 反應(yīng)中，對blaSHV、blaCTX-M-1、blaCTX-M-9耐藥基因檢測敏感性及特異性均可達100%；而對blaTEM、blaOXA-1耐藥基因檢測未能達到很好的敏感性考慮可能原因有：（1）多重 PCR 在同一個反應(yīng)體系中存在多對引物，每對引物之間存在著相互競爭和抑制、很可能形成引物二聚體等錯綜復(fù)雜的情況。同時每對引物由于擴增效率的不同，需要反復(fù)調(diào)整、優(yōu)化各種引物的濃度及其他反應(yīng)參數(shù)[11]。（2）有報道稱利用熔解曲線分辨3 種病毒的特異基因，其核心是PCR 擴增產(chǎn)物的Tm 值之間的差異要≥1.5℃才能有效區(qū)分[12]，而本研究中blaTEM、blaOXA-1引物Tm值很接近，熔解曲線Tm 值也較其他三種基因異常。（3）通常熒光PCR 產(chǎn)物長度80-150 bp，最長是300 bp，大片段會對反應(yīng)造成干擾，而本研究由于與普通PCR 共用引物，PCR 產(chǎn)物長度較大。

靈敏度描述，鄭偉峰等[9]報道實時熒光定量PCR 檢測靈敏度高于經(jīng)典PCR 至少100 倍，本研究中多重實時PCR 檢測靈敏度高于普通多重PCR 100 倍，并采用cfu/μL 單位。

綜上所述，多重實時熒光PCR 在多靶標(biāo)的檢測中發(fā)揮很大的作用，具有快速、高靈敏性和準(zhǔn)確性優(yōu)點，實時監(jiān)測PCR 反應(yīng)，其熔解曲線及擴增曲線可提供很大的分析價值，但其同樣存在不足之處：擴增條件需要探索與協(xié)調(diào)，多對引物同時擴增，可能出現(xiàn)引物間干擾，且各種試驗條件控制不當(dāng)，引物的設(shè)計及靶序列的選擇不當(dāng)都可能降低其靈敏度和特異性，很容易導(dǎo)致擴增失敗或非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)。