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    魚藤酮對PC12細(xì)胞及大鼠腦線粒體的損傷作用

    2021-06-02 00:17:10劉雨周青李曉秀劉波
    關(guān)鍵詞:魚藤酮膜電位緩沖液

    劉雨,周青,李曉秀,劉波

    (1.沈陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院2017級藥學(xué)專業(yè),遼寧 沈陽110034;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2015級醫(yī)學(xué)影像學(xué)專業(yè);3.沈陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;4.遼寧省行為與認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)重點實驗室)

    帕金森?。≒arkinson′s disease,PD)是一種神經(jīng)退行性疾病,多發(fā)生于老年人,主要癥狀包括靜止性震顫、肌僵直、運動功能和姿勢平衡障礙。典型的病理特征為黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元大量缺失,且有路易小體異常折疊聚集。PD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前認(rèn)為可能與遺傳基因、老齡化、經(jīng)常接觸或暴露于環(huán)境污染物,比如殺蟲劑魚藤酮等各種危險因素相關(guān)[1]?,F(xiàn)有的藥物僅可以緩解癥狀,不能終止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程。故建立簡便有效的PD模型對于開展病因、發(fā)病機(jī)制、藥物篩選研究具有重大意義。本研究旨在細(xì)胞、腦組織水平,探討魚藤酮對線粒體的影響,為建立魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞及實驗動物 PC12細(xì)胞株(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所。清潔級SD雄性大鼠,6只,體重280~300 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號:SCXK(京)2006-0009。

    1.2 試劑與儀器 RMPI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司),標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(FBS)、馬血清(美國HyClone公司);魚藤酮、DCFH-DA、多聚賴氨酸、ADP(美國Sigma公司);ATP檢測試劑盒(美國Promega公司);CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1) (碧云天生物技術(shù)研究所);其他常用化學(xué)試劑均為分析純。細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司),正置顯微鏡(OLYMPUS-IX62),超凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠),AllegraTM X-22R低溫離心機(jī)(美國Beckman公司),Spectra Max M5酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司),線粒體氧耗測定儀(英國SI公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 PC12細(xì)胞的培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞以完全RMPI 1640培養(yǎng)基(含10%滅活馬血清,5%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素,1%谷氨酰胺),于37℃、5%CO2、飽和濕度、無菌條件下培養(yǎng),每2 d換培養(yǎng)基一次,細(xì)胞呈對數(shù)增長時,進(jìn)行細(xì)胞傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,以完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至3.4×104個/孔,接種至96孔培養(yǎng)板,置入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24 h。制備模型時,正常對照組換用4%血清培養(yǎng)。

    1.3.2 CCK-8試劑測定細(xì)胞活力 將不同濃度(0.1、1、2、5μM)魚藤酮處理24、48、72 h后,加入CCK-8試劑,10μl/孔,37℃孵育2 h,450 nm處讀取吸收值。以正常對照組細(xì)胞存活率為100%,計算各組細(xì)胞存活率。

    1.3.3 DCFH-DA熒光探針測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量 將2μM魚藤酮處理5 h后,棄原液,PBS洗一次,加入含DCFH-DA(終濃度10μM),100μl/孔;37℃孵育20 min,棄染料,PBS洗一次,每孔加入100μl PBS。在激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm下測定熒光值。以對照組ROS含量為100%,計算各組細(xì)胞ROS含量。

    1.3.4 熒光素酶發(fā)光法測定細(xì)胞內(nèi)ATP含量 使用CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(promega G7570),將2μM魚藤酮處理48 h后,室溫放置30 min,加入100μl發(fā)光試劑,振蕩混勻2 min以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解,室溫避光放置10 min以穩(wěn)定發(fā)光信號,使用M5酶標(biāo)儀檢測ATP含量。以對照組ATP含量為100%,計算各組細(xì)胞ATP含量。

    1.3.5 JC-1熒光探針測定線粒體膜電位(△Ψm) 將細(xì)胞接種24孔板,2μM魚藤酮作用48 h后,棄原液,PBS輕吹、離心、收集細(xì)胞。加入JC-1染色工作液,充分混勻,細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min,用染色緩沖液洗滌2次。重懸后分別加入96孔板,測定熒光值。檢測JC-1單體時,激發(fā)光波長490 nm,發(fā)射光波長530 nm;檢測JC-1聚合物時,激發(fā)光波長525 nm,發(fā)射光波長590 nm。

    1.3.6 大鼠腦線粒體提取 大鼠斷頭處死后,迅速取出腦組織,去除小腦,稱重。置于預(yù)冷的玻璃甁皿內(nèi),用預(yù)冷的線粒體分離緩沖液(0.25 M glucose、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、250μg/ml BSA,調(diào)節(jié)pH 7.4)沖洗3次,剝?nèi)パ?,去除淤血,剪成碎塊,轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器,加入分離緩沖液(10 ml/g組織),手動勻漿10次。所得勻漿液以700 g離心10 min,取上清;將上清以10 000 g離心10 min,去除上清,所得沉淀即為線粒體;以分離緩沖液重懸沉淀,10 000 g重復(fù)離心10 min,棄上清,將線粒體沉淀懸于300μl分離緩沖液中。以Bradford方法檢測線粒體蛋白濃度。線粒體制備過程均在4℃環(huán)境下進(jìn)行。

    1.3.7 Clark氧電極法測定線粒體呼吸功能 反應(yīng)溫度30℃,反應(yīng)總體積1.0 ml。調(diào)節(jié)氧電極,校正100%氧(連續(xù)攪拌30 min)和0%氧(向反應(yīng)體系加入亞硫酸鈉,將氧氣全部消耗)。向反應(yīng)池加入線粒體呼吸緩沖液920μl(225 mM glucose、5 mM KH2PO4、10 mM Tris-HCl、10 mM KCl、0.2 mM EDTA、100μg/ml BSA,調(diào)節(jié)pH 7.4),穩(wěn)定1 min,依次加入線粒體懸液40μl(終濃度0.5 mg/ml)、魚藤酮10μl(終濃度分別為1、0.1、0.01μM)、底物I共10μl(L-谷氨酸鈉及蘋果酸),出現(xiàn)Ⅱ態(tài)呼吸;加入20μl ADP(終濃度250μM),出現(xiàn)Ⅲ態(tài)呼吸;反應(yīng)足夠長時間,進(jìn)入Ⅳ態(tài)呼吸。再次加入ADP,出現(xiàn)新的Ⅲ態(tài)和Ⅳ態(tài)呼吸。觀察并記錄氧耗曲線,計算線粒體氧化磷酸化參數(shù):Ⅲ態(tài)呼吸速率(V3)、Ⅳ態(tài)呼吸速率(V4)、呼吸控制指數(shù)(respiration control rate,RCR)。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 魚藤酮對PC12細(xì)胞存活率的影響 與對照組比較,PC12細(xì)胞經(jīng)不同濃度的魚藤酮處理24、48、72 h,細(xì)胞存活率呈不同程度的下降(P<0.05)。其中,2μM的魚藤酮與PC12細(xì)胞共處理48 h,細(xì)胞活力下降為對照組的47.57%。見圖1。

    圖1 魚藤酮對PC12細(xì)胞存活率的影響

    2.2 魚藤酮對PC12細(xì)胞ROS、ATP含量、線粒體膜電位的影響 與對照組比較,經(jīng)2μM魚藤酮處理5 h后,PC12細(xì)胞的ROS含量顯著升高;2 μM魚藤酮處理48 h后,細(xì)胞ATP含量顯著降低;線粒體膜電位顯著降低(P<0.05),見表1。

    表1 魚藤酮對PC12細(xì)胞ROS、ATP含量、線粒體膜電位的影響

    2.3 魚藤酮對大鼠腦線粒體呼吸功能的影響 與對照組比較,魚藤酮使線粒體氧化磷酸功能呈劑量依賴性損傷,呼吸效率下降,表現(xiàn)為模型組線粒體的V3、V4、RCR顯著降低(P<0.05),見圖2。

    3 討論

    PD的病因尚不明確,可能與年齡老化、家族遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)。近年來,研究顯示,許多環(huán)境化合物參與了線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、小膠質(zhì)細(xì)胞活化及α-突觸核蛋白異常聚集以及自噬受損等發(fā)病機(jī)制,從而增加了PD的發(fā)生風(fēng)險。魚藤酮曾作為殺蟲劑廣泛應(yīng)用,具有親脂性,可透過血腦屏障。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),長期接觸魚藤酮的人群患PD概率增加[2-3],體內(nèi)外研究結(jié)果表明,魚藤酮可導(dǎo)致中樞DA神經(jīng)元損傷,神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)路易小體,動物出現(xiàn)震顫、步態(tài)不穩(wěn)等PD癥狀[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)線粒體在魚藤酮所致的多巴胺神經(jīng)元變性損傷中發(fā)揮了核心作用,線粒體的功能障礙參與了魚藤酮誘導(dǎo)的DA能神經(jīng)元的變性損傷和PD的病程[6]。

    圖2 魚藤酮對大鼠腦線粒體呼吸功能的影響

    PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞,在形態(tài)和功能上具有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征。PC12細(xì)胞表達(dá)多巴胺轉(zhuǎn)運體,并合成多巴胺,細(xì)胞膜上的受體及合成的遞質(zhì)接近中腦DA能神經(jīng)元,故廣泛應(yīng)用于神經(jīng)元,特別是DA能神經(jīng)元死亡方式的研究,是研究體外神經(jīng)細(xì)胞損傷及保護(hù)最為廣泛的細(xì)胞系,常用于PD的研究。

    本研究選用PC12細(xì)胞建立體外PD模型,首先以不同濃度的魚藤酮與細(xì)胞共處理,細(xì)胞存活率呈不同程度下降,最佳的處理濃度和時間是2μM和48 h,此時細(xì)胞的存活率是47.57%。在明確了損傷條件后,進(jìn)一步探討了魚藤酮損傷PC12細(xì)胞的作用機(jī)制。以往研究表明,魚藤酮與線粒體具有較高親和力,能夠選擇性抑制線粒體復(fù)合物I,進(jìn)而影響線粒體功能和細(xì)胞存活[7]。線粒體膜電位的缺失在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用,本研究應(yīng)用熒光探針JC-1指示線粒體膜電位水平,圍繞線粒體功能,考察了2μM魚藤酮對多巴胺神經(jīng)細(xì)胞線粒體的膜電位及能量代謝的影響。結(jié)果顯示,魚藤酮顯著降低線粒體膜電位和ATP含量。線粒體膜電位是反映線粒體功能的重要指標(biāo),膜電位的改變影響質(zhì)子泵功能,進(jìn)而影響ATP的生成。近年來,線粒體功能障礙與氧化應(yīng)激在PD病理機(jī)制研究中備受關(guān)注。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧自由基的主要來源。線粒體消耗了細(xì)胞內(nèi)85%~90%的氧,用以支持氧化磷酸化ATP合成,在這個過程中產(chǎn)生了大量的氧自由基。在生理狀態(tài)下,ROS產(chǎn)生與清除可以達(dá)到動態(tài)平衡。但線粒體損傷時,平衡會被打破,大量的ROS攻擊DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì),導(dǎo)致線粒體功能障礙,產(chǎn)生更多的氧自由基,造成惡性循環(huán)。通過檢測細(xì)胞內(nèi)ROS及ATP含量,可反映細(xì)胞氧化應(yīng)激及能量代謝水平。在本研究中,魚藤酮能夠引起氧化應(yīng)激,與以往報道[8]一致,本研究還發(fā)現(xiàn),2μM魚藤酮處理PC12細(xì)胞,ROS的含量顯著升高的時間點為共孵育5 h,該時間點早于線粒體功能障礙的時間,故魚藤酮引起的氧化應(yīng)激可能是引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要途徑。

    線粒體是糖、脂肪和氨基酸最終氧化的場所。其主要功能是氧化磷酸化合成ATP,為生命活動提供能量,為了驗證魚藤酮對線粒體的直接影響,本研究以大鼠腦線粒體為研究對象,采用Clark氧電極法,直接測定魚藤酮對線粒體呼吸功能的改變。在NADH呼吸鏈啟動的條件下,與對照組相比,魚藤酮組V3、V4、RCR均顯著降低。RCR值可以反映線粒體的結(jié)構(gòu)及功能的完整性,比值越大,表明線粒體結(jié)構(gòu)越完整,而損傷的線粒體RCR值可低至1。研究結(jié)果驗證了魚藤酮直接損傷大鼠腦線粒體,使呼吸效率顯著下降。

    線粒體功能障礙是PD發(fā)病機(jī)制學(xué)說之一,以線粒體為靶點,篩選PD治療藥物已經(jīng)成為一種新策略[9]。本研究表明魚藤酮在細(xì)胞和腦組織水平可以不同程度的損傷線粒體,引起DA能神經(jīng)元氧化應(yīng)激及降低細(xì)胞存活率。該結(jié)果為建立魚藤酮誘導(dǎo)的體外PD模型,深入研究PD病理機(jī)制、篩選候選藥物,實現(xiàn)精準(zhǔn)的靶向治療提供了實驗依據(jù)。

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