正交試驗(yàn)與響應(yīng)面法優(yōu)選六月雪-草藥對(duì)提取工藝比較*

范 玲，王 鑫△，胡風(fēng)華，金慶江，尹 浩，駱建平，薛 毅

（1.江蘇省蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 蘇州 215101； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇 南京 225300）

糖尿病腎病是導(dǎo)致慢性腎臟病的第二位原因［1］，糖代謝紊亂是其主導(dǎo)因素［2］。中醫(yī)認(rèn)為，脾腎受損、氣陰兩傷、虧虛不足、脈絡(luò)瘀阻是糖尿病腎病的主要病因病機(jī)，常以補(bǔ)腎健脾、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀通絡(luò)的藥物進(jìn)行調(diào)理。六月雪-草是蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院金慶江主任中醫(yī)師治療糖尿病腎病的經(jīng)典藥對(duì)，六月雪始載于《本草拾遺》，來源于茜草科植物小灌木白馬骨Serissa serissoides（DC.）Druce的全草或根，性涼，味苦、微辛，歸肺、脾、肝、胃經(jīng)［3］。六月雪含揮發(fā)油類［4］、醌類［5］、木脂素類［6］、萜類［7］、黃酮類［8］等化學(xué)成分，具有抗病毒、抑菌等藥理作用。草始載于《新修本草》，來源于?？撇輰俨軭umulus scandens.（Lour.）Merr.的全草，性寒，味甘、苦，歸肺、腎經(jīng)［9］。草含黃酮類、甾體類［10］等多種化學(xué)成分，有治療急慢性腎炎、抗菌、抗炎等藥理作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，六月雪能改善機(jī)體對(duì)抗原的清除作用，對(duì)受損的腎小球基底膜有一定修復(fù)作用，而草有治療腎炎的作用，二者相須，聯(lián)用效果更甚。本研究中探討了六月雪-草藥對(duì)的提取工藝，旨在為該藥對(duì)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測(cè)器、Chemstation色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；FA2004型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；GM-0.33A型隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；B-260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DW-2型調(diào)溫電熱套（通州市張芝山鎮(zhèn)決心化工電器廠）。

1.2 試藥

木犀草苷對(duì)照品（西安菲德生物科技有限公司，批號(hào)為19070302，含量為99.40%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水；六月雪、草藥材均購(gòu)于蘇州天靈中藥飲片有限公司，經(jīng)蘇州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院于棟偉主任中藥師鑒定為正品。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2 方法與結(jié)果

2.1 木犀草苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18柱（150 mm×2.1 mm，4μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（17∶83，V／V）；流速：1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

取木犀草苷對(duì)照品3.0 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得對(duì)照品溶液。分別稱取六月雪10 g、草5 g，回流提取，濾過，合并濾液，濃縮后作提取液。精密量取樣品溶液10 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。稱取六月雪藥材10 g，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取2.1.2項(xiàng)下3種溶液各適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置處有吸收峰，陰性對(duì)照無干擾。理論板數(shù)按木犀草苷峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。見圖1。

線性關(guān)系考察：精密量取2.1.2項(xiàng)下木犀草苷對(duì)照品溶液適量，加流動(dòng)相制成質(zhì)量濃度分別為6，12，15，24，30μg／mL的系列對(duì)照品溶液，置容量瓶中。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝22.34X＋17.65，r＝0.999（n＝5）。結(jié)果表明，木犀草苷質(zhì)量濃度在6～30μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

檢測(cè)限和定量限確定：取2.1.2項(xiàng)下木犀草苷對(duì)照品溶液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以信噪比（S／N）為3∶1的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限，S／N為10∶1時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果檢測(cè)限和定量限分別為0.603 2μg／mL和2.084 9μg／mL。

精密度試驗(yàn)：精密量取已知含量（15μg／mL）的對(duì)照品溶液10μL，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果的RSD為0.36%（n＝6），表明該方法日內(nèi)精密度良好。于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣2次，連續(xù)3 d，測(cè)定峰面積，結(jié)果的RSD為0.98%（n＝6），表明該方法日間精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，室溫下分別放置0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果的RSD為1.87%（n＝6），表明室溫下供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一供試品溶液6份，依法制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.52%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知質(zhì)量濃度的供試品溶液（木犀草苷質(zhì)量濃度為11.57μg／mL）6份，每份10 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ?，分別精密量取10 mL，各加入0.12 mg木犀草苷對(duì)照品。經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過。按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表1。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以加水倍數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）及提取次數(shù)（C）為考察因素，以木犀草苷提取綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選木犀草苷的提取工藝。因素與水平見表2。藥對(duì)中六月雪草比例為2∶1，即六月雪10 g、草5 g。試驗(yàn)過程中煎煮時(shí)使用電熱套加熱圓底燒瓶?jī)?nèi)回流提取，整個(gè)過程水分不流失。最后以木犀草苷轉(zhuǎn)移率及水煎液浸膏得率的綜合評(píng)分進(jìn)行分析，綜合評(píng)分＝木犀草苷轉(zhuǎn)移率／木犀草苷轉(zhuǎn)移率的最大值×70＋浸膏得率／浸膏得率的最大值×30。其中木犀草苷轉(zhuǎn)移率（%）＝提取液中木犀草苷含量×100%／按藥典測(cè)定的飲片中木犀草苷含量；浸膏得率（%）＝L×（m2-m1）／5×1／m×100%。L為煎煮后提取液總體積（mL），m2為含提取液的蒸發(fā)皿的質(zhì)量（g），m1為蒸發(fā)皿凈質(zhì)量（g），m為煎煮飲片總質(zhì)量（g）。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

由表3可見，各因素對(duì)試驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)的影響強(qiáng)度高低順序?yàn)镃＞B＞A；由表4可見，因素C對(duì)檢測(cè)結(jié)果有顯著影響。提取次數(shù)是影響綜合評(píng)分的關(guān)鍵因素。分析得到的六月雪-草藥對(duì)的最優(yōu)提取工藝條件為A2B3C3，即加15倍水，提取3次，每次提取1.5 h。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.2 The factors and levels of the orthogonal test

表3 L 9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Design and results of the L 9（34）orthogonal test

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.4 ANOVA results of the orthogonal test

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

以最優(yōu)提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得綜合評(píng)分的平均值為91.36分，RSD為0.97%，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，表明此提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、結(jié)果與分析

依照Box Behnken響應(yīng)面法的設(shè)計(jì)原理，利用Design Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)了以加水倍數(shù)（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取次數(shù)（因素C）為自變量，以木犀草苷轉(zhuǎn)移率及提取液的浸膏得率的綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，進(jìn)行三因素、三水平響應(yīng)面法試驗(yàn)。因素及水平見表5，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表6，模型分析及方差分析結(jié)果見表7。

進(jìn)行多元回歸擬合分析，得綜合評(píng)分對(duì)3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為R1＝82.92＋7.94 A＋0.39B＋21.81 C-5.13 AB＋2.75 AC-1.48 BC-11.93 A2-1.78B2-9.21 C2。由表6可知，加水倍數(shù)和提取次數(shù)對(duì)水煎液提取的影響極顯著，而交互項(xiàng)（AB，AC，BC）均無顯著影響。二次項(xiàng)中，A2及C2對(duì)水煎液提取的影響極顯著。模型決定系數(shù)R2為0.938 0，模型的失擬項(xiàng)F＝6.26，顯著性水平P＝0.054 3＞0.05，失擬項(xiàng)并不顯著，表明此模型擬合效果好，可很好地反映綜合評(píng)分與3個(gè)因素的關(guān)系。綜上所述，對(duì)綜合評(píng)分影響強(qiáng)弱順序?yàn)镃＞A＞B。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.5 The factors and levels of the response surface methodology

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Tab.6 Design and results of the response surface methodology

表7 模型分析及方差分析結(jié)果Tab.7 Results of model analysis and ANOVA

2.3.2 響應(yīng)面圖分析

響應(yīng)面三維圖［11］見圖2。

由圖2 A可見，提取時(shí)間為0.5～1.0 h時(shí)，綜合評(píng)分隨著加水倍數(shù)的增大而逐漸升高，當(dāng)提取時(shí)間超過1 h時(shí)，綜合評(píng)分隨加水倍數(shù)的變化而呈緩慢升高-降低的趨勢(shì)；加水倍數(shù)為10～15倍時(shí)，綜合評(píng)分隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)而呈明顯升高趨勢(shì)，而當(dāng)加水倍數(shù)超15倍時(shí)，綜合評(píng)分隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高-降低趨勢(shì)。

由圖2 B可見，加水倍數(shù)和提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響較大。當(dāng)加水倍數(shù)為10～15倍時(shí)，綜合評(píng)分隨提取次數(shù)的增加而顯著升高；提取次數(shù)為1～2次時(shí)，綜合評(píng)分隨加水倍數(shù)的增加而升高，提取次數(shù)超過2次時(shí)，綜合評(píng)分隨加水倍數(shù)的增加而呈緩慢升高-降低的趨勢(shì)。

由圖2 C可見，響應(yīng)曲面圖所呈現(xiàn)的曲面較平滑，表示此交互項(xiàng)的作用并不明顯，但也有一定協(xié)同作用。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為保證試驗(yàn)的可行性，將上述工藝條件修正為：加18倍水，提取3次，每次0.8 h。按此條件進(jìn)行電熱套加熱圓底燒瓶?jī)?nèi)回流提取六月雪-草藥對(duì)中木犀草苷試驗(yàn)和浸膏試驗(yàn)，實(shí)測(cè)綜合評(píng)分平均值為97.56分，RSD為1.24%，數(shù)據(jù)穩(wěn)定，且與預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差較小，表明建立的模型和實(shí)際情況基本吻合。

2.4 浸膏得率

取供試品溶液分別精密量取5mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿，水浴蒸干。再于105℃干燥3h，立即置干燥器中靜置冷卻30min。然后迅速精密稱量，記錄，并計(jì)算浸膏得率。

2.5 兩種試驗(yàn)方法比較

由前文可知，按最優(yōu)工藝條件提取時(shí)，響應(yīng)面法所得綜合評(píng)分高于正交試驗(yàn)法。正交試驗(yàn)中，3個(gè)因素中僅提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分有顯著影響（P＜0.05），在響應(yīng)面法中提取次數(shù)和加水倍數(shù)均對(duì)綜合評(píng)分有顯著影響。表明響應(yīng)面法相對(duì)更能體現(xiàn)多因素與響應(yīng)值間的關(guān)系。

正交試驗(yàn)法相較于響應(yīng)面法，試驗(yàn)組數(shù)少，更簡(jiǎn)單易行，但有一定局限性；響應(yīng)面法試驗(yàn)組數(shù)較多，但更加精確，三維圖分析更直觀，預(yù)測(cè)能力更強(qiáng)，得率也更高。響應(yīng)面法依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果擬合出模型來進(jìn)行工藝優(yōu)化，是在一個(gè)連續(xù)區(qū)域內(nèi)篩選的最優(yōu)方案，這可能是響應(yīng)面法與正交試驗(yàn)法相比更能精確地優(yōu)化提取工藝的原因［12］。但響應(yīng)面法需通過更多試驗(yàn)組合來進(jìn)行模型擬合及響應(yīng)值預(yù)測(cè)，其工作量要遠(yuǎn)大于正交試驗(yàn)法［13］。因此，對(duì)于影響因素較少且不需太精確的工藝可使用正交試驗(yàn)法進(jìn)行優(yōu)選，但對(duì)于影響因素較多且各因素間關(guān)系較復(fù)雜的工藝則建議使用響應(yīng)面法試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

3 討論

圖2 綜合評(píng)分影響因素三維圖Fig.2 Three dimensional diagram of comprehensive score of influencing factors

與正交試驗(yàn)法相比，響應(yīng)面法綜合評(píng)分更高，更適用于優(yōu)化六月雪-草藥對(duì)的提取工藝。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，六月雪-草藥對(duì)提取液的浸膏得率和木犀草苷的含量穩(wěn)定、重復(fù)性好，本研究為六月雪-草藥對(duì)的進(jìn)一步研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。