加減駐景方對脈絡(luò)膜新生血管動物模型缺氧信號因子表達(dá)的影響

陶方方，亢澤峰，陳水齡，褚文麗，劉健，周志豪

加減駐景方[1]是治療年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration,AMD）和病理性近視等伴有脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）眼底疾病的經(jīng)驗(yàn)用方，臨床治療有效，其作用機(jī)制尚不清晰，本研究采用組織學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)檢測CNV 動物模型中雷帕霉素靶蛋白（mammal target of rapamycin,mTOR）信號通路相關(guān)因子活性，探 討 蛋 白 激 酶B（protein kinase B,PKB,AKT）/mTOR/缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor,HIF-1α）/血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelium growth factor,VEGF）信號通路在CNV 形成中的作用，從而揭示加減駐景方抑制CNV 的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

8 周齡雄性SPF 級棕色挪威（brown norway，BN）大鼠138 只，體重180～220 g，購買于北京市維通利華公司。動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)前，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 試劑與儀器

PCR 儀（Biometra,TProfessional ThermoCycler），全自動熒光定量PCR 儀（7500,ABI）。SP-9000 試劑盒（中杉金橋），AKT、VEGF（Cell Signaling Technology），mTOR、HIF-1α（Abcam），cDNA 第一鏈合成試劑盒（Thermo Scientific,K1622）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

大鼠任一只眼為實(shí)驗(yàn)眼，行激光造模，每只眼光凝8～10 個點(diǎn)。激光功率360 mW，光斑直徑50 μm，曝光時間0.05 s。按隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的大鼠分為模型組、中藥組、西藥組、聯(lián)合組，各30 只。

空白組：18 只大鼠，正常飼養(yǎng)，不做特殊處理。

模型組：光凝后第1d 予生理鹽水灌胃，每日1 次，共21 d。

中藥組：光凝后第1 d 予中藥灌胃，每日1 次，共21 d。中藥加減駐景方由楮實(shí)子、枸杞子、菟絲子、五味子、茺蔚子、三七粉、桂枝、茯苓、三棱、郁金、生黃芪和當(dāng)歸等多種藥物組成，給藥中藥濃度為0.775 g/ml，灌胃量10 ml/kg。

西藥組：光凝后第1 d 予玻璃體腔注射康柏西普（Conbercept），共計(jì)1 次。康柏西普，成都康鴻藥業(yè)，規(guī)格10 mg/ml，微量注射器玻璃體腔注射5 μl。

聯(lián)合組：光凝后第1 d 予中藥灌胃（同中藥組），每日1 次，共21 d，光凝后第1 d 予玻璃體腔注射康柏西普（同西藥組），共計(jì)1 次。

1.4 免疫組織化學(xué)法檢測AKT、mTOR、HIF-1α 和VEGF

模型組和各治療組在光凝后第7 d、14 d、21 d各處死6 只大鼠取材?？瞻捉M在光凝后21 d 處死取材。制作組織切片，行免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片脫蠟至水；PBS 洗滌5 min，3 次；抗原修復(fù)；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，10 min；1%Triton-100，室溫1 h;試劑A，室溫30 min；滴加稀釋后的一抗，陰性對照用PBS 溶液代替，4°C 過夜；試劑B，室溫下孵育30 min；試劑C，室溫下孵育10 min；DAB 染色；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染1 min，鹽酸酒精分化30 s，氨水返藍(lán)30 s；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干；光學(xué)顯微鏡拍攝照片。一抗稀釋倍數(shù)：AKT（1：100）；mTOR（1：200）;HIF-1α（1：200）；VEGF（1：100）。

1.5 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測AKT、mTOR、HIF-1α 和VEGF 的mRNA 表達(dá)

采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）技術(shù)，光凝后21 d，每組各處死6 只大鼠獲取眼杯，參照試劑盒方法用Trizol 一步法裂解組織，提取總RNA，按照試劑盒說明書，合成cDNA。配制反應(yīng)體系如下：RealMasterMix 和SYBR 混合物10μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA 1 μl，超純水定容至20 μl，進(jìn)行PCR 循環(huán)，95℃預(yù)變性10 min；95℃變性20 s、60℃退火30 s、68℃延伸60 s；循環(huán)40 次。引物由北京科悅達(dá)生物科技有限公司合成（表1）。

1.6 蛋白免疫印跡技術(shù)檢測目的蛋白表達(dá)

采用蛋白免疫印跡（western blotting）技術(shù)檢測目的蛋白表達(dá)，光凝后21 d，每組各處死6 只大鼠獲取眼杯，獲取蛋白質(zhì)樣品，測定總蛋白濃度，SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，起始電壓設(shè)定為80 V，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠時，調(diào)整電壓至120 V，繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)跑至底部時，結(jié)束電泳。轉(zhuǎn)膜；5%脫脂牛奶封閉，室溫?fù)u床孵育2 h；一抗4℃孵育過夜；1：5000 稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h；顯影液顯影。

1.7 圖像分析方法

每組選取15 張包含CNV 的免疫組化圖像，Image Pro Plus 6.0 軟件分析圖像的平均光密度值（average optical density,AOD）值作為半定量測定陽性表達(dá)物的依據(jù)。用空白組目的基因與內(nèi)參GAPDH的相對表達(dá)量進(jìn)行校正，得到空白組目的基因mRNA 相對表達(dá)量為1 時，實(shí)驗(yàn)組目的基因mRNA 表達(dá)量是空白組的倍數(shù)。將“2-ΔΔCt”視為各目的基因mRNA 的相對表達(dá)量。使用Quantity One 分析軟件測定條帶光密度值，以GAPDH 條帶的光密度值校正，目的蛋白的相對表達(dá)量以目的基因條帶的光密度值與GAPDH 條帶的光密度值之比來表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用方差分析中LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05 時，則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 AKT 空白組大鼠視網(wǎng)膜組織中可見AKT 表達(dá)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見陽性反應(yīng)物。模型組和各治療組視網(wǎng)膜光凝區(qū)CNV 組織中AKT 表達(dá)均呈強(qiáng)陽性，CNV 組織中可見大量黃棕色陽性反應(yīng)物。模型組和聯(lián)合組AKT 表達(dá)量在光凝后7 d 時最大，21 d時緩慢減少（P＜0.05）；中藥組和西藥組AKT 表達(dá)量在光凝后14 d 時最大，21 d 時顯著減少（P＜0.05）。

光凝后7 d，各治療組AKT 表達(dá)量均低于模型組，中藥組AKT 表達(dá)量高于西藥組與聯(lián)合組（P＜0.05），西藥組與聯(lián)合組無明顯差異（P＞0.05）。光凝后14 d 與21 d，各治療組AKT 表達(dá)量均低于模型組，聯(lián)合組AKT 表達(dá)量最低，西藥組次之，西藥組AKT 表達(dá)量低于中藥組（P＜0.05）（表2，圖1）。

2.1.2 mTOR 空白組BN 大鼠視網(wǎng)膜組織中可見mTOR 表達(dá)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見少量陽性反應(yīng)物。模型組和各治療組CNV 組織中mTOR 呈強(qiáng)陽性表達(dá)，CNV 組織中可見大量黃棕色陽性反應(yīng)物。模型組、中藥組和聯(lián)合組mTOR 表達(dá)量在光凝后7 d 時最大，21 d 時顯著減少（P＜0.05）。西藥組mTOR 表達(dá)量在光凝后14 d 時最大，21 d 時顯著減少（P＜0.05）。

表1 RT-qPCR 引物序列

表2 光凝后不同時間各組AKT 的AOD 值變化（，n=15）

表2 光凝后不同時間各組AKT 的AOD 值變化（，n=15）

注：※ 與同時間段模型組比較，P＜0.05；# 與同時間段中藥組比較，P＜0.05；&與同時間段西藥組比較，P＜0.05；* 與同時間段聯(lián)合組比較，P＜0.05

光凝后7 d，西藥組與聯(lián)合組mTOR 表達(dá)量均低于模型組和中藥組（P＜0.05），中藥組與模型組無明顯差異（P＞0.05）。光凝后14 d 與21 d，各治療組mTOR 表達(dá)量均低于模型組，聯(lián)合組mTOR 表達(dá)量最低，西藥組次之，西藥組mTOR 表達(dá)量低于中藥組（表3，圖2）。

表3 光凝后不同時間各組mTOR 的AOD 值變化（，n=15）

表3 光凝后不同時間各組mTOR 的AOD 值變化（，n=15）

注：※ 與同時間段模型組比較，P＜0.05；# 與同時間段中藥組比較，P＜0.05；&與同時間段西藥組比較，P＜0.05；* 與同時間段聯(lián)合組比較，P＜0.05

圖1 AKT 免疫組化圖像（DAB 染色，×400）。1A 空白組，正常BN 大鼠視網(wǎng)膜組織中AKT 呈陽性表達(dá)。1B 7 d 模型組；1C 7 d 中藥組；1D 21 d 中藥組；1E 7 d 西藥組；1F 21 d 西藥組；1G 7 d 聯(lián)合組；1H 21 d 聯(lián)合組。模型組和各治療組CNV 中AKT 呈強(qiáng)陽性表達(dá)

圖2 mTOR 免疫組化圖像（DAB 染色，×400）。2A 空白組，正常BN 大鼠視網(wǎng)膜組織中mTOR 呈陽性表達(dá)；2B 7 d 模型組；2C 7 d 中藥組；2D 21 d 中藥組；2E 7 d 西藥組；2F 21 d 西藥組；2G 7 d 聯(lián)合組；2H 21 d 聯(lián)合組。模型組和各治療組CNV 中mTOR 呈陽性表達(dá)

2.1.3 HIF-1α 空白組BN 大鼠視網(wǎng)膜組織中可見HIF-1α 表達(dá)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見陽性反應(yīng)物。模型組和各治療組CNV 組織中HIF-1α 呈陽性表達(dá)，CNV 組織中可見大量黃棕色陽性反應(yīng)物。模型組、中藥組和聯(lián)合組HIF-1α 表達(dá)量在光凝后14 d時最大，21 d 時顯著減少（P＜0.05）。西藥組HIF-1α表達(dá)量在光凝后不同時間無明顯變化（P＞0.05）。

光凝后7 d，西藥組與聯(lián)合組HIF-1α 表達(dá)量均低于模型組和中藥組（P＜0.05），中藥組與模型組無明顯差異（P＞0.05）。光凝后14 d，各治療組HIF-1α表達(dá)量均低于模型組，西藥組HIF-1α 表達(dá)量最低，聯(lián)合組次之，聯(lián)合組HIF-1α 表達(dá)量低于中藥組（P＜0.05）。光凝后21 d，各治療組HIF-1α 表達(dá)量均低于模型組，聯(lián)合組HIF-1α 表達(dá)量最低，西藥組次之，西藥組HIF-1α 表達(dá)量低于中藥組（P＜0.05）（表4，圖3）。

表4 光凝后不同時間各組HIF-1α 的AOD 值變化（，n=15）

表4 光凝后不同時間各組HIF-1α 的AOD 值變化（，n=15）

注：※ 與同時間段模型組比較，P＜0.05；# 與同時間段中藥組比較，P＜0.05；&與同時間段西藥組比較，P＜0.05；* 與同時間段聯(lián)合組比較，P＜0.05

2.1.4 VEGF 空白組BN 大鼠視網(wǎng)膜組織中可見VEGF 表達(dá)，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見少量陽性反應(yīng)物。模型組和各治療組CNV 組織中VEGF 呈陽性表達(dá)，CNV 組織中可見大量黃棕色陽性反應(yīng)物。模型組和中藥組VEGF 表達(dá)量在光凝后7 d 時最大，隨后逐漸減少（P＜0.05）。西藥組VEGF 表達(dá)量在光凝后7 d 時最大，21 d 時顯著減少（P＜0.05）。聯(lián)合組VEGF 表達(dá)量在光凝后7 d 時最大，14 d 時顯著減少，21 d 較14 d 有明顯增加（P＜0.05）。

光凝后7d、14d 與21d，各治療組VEGF 表達(dá)量均低于模型組，聯(lián)合組VEGF 表達(dá)量最低，西藥組次之，西藥組VEGF 表達(dá)量低于中藥組（P＜0.05）（表5，圖4）。

表5 光凝后不同時間各組VEGF 的AOD 值變化（，n=15）

表5 光凝后不同時間各組VEGF 的AOD 值變化（，n=15）

注：※ 與同時間段模型組比較，P＜0.05；# 與同時間段中藥組比較，P＜0.05；&與同時間段西藥組比較，P＜0.05；* 與同時間段聯(lián)合組比較，P＜0.05

2.2 RT-qPCR 檢測mRNA 相對表達(dá)量

模型組與治療組各目的基因mRNA 相對表達(dá)量較空白組均有明顯增多（P＜0.05）。除mTOR 以外，各治療組目的基因mRNA 相對表達(dá)量均低于模型組（P＜0.05），中藥組mTOR mRNA 相對表達(dá)量與模型組無明顯差異（P＞0.05）。各治療組AKT、mTOR 和VEGF mRNA 相對表達(dá)量由高到低依次為中藥組、西藥組和聯(lián)合組（P＜0.05）。中藥組HIF-1α mRNA相對表達(dá)量高于西藥組和聯(lián)合組（P＜0.05），西藥組和聯(lián)合組之間無明顯差異（P＞0.05）（表6）。

圖3 HIF-1α 免疫組化圖像（DAB 染色，×400）。3A 空白組，正常BN 大鼠視網(wǎng)膜組織中HIF-1α 呈陽性表達(dá)；3B 7 d 模型組；3C 7 d 中藥組；3D 21 d 中藥組；3E 7 d 西藥組；3F 21 d 西藥組；3G 7 d 聯(lián)合組；3H 21 d 聯(lián)合組。模型組和各治療組CNV 中HIF-1α 呈陽性表達(dá)

圖4 VEGF 免疫組化圖像（DAB 染色，×400）。4A 空白組，正常BN 大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF 呈陽性表達(dá)；4B 7 d 模型組；4C 7 d 中藥組；4D 21 d 中藥組；4E 7 d 西藥組；4F 21 d 西藥組；4G 7 d 聯(lián)合組；4H 21 d 聯(lián)合組。模型組和各治療組CNV 中VEGF 呈陽性表達(dá)

表6 AKT、mTOR、HIF-1α 與VEGF mRNA 相對表達(dá)量δ（，n=9）

表6 AKT、mTOR、HIF-1α 與VEGF mRNA 相對表達(dá)量δ（，n=9）

注：δ 空白組設(shè)為1，其他組與其相除獲得相對值；※ 與模型組比較，P＜0.05；# 與中藥組比較，P＜0.05；&與西藥組比較，P＜0.05；* 與聯(lián)合組比較，P＜0.05

2.3 Western blotting 檢測蛋白相對表達(dá)量

模型組和治療組各目的蛋白相對表達(dá)量較空白組均有明顯增多（P＜0.05）。模型組、中藥組AKT 蛋白相對表達(dá)量較西藥組、聯(lián)合組高（P＜0.05）。除AKT蛋白以外，各治療組目的蛋白相對表達(dá)量均低于模型組（P＜0.05）。各治療組mTOR 與VEGF 蛋白相對表達(dá)量由高到低依次為中藥組、西藥組和聯(lián)合組（P＜0.05）。HIF-1α 蛋白相對表達(dá)量中藥組較高（P＜0.05），西藥組與聯(lián)合組無明顯差異（P＞0.05）（表7，圖5）。

表7 AKT、mTOR、HIF-1α 與VEGF 蛋白相對表達(dá)量δ（，n=9）

表7 AKT、mTOR、HIF-1α 與VEGF 蛋白相對表達(dá)量δ（，n=9）

注：δ 內(nèi)參GAPDH 設(shè)為1，其他組與其相除獲得相對值；Δ 與空白組比較，P＜0.05；※ 與模型組比較，P＜0.05；# 與中藥組比較，P＜0.05；&與西藥組比較，P＜0.05；* 與聯(lián)合組比較，P＜0.05

圖5 Western blotting 圖像。1～5 依次為空白組、模型組、中藥組、西藥組和聯(lián)合組

3 討論

CNV 是AMD、病理性近視等多種嚴(yán)重?fù)p害視功能眼病的共同病理產(chǎn)物，其病因尚不十分明確，治療棘手。CNV 的形成與VEGF、白細(xì)胞介素-6 等多種細(xì)胞因子的作用有關(guān)，其中AKT/mTOR/HIF-1α是調(diào)控VEGF 表達(dá)的主要信號通路之一[2]。

VEGF 是目前已知促進(jìn)CNV 生成最關(guān)鍵的因子，VEGF-A 是最重要的家族成員，以往稱為VEGF，主要高表達(dá)于有新生血管的組織與細(xì)胞中，如腫瘤組織、缺血缺氧性眼病組織、胎兒組織等，而在正常人與動物組織中低表達(dá)。VEGF-A 不僅可以有選擇的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、移行，誘導(dǎo)毛細(xì)血管形成來促進(jìn)新生血管的生成[3]，還可以增加微小血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)形成，為新生血管的形成提供營養(yǎng)[4]，促進(jìn)血管形成。

PI3K/AKT/mTOR 信號通路是內(nèi)皮細(xì)胞中調(diào)控HIF-1α mRNA 翻譯的關(guān)鍵信號通路[5-6]，生長因子、缺氧等因素可以激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路[7]，促使HIF-1α 蛋白表達(dá)的上調(diào)，HIF-1 與靶基因的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，如VEGF，從而激活VEGF mRNA 的轉(zhuǎn)錄[2,8-10]，進(jìn)而激活VEGF 的表達(dá)，使內(nèi)皮細(xì)胞遷移促進(jìn)CNV 的形成。本研究中，模型組表達(dá)的AKT、mTOR、HIF-1α、VEGF 蛋白及mRNA 較空 白組均有顯著增強(qiáng)。氪激光誘導(dǎo)的BN 大鼠CNV 模型中，AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信號通路的激活促進(jìn)了CNV 的生成。

加減駐景方是亢澤峰教授治療AMD 和病理性近視等伴有CNV 眼底疾病的經(jīng)驗(yàn)用方，亢教授將AMD 歸為中醫(yī)眼科“瞳神絡(luò)病”的范疇[11-12]。清代名醫(yī)葉天士[13]有言：“久病必治絡(luò)—病久氣血推行不利，血絡(luò)之中必有瘀凝，故致病氣纏延不去，必疏其絡(luò)而病氣可盡也”。王清任[14]認(rèn)為：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”?？航淌谡J(rèn)為，本病病機(jī)主要為肝腎不足，兼具氣血津液功能障礙，表現(xiàn)為瘀、痰、濕的本虛標(biāo)實(shí)證，治以補(bǔ)腎明目、活血通絡(luò)為要則，輔以利水滲濕、止血活血、益氣養(yǎng)血、溫陽通絡(luò)之藥。因此，組成了以“補(bǔ)腎明目、益氣活血、化瘀通絡(luò)”為治則的加減駐景方。

方中菟絲子補(bǔ)腎益精，養(yǎng)肝明目，為平補(bǔ)陰陽之品，善滋補(bǔ)肝腎、益精養(yǎng)血而明目，《神農(nóng)本草經(jīng)》[15]言：“久服明目”。枸杞子，為平補(bǔ)腎精肝血之品，與菟絲子合用，常用于肝腎陰虛之內(nèi)障目昏，共為君藥。五味子酸咸，斂肺金滋腎水；楮實(shí)子，益精強(qiáng)陰；黃芪甘溫，益氣健脾補(bǔ)中，伍以甘溫之當(dāng)歸，湊健脾益氣補(bǔ)血之效，目得血而能視；以上共助君藥補(bǔ)益肝腎、益氣養(yǎng)血明目而為臣。三七，活血通竅。郁金，活血行氣，通利玄府清竅，又制臣藥之溫燥。三棱，破血行氣，《神農(nóng)本草經(jīng)疏》[16]曰：“從血藥則治血，從氣藥則治氣”，三者相合，散瘀行氣之力著。茯苓，滲濕健脾，消痰利水。合芪、歸，能補(bǔ)益心脾，使血行暢通、生血有源，又可防諸藥滋膩，合于桂枝，溫通血脈，化氣利水，共達(dá)行瘀利水之效。以上共為佐藥，減君臣藥之滋膩，又奏氣滯血瘀之效，使水行、絡(luò)脈通，減輕痰濕、血瘀等“邪阻”之證。加減駐景方中多種藥物具有耐缺氧、增加血流量、降低血管阻力、抑制VEGF表達(dá)等作用。如菟絲子具有增加冠狀動脈血流量與降低血管阻力作用[17]，枸杞多糖有耐缺氧作用[18]，三棱含藥血清有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VEGF 的作用[19]。

本研究中，各治療組均有抑制AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信號通路活性的作用。西藥組與聯(lián)合組對AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信號通路活性的抑制作用強(qiáng)于中藥組，加減駐景方通過降低AKT/mTOR/HIF-1α/VEGF 信號通路活性，發(fā)揮了抑制CNV 形成的作用，這可能與方藥中多種藥物耐缺氧、增加冠狀動脈血流量、抑制VEGF 表達(dá)的作用有關(guān)。