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    miR-1294靶向TRIM28調(diào)控葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制①

    2021-05-27 11:06:16王光進(jìn)何林波馮小梅西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院眼科瀘州646000
    中國免疫學(xué)雜志 2021年8期
    關(guān)鍵詞:葡萄膜黑色素瘤熒光素酶

    王光進(jìn) 何林波 馮小梅(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院眼科,瀘州 646000)

    葡萄膜黑色素瘤是眼部疾病中常見惡性腫瘤之一,患者接受手術(shù)摘除眼球治療后仍有大部分患者死亡[1-3]。目前葡萄膜黑色素瘤發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,因而探討葡萄膜黑色素瘤發(fā)病機(jī)制有助于提高該病的治療效果。微小RNA(microRNA,miR?NA)是一種非編碼單鏈小RNA分子,并可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過程而參與葡萄膜黑色素瘤等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程[4]。微小RNA-1294(mi?croRNA-1294,miR-1294)在上皮性卵巢癌中低表達(dá),上調(diào)miR-1294的表達(dá)可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖[5]。miR-1294在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào),miR-1294過表達(dá)可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖及遷移[6]。目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-1294與葡萄膜黑色素瘤之間的關(guān)系。StarBase預(yù)測顯示miR-1294與三結(jié)構(gòu)域蛋白28(tripartite motifcontain?ing protein 28,TRIM28)可能存在靶向調(diào)控關(guān)系,研究表明TRIM28在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào),敲低其表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及遷移[7]。但miR-1294是否靶向調(diào)控TRIM28而影響葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲尚未可知。本研究首次在體外研究miR-1294對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響,對探究葡萄膜黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制及提高臨床治療效果、改善患者預(yù)后均具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料 正常葡萄膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19購自南京科佰生物科技有限公司;葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5、MUM-2B、C918購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清均購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher公司;miR-1294模擬物(mimics)及其陰性對照(miR-NC)、TRIM28小干擾RNA(si-TRIM28)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-1294特異性寡核苷酸抑制劑(an?ti-miR-1294)及其陰性對照(anti-miR-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;甲基噻唑基四唑(methylthia?zolyl tetrazolium,MTT)購自重慶普立科生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司;Matri?gel基質(zhì)膠購自美國BD公司;蛋白裂解液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;二喹啉甲酸(bicincho?ninicacid,BCA)蛋白定量檢測試劑盒購自湖南艾佳生物科技股份有限公司;兔抗人細(xì)胞周期蛋白1(Cy?clinD1)、p21、p27抗體購自美國CST公司;兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶-14(matrix metalloprotein?ases-14,MMP-14)抗體均購自美國Santa Cruz公司;兔抗人TRIM28多克隆抗體購自北京博蕾德生物科技有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

    葡萄膜黑色素瘤組織與癌旁組織來源:選取2017年6月至2018年10月本院收集的26例葡萄膜黑色素瘤患者為研究對象,所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為葡萄膜黑色素瘤,其中男15例,女11例,年齡46~70歲,平均年齡(59.74±6.57)歲,術(shù)中切除葡萄膜黑色素瘤組織與癌旁組織,本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者知情并簽署同意書。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 正常葡萄膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19、葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5、MUM-2B、C918細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)條件:37℃、5%CO2培養(yǎng)箱,待細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%~90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),取第3~5代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組:miR-NC組(miR-NC轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞)、miR-1294組(miR-1294 mimics轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞)、si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞)、si-TRIM28組(si-TRIM28轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞)、miR-1294+pcDNA組(miR-1294 mimics與pcDNA共轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞)、miR-1294+pcDNA-TRIM28組(miR-1294 mimics與pcDNA-TRIM28共轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞),轉(zhuǎn)染過程均按照Lipofectamine2000試劑盒說明書進(jìn)行操作,轉(zhuǎn)染前1 h更換為不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染6 h后更換為含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞進(jìn)行功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。為驗(yàn)證miR-1294是否靶向調(diào)控TRIM28的表達(dá),取生長狀態(tài)良好的SP6.5細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分組miR-NC組、miR-1294組、anti-miR-NC組(anti-miRNC轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞)、anti-miR-1294組(anti-miR-1294轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞)。

    1.2.2 qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-1294、TRIM28 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取葡萄膜黑色素瘤組織與癌旁組織及細(xì)胞系總RNA,參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,miR-1294正向引物5′-TGTGTGC?CAAGATCTGTTCA-3′,反向引物:5′-AGTTTCACCTCACTGCGTCCT-3′;GAPDH正向引物5′-GGAGC?GAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向引物:5′-GGCT?GTTGTCATACTTCTCATGG-3′;TRIM28正向引物5′-AGCGGGTGAAGTACACCAAG-3′,反向引物:5′-ACCCAAAGCCATAGCCTTCC-3′;U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,反向引物:5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′,引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10μl,cDNA 2μl,上下游引物各0.8μl,ROX Reference Dye(50×)0.4μl,ddH2O 6μl;反應(yīng)條件:95℃2 min(循環(huán)1次),95℃30 s,60℃30 s,72℃30 s(循環(huán)40次)。TRIM28以GAPDH為內(nèi)參,miR-1294以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法 計(jì) 算miR-1294、TRIM28 mRNA相對表達(dá)量。

    1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖 取各組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞,采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸液后接種于96孔板,分別于轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h時(shí)每孔加入20μl MTT溶液,室溫孵育4 h,棄舊培養(yǎng)基,每孔加入150μl二甲基亞砜(di?methylsulfoxide,DMSO),充分混勻,應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處各孔吸光度值(OD),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 取對數(shù)生長期葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化,加入DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液(5×104個/ml),Transwell小室的上室中每孔加入200μl細(xì)胞懸液,Transwell小室的下室每孔加入600μl含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,PBS洗滌后采用多聚甲醛固定10 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min,采用棉簽擦拭未遷移細(xì)胞,置于顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

    1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 采用預(yù)冷培養(yǎng)液按照9:1比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠,Transwell小室上室中每孔加入40μl Matrigel稀釋液,室溫孵育5 h。取對數(shù)生長期葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌,0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液(5×104個/ml),Transwell小室的上室中每孔加入200μl單細(xì)胞懸液,Transwell小室的下室中每孔加入600μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,PBS洗滌,多聚甲醛固定10 min,0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min,使用棉簽擦拭未侵襲細(xì)胞,顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

    1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測StarBase預(yù)測顯示TRIM28的3′UTR中含有與miR-1294互補(bǔ)的核苷酸序列,利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,分別將含有TRIM28的3′UTR結(jié)合位點(diǎn)序列及突變位點(diǎn)序列載入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-TRIM28與突變型載體MUT-TRIM28,取生長狀態(tài)良好的葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞,分別 將WT-TRIM28、MUT-TRIM28與miR-NC、miR-1294 mimics共轉(zhuǎn)染至SP6.5細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞后檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

    1.2.7 Western blot檢測TRIM28、CyclinD1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá) 取各組對數(shù)生長期葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞,加入適量的蛋白裂解液,冰上裂解30 min后提取細(xì)胞總蛋白,應(yīng)用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAG-E)分離蛋白,反應(yīng)結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,室溫條件下孵育一抗稀釋液(TRIM28 1:500,CyclinD1 1:1 000,p21、p27 1:500,MMP-2、MMP-9、MMP-14 1:1 000),4℃孵育過夜,TBST洗滌,孵育二抗稀釋液(1:2 000),室溫孵育1 h,TBST洗滌,顯影,應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及Im?age J軟件分析各條帶灰度值。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤中的表達(dá) 與正常葡萄膜上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19相比,葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系SP6.5、MUM-2B、C918中miR-1294的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),TRIM28 mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),其中miR-1294在葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低,見圖1、表1。與瘤旁組織比較,葡萄膜黑色素瘤組織中miR-1294的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),TRIM28mRNA及蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見表2。因而選用葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

    圖1 TRIM28蛋白表達(dá)Fig.1 Protein expression of TRIM28

    表1 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)(±s,n=9)Tab.1 Expression of miR-1294 and TRIM28 in uveal mel-anoma cells(±s,n=9)

    表1 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)(±s,n=9)Tab.1 Expression of miR-1294 and TRIM28 in uveal mel-anoma cells(±s,n=9)

    Note:Compared with ARPE-19 group,1)P<0.05.

    TRIM28 protein 0.23±0.03 0.61±0.061)0.49±0.041)0.53±0.051)113.162 0.000 Groups ARPE-19 SP6.5 MUM-2B C918 F P miR-1294 1.00±0.09 0.34±0.031)0.56±0.051)0.41±0.041)241.167 0.000 TRIM28 mRNA 1.01±0.08 2.63±0.261)2.34±0.231)2.52±0.241)110.601 0.000

    表2 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤組織及瘤旁組織中的表達(dá)(±s,n=26)Tab.2 Expression of miR-1294 and TRIM28 in uveal mel-anoma and peritumoral tissues(±s,n=26)

    表2 miR-1294和TRIM28在葡萄膜黑色素瘤組織及瘤旁組織中的表達(dá)(±s,n=26)Tab.2 Expression of miR-1294 and TRIM28 in uveal mel-anoma and peritumoral tissues(±s,n=26)

    Note:Compared with peritumoral tissues group,1)P<0.05.

    TRIM28 mRNA 1.02±0.09 2.52±0.241)29.840 0.000 Groups Peritumoral tissues Uveal melanoma tissues t P miR-1294 0.98±0.09 0.25±0.021)40.374 0.000

    2.2 miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖的影響 與miR-NC組比較,miR-1294組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞中miR-1294的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05),CyclinD1蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05),p21、p27蛋白相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05),見圖2、表3。

    圖2 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 Proliferation-related proteins expressions

    表3 miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖的影響(±s,n=9)Tab.3 Effects of miR-1294 overexpression on proliferation of uveal melanoma cells SP6.5(±s,n=9)

    表3 miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖的影響(±s,n=9)Tab.3 Effects of miR-1294 overexpression on proliferation of uveal melanoma cells SP6.5(±s,n=9)

    Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05.

    OD(490 nm)Groups miR-1294 CyclinD1 p27 p21 0.29±0.03 0.68±0.051)20.065 0.000 24 h 0.39±0.04 0.36±0.03 1.800 0.090 48 h 0.73±0.06 0.45±0.041)11.648 0.000 72 h 1.14±0.09 0.58±0.051)16.317 0.000 miR-NC miR-1294 t P 1.00±0.08 2.36±0.231)16.754 0.000 0.76±0.07 0.31±0.031)17.726 0.000 0.25±0.03 0.63±0.061)16.994 0.000

    2.3 miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-1294組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05),MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05),見表4、圖3。

    表4 miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5遷移、侵襲的影響(±s,n=9)Tab.4 Effect of miR-1294 overexpression on migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5(±s,n=9)

    表4 miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5遷移、侵襲的影響(±s,n=9)Tab.4 Effect of miR-1294 overexpression on migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5(±s,n=9)

    Note:Compared with miR-NC group,1)P<0.05.

    MMP-14 protein 0.74±0.07 0.32±0.031)16.544 0.000 Groups miR-NC miR-1294 t P Number of migrating cells 106.54±9.36 49.87±4.581)16.315 0.000 Number of invasion cells 83.45±8.31 37.65±4.241)13.431 0.000 MMP-2 protein 0.67±0.03 0.25±0.031)29.698 0.000 MMP-9 protein 0.83±0.07 0.39±0.041)16.372 0.000

    圖3 miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5遷移、侵襲的影響Fig.3 Effects of miR-1294 overexpression on migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5Note:A.Transferring and invasion-related protein expression;B.Migra?tion and invasion of uveal melanoma cell SP6.5.

    2.4 干擾TRIM28表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較,si-TRIM28組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05),遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少(P<0.05),CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量均顯著降低(P<0.05),p21蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05),見圖4、表5。

    圖4 干擾TRIM28表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移、侵襲的影響Fig.4 Effect of interference with TRIM28 expression on proliferation,migration and invasion of uveal mela-noma cells SP6.5

    2.5 miR-1294靶向調(diào)控TRIM28的表達(dá)starBase預(yù)測顯示TRIM28的3′UTR中含有與miR-1294互補(bǔ)的核苷酸序列,見圖5A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染克隆有TRIM28-3′UTR突變型載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中,miR-1294組與miR-NC組比較,熒光素酶活性差異無顯著性(P>0.05);轉(zhuǎn)染克隆有TRIM28-3′UTR載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中,miR-1294組熒光素酶活性明顯低于miR-NC組(P<0.05),見表6。Western blot檢測結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,miR-1294組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞中TRIM28蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與anti-miR-NC組比較,antimiR-1294組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞中TRIM28蛋白相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05),見圖5B、表7。

    圖5 miR-1294靶向調(diào)控TRIM28的表達(dá)Fig.5 miR-1294 regulates expression of TRIM28

    圖6 TRIM28過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移侵襲的作用Fig.6 TRIM28 overexpression reversed effect of miR-1294 overexpression

    2.6 TRIM28過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移和侵襲的作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與miR-1294+pcDNA組比較,miR-1294+pcDNA-TRIM28組葡萄膜黑色素瘤SP6.5細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05),遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯增多(P<0.05),CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相對表達(dá)量均顯著升高(P<0.05),p21蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05),見圖6、表8。

    表5 干擾TRIM28表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移、侵襲的影響(±s,n=9)Tab.5 Effect of interference with TRIM28 expression on proliferation,migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5(±s,n=9)

    表5 干擾TRIM28表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移、侵襲的影響(±s,n=9)Tab.5 Effect of interference with TRIM28 expression on proliferation,migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5(±s,n=9)

    Note:Compared with si-NC group,1)P<0.05.

    OD(490 nm)Groups TRIM28 protein CyclinD1 protein p21 protein MMP-2 protein MMP-9 protein 24 h 48 h 72 h Number of migrating cells 0.40±0.04 0.38±0.03 1.200 0.247 si-NC si-TRIM28 t P 0.62±0.06 0.27±0.031)15.625 0.000 0.72±0.07 0.54±0.051)6.277 0.000 1.13±0.09 0.66±0.061)13.035 0.000 108.87±9.63 53.64±5.311)15.066 0.000 Number of in?vasion cells CyclinD1 protein 88.31±8.36 47.69±4.481)12.848 0.000 0.77±0.06 0.39±0.031)16.994 0.000 0.23±0.03 0.59±0.051)18.521 0.000 0.68±0.06 0.29±0.031)17.441 0.000 0.84±0.07 0.43±0.041)15.256 0.000

    表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s,n=9)Tab.6 Dual luciferase reporter experiment(±s,n=9)

    表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(±s,n=9)Tab.6 Dual luciferase reporter experiment(±s,n=9)

    Note:Compared with miR-NC,1)P<0.05.

    MUT-TRIM28 1.00±0.08 0.98±0.09 0.498 0.625 Groups miR-NC miR-1294 WT-TRIM28 1.02±0.09 0.41±0.041)18.580 0.000 t P

    表7 miR-1294調(diào)控TRIM28蛋白的表達(dá)(±s,n=9)Tab.7 miR-1294 regulates expression of TRIM28 protein(±s,n=9)

    表7 miR-1294調(diào)控TRIM28蛋白的表達(dá)(±s,n=9)Tab.7 miR-1294 regulates expression of TRIM28 protein(±s,n=9)

    Note:Compared with miR-NC,1)P<0.05;Compared with anti-miR-NC,2)P<0.05.

    TRIM28 protein 0.58±0.05 0.23±0.031)0.56±0.05 0.94±0.082)246.317 0.000 Groups miR-NC miR-1294 anti-miR-NC anti-miR-1294 FP

    表8 TRIM28過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移侵襲的作用(±s,n=9)Tab.8 TRIM28 overexpression reversed effects of miR-1294 overexpression on proliferation,migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5(±s,n=9)

    表8 TRIM28過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞SP6.5增殖、遷移侵襲的作用(±s,n=9)Tab.8 TRIM28 overexpression reversed effects of miR-1294 overexpression on proliferation,migration and invasion of uveal melanoma cells SP6.5(±s,n=9)

    Note:Compared with miR-NC,1)P<0.05;compared with miR-1294+pcDNA,2)P<0.05.

    OD490 nm Groups TRIM28 protein p21 protein 24 h 48 h 72 h Number of migrating cells 109.32±9.64 48.69±4.851)46.87±4.66 Number of invasion cells 85.36±8.41 39.62±3.911)37.66±3.82 CyclinD1 protein MMP-2 protein MMP-9 protein miR-NC miR-1294 miR-1294+pcDNA miR-1294+pcDNATRIM28 0.63±0.05 0.21±0.031)0.22±0.02 0.41±0.04 0.37±0.03 0.35±0.03 0.74±0.07 0.49±0.041)0.47±0.04 1.15±0.09 0.69±0.061)0.64±0.05 0.79±0.06 0.33±0.031)0.31±0.03 0.24±0.03 0.64±0.061)0.65±0.06 0.69±0.06 0.27±0.031)0.26±0.03 0.82±0.07 0.38±0.031)0.37±0.04 0.51±0.052)0.39±0.04 0.61±0.052)0.93±0.08 89.36±8.252)71.45±7.132)0.67±0.062)0.36±0.032)0.57±0.052)0.69±0.06 166.800 0.000 F P 253.857 0.000 4.800 0.007 52.839 0.000 96.742 0.000 166.374 0.000 133.110 0.000 234.000 0.000 168.366 0.000 213.379 0.000

    3 討論

    葡萄膜黑色素瘤可嚴(yán)重影響患者視功能,針對原發(fā)性葡萄膜黑色素瘤的治療方法主要包括手術(shù)與放療,但針對轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤尚無有效治療方法[8]。既往研究證實(shí)部分miRNA的異常表達(dá)在葡萄膜黑色素瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,并可通過調(diào)控下游靶基因表達(dá)而發(fā)揮抑癌或致癌作用[9-10]。目前仍有部分miRNA在葡萄膜黑色素瘤發(fā)生及發(fā)展中的作用機(jī)制尚未闡明,因而本研究積極探尋新型miRNA并分析其在葡萄膜黑色素瘤中可能的分子機(jī)制,為葡萄膜黑色素瘤治療提供新方向。

    miR-1294在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào),并可能通過靶向調(diào)控HOXA6的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用[11]。研究表明miR-1294的表達(dá)下調(diào)預(yù)示胃癌患者的預(yù)后不良[12]。相關(guān)報(bào)道指出miR-1294的表達(dá)下調(diào)可促使C-MYC表達(dá)水平升高進(jìn)而促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及發(fā)展[13]。與上述報(bào)道結(jié)果相似,本研究結(jié)果顯示miR-1294在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平低于正常葡萄膜上皮細(xì)胞系,提示miR-1294的表達(dá)水平降低可能促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生。本研究進(jìn)一步觀察miR-1294過表達(dá)對葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響,結(jié)果顯示miR-1294過表達(dá)后葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖能力明顯降低,遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少,提示miR-1294過表達(dá)可降低葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-1294影響葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的分子機(jī)制,本研究檢測細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá),結(jié)果顯示miR-1294過表達(dá)后葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14蛋白表達(dá)水平均顯著降低,p21、p27蛋白表達(dá)水平均顯著升高,相關(guān)研究表明,CyclinD1與細(xì)胞蛋白依賴性激酶可結(jié)合形成復(fù)合物從而正向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程,p21、p27作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的一員,其可通過抑制細(xì)胞蛋白依賴性激酶活性而負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[14-15]。細(xì)胞外基質(zhì)降解是腫瘤發(fā)生侵襲及浸潤的先決條件,其中基質(zhì)金屬蛋白酶類可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的大分子蛋白從而促進(jìn)腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移,研究表明MMP-2、MMP-9、MMP-14等基質(zhì)金屬蛋白酶類在多種腫瘤組織及其細(xì)胞中均呈高表達(dá),并可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[16]。本研究結(jié)果提示miR-1294過表達(dá)可能通過降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9、MMP-14的表達(dá)水平及提高p21、p27的表達(dá)水平從而減弱葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

    TRIM28在結(jié)直腸癌、食管鱗癌等腫瘤組織中表達(dá)水平升高,并可參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[17-18]。研究表明miR-140-3p可通過直接下調(diào)TRIM28的表達(dá)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及遷移[19]。相關(guān)報(bào)道指出抑制TRIM28的表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌裸鼠移植瘤的生長并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20]。本研究結(jié)果顯示TRIM28在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中呈高表達(dá),通過抑制TRIM28的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞活力顯著降低,遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少,CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低,p21蛋白表達(dá)水平顯著升高,提示干擾TRIM28的表達(dá)可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)從而降低葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-1294能夠特異性結(jié)合TRIM28,并可負(fù)向調(diào)控TRIM28的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-1294過表達(dá)聯(lián)合TRIM28過表達(dá)后,葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞活力明顯增強(qiáng),遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多,CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯升高,p21蛋白表達(dá)水平明顯降低,提示miR-1294過表達(dá)可通過下調(diào)TRIM28的表達(dá)從而抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

    綜上所述,miR-1294在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),而TRIM28的表達(dá)上調(diào),miR-1294可能通過靶向TRIM28而調(diào)控葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲,miR-1294在葡萄膜黑色素瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因作用,可能成為葡萄膜黑色素瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

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