鼠傷寒沙門菌SseK1蛋白的表達(dá)及其免疫生物學(xué)特性研究①

路 霞 楊亞東 郁 川 杜付玉 張春杰

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471023）

新發(fā)傳染病是威脅人類健康和生命安全的重大醫(yī)學(xué)問題，鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）是一種對(duì)人類健康和養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅的重要病原菌，目前該菌在我國(guó)的感染發(fā)病率居沙門菌感染的首位［1-2］。沙門菌感染常用抗生素進(jìn)行治療，而抗生素的使用導(dǎo)致臨床沙門菌耐藥菌株不斷產(chǎn)生，使藥物難以治療鼠傷寒沙門菌引起的各種疾?。?］。近幾年來，亞單位疫苗備受研究者的青睞，亞單位疫苗不僅組分明確、安全性良好，且生產(chǎn)便利［4］。因此，對(duì)鼠傷寒沙門菌潛在的毒力因子或保護(hù)性抗原的研究尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)SseK1（Salmonella secreted effector K1）是一種由鼠傷寒沙門菌致病島SPI-2上的毒力基因所編碼并由Ⅲ型分泌系統(tǒng)（typeⅢsecretion system，T3SS）分泌的效應(yīng)蛋白。其通過T3SS分泌系統(tǒng)被遞送到宿主細(xì)胞中，使細(xì)菌能夠侵入并持續(xù)存在于宿主體內(nèi)［5-7］，而國(guó)內(nèi)有關(guān)效應(yīng)蛋白SseK1引起的炎癥反應(yīng)及該蛋白的抗原性研究尚未見報(bào)道，因此，本研究對(duì)鼠傷寒沙門菌SL1344的sseK1基因進(jìn)行了克隆表達(dá)和純化，并對(duì)其免疫生物學(xué)特性作了初步分析，為進(jìn)一步研究鼠傷寒沙門菌與機(jī)體在感染和免疫方面的相互作用以及新型重組亞單位疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及表達(dá)載體 鼠傷寒沙門菌SL1344、表達(dá)載體pET-32a、DH5α感受態(tài)細(xì)胞和大腸桿菌BL21都由本實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD-18-T購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要試劑及試劑盒 鎳柱親和層析蛋白純化試劑盒、Taq PCR Master Mix（2×，blue dye）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ，T4 DNA連接酶，DNA marker購(gòu)自碧云天生物有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；6～8周齡BALB/c雌性小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank已公布的鼠傷寒沙門菌SL1344株sseK1基因序列（登錄號(hào)No.FQ321003.1）設(shè)計(jì)sseK1基因的PCR引物。F：5′-GGATCCATGATCCCACCATTAAATAG-3′（下 劃線處為BamⅠ酶切位點(diǎn)）；R：5′-AAGCTTCTACTG?CACATGCCTCGC-3′（下劃線處為HindⅢ酶切位點(diǎn)）。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2.2 pMD-18-T-sseK1的構(gòu)建與鑒定 為獲得sseK1基因片段，本研究以鼠傷寒沙門菌SL1344作為模板，通過PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min初始變性；95℃30 s，56℃30 s，72℃80 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，瓊脂糖凝膠回收PCR擴(kuò)增出的sseK1片段，并連接至pMD18-T克隆載體，將攜帶有sseK1基因的克隆載體pMD18-TsseK1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)構(gòu)建的pMD18-T-sseK1重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，鑒定正確后送至生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)其序列進(jìn)一步測(cè)序。

1.2.3 pET-32a-sseK1重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 利用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對(duì)構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-18T-sseK1進(jìn)行雙酶切鑒定正確后連接至質(zhì)粒pET-32a，然后將攜帶有sseK1基因的原核表達(dá)載體pET-32a-sseK1轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)菌BL21中，經(jīng)PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定，構(gòu)建sseK1基因原核表達(dá)菌（pET-32a-SseK1-BL21）。

1.2.4 重組菌的蛋白表達(dá)純化及Western blot鑒定 用終濃度為1 mmol/L的IPTG對(duì)重組菌BL21（pET-32a-SseK1）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。用PBS重懸收集的菌體并冰浴超聲，超聲后分離上清和沉淀，按一定比例加入含β-巰基乙醇的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸處理后SDS-PAGE檢測(cè)重組菌的蛋白表達(dá)情況。用鎳離子親和層析法純化重組蛋白，然后將純化的SseK1蛋白與兔抗鼠傷寒沙門菌陽性血清反應(yīng)，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.2.5 鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株LD50的測(cè)定 正式實(shí)驗(yàn)的最高與最低劑量分別是在預(yù)實(shí)驗(yàn)中求得BALB/c小鼠全死亡或90%以上死亡的劑量和動(dòng)物不死亡或10%以下死亡的劑量。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨機(jī)將小鼠分為5組，每組6只，選取合適的菌落稀釋度，實(shí)驗(yàn)組小鼠每個(gè)稀釋度灌胃感染劑量為200μl/只，對(duì)照組小鼠灌胃等量的無菌生理鹽水。灌胃感染后，準(zhǔn)確記錄小鼠死亡情況。同時(shí)，從死亡小鼠分離細(xì)菌并用沙門菌特異性引物進(jìn)行鑒定，Bliss法計(jì)算鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株SL1344對(duì)小鼠的LD50。

1.2.6 小鼠免疫試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組，對(duì)照1組和對(duì)照2組。每組8只6周齡BALB/c小鼠，免疫劑量為實(shí)驗(yàn)組小鼠每只100μg重組蛋白，SseK1蛋白與Montanide ISA 201 VG佐劑按體積比4.6∶5.4充分混合乳化，小鼠免疫方式采用背部皮下多點(diǎn)注射，背部皮下注射5個(gè)注射點(diǎn)，總計(jì)1 ml。免疫對(duì)照組小鼠以等量的佐劑與PBS混合后免疫。在小鼠一免14 d后加強(qiáng)一次免疫，免疫劑量和途徑與一免相同。二免后第7天、第14天、第21天和第28天進(jìn)行眼底采血，ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。

1.2.7 抗體效價(jià)檢測(cè) 上述免疫小鼠眼底采血后進(jìn)行血清分離，用純化的SseK1蛋白（濃度為5μg/ml）作為抗原進(jìn)行包被，采用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。效價(jià)定義為：P為陽性450 nm處的吸光度值，N為陰性對(duì)照450 nm處的吸光度值，當(dāng)P/N≥2.1判為陽性，P/N＜1.5判為陰性?？寡宓男r(jià)為陽性血清的最大稀釋比例。

1.2.8 小鼠淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［8］方法，在小鼠二免14 d后，從每組中隨機(jī)取3只小鼠無菌摘取脾臟，分離脾臟淋巴細(xì)胞，用RP?MI1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，每孔100μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。以SseK1或ConA刺激細(xì)胞（5μg/孔），每孔設(shè)3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)72 h后加入MTT溶液（5 mg/ml）20μl/孔，繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)上清液，按150μl/孔加入DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490nm。

1.2.9 小鼠攻毒試驗(yàn) 按照上述1.2.6方法免疫小鼠，在小鼠二免14 d后，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照1組小鼠進(jìn)行灌胃攻毒SL1344強(qiáng)毒株100μl（3.16×105CFU），實(shí)驗(yàn)2組和對(duì)照2組小鼠則正常飼喂。攻毒后記錄免疫小鼠死亡情況，從而對(duì)SseK1蛋白的免疫保護(hù)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，兩組間差異比較采用Students't檢驗(yàn)，多重比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pMD-18-T-sseK1的構(gòu)建和鑒定 以鼠傷寒沙門菌SL1344為模板，用所設(shè)計(jì)的sseK1引物PCR擴(kuò)增出目的片段sseK1，經(jīng)1.0%瓊脂凝膠電泳顯示：成功擴(kuò)增出約1 000 bp大小的目的條帶（圖1A），與預(yù)期1 011 bp相符。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ對(duì)構(gòu)建的pMD-18T-sseK1重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果出現(xiàn)約為2 600 bp的載體條帶和約1 000 bp的目的條帶（圖1B），表明重組質(zhì)粒pMD-18-T-sseK1構(gòu)建正確。隨后將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pMD-18-TsseK1送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與GenBank中的鼠傷寒沙門菌SL1344株sseK1基因的同源性為100%，無差異，說明PCR擴(kuò)增出的sseK1基因片段正確。

圖1 sseK1基因的PCR擴(kuò)增（A）和pMD18-T-sseK1（B）的酶切鑒定Fig.1 PCR amplification of sseK1 gene（A）and identifica-tion of double enzyme for pMD18-T-sseK1（B）

2.2 pET-32a-sseK1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 挑取含有pET-32a-sseK1重組質(zhì)粒的菌落，提取PCR鑒定的陽性菌落的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳可見約6 000 bp載體條帶和1 000 bp的目的條帶（圖2），與預(yù)期結(jié)果相符，說明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 pET-32a-sseK1的酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of pET-32asseK1

2.3 pET-32a-sseK1的誘導(dǎo)表達(dá)純化及Western blot分析結(jié)果 在適宜條件下，對(duì)pET-32a-SseK1重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化。SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)的融合蛋白在約43 kD處有表達(dá)帶（圖3），說明該蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于菌體超聲破碎后的上清中。經(jīng)鎳柱親和層析純化后可見較純的融合蛋白條帶，經(jīng)Western blot鑒定，該重組表達(dá)蛋白大小正確，為SseK1蛋白（圖4）。

圖3 重組蛋白SseK1的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein SseK1

圖4 重組蛋白的Western blot鑒定Fig.4 Western blot identification of recombinant protein

2.4 LD50的測(cè)定 用標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株對(duì)小鼠口服感染，實(shí)驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)不同程度的死亡。從死亡小鼠中分離的細(xì)菌均能用pi1/pi2引物擴(kuò)增出約580 bp的特異性條帶；對(duì)照組小鼠存活正常。Bliss法計(jì)算鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株SL1344灌胃感染小鼠的LD50為3.16×105CFU（表1）。

表1 鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株SL1344的毒力測(cè)定Tab.1 Mortality of mice after infection with Salmonella typhimurium SL1344

2.5 重組蛋白誘導(dǎo)的抗體反應(yīng) 用重組蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行二免后第7天即可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定水平的特異性抗體，小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到1∶14 000，而佐劑與PBS組則未產(chǎn)生特異性抗體；第14天血清抗體效價(jià)均為1∶38 000；第21天抗體效價(jià)達(dá)到最大，為1∶124 000；第28天效價(jià)與第21天相比較抗體效價(jià)有所降低，為1∶46 000；且實(shí)驗(yàn)組IgG水平均顯著高于佐劑與PBS混合組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 細(xì)胞免疫反應(yīng) 以SseK1（5μg/孔）對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激，陽性對(duì)照組以相同劑量的ConA刺激，對(duì)于陰性對(duì)照組則不作處理。結(jié)果表明，只有以SseK1刺激的實(shí)驗(yàn)組和以ConA刺激的陽性對(duì)照組產(chǎn)生了顯著的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖5）。

圖5 小鼠T淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 T lymphocyte proliferation in immunized mice

2.7 重組蛋白對(duì)小鼠免疫保護(hù)效果檢測(cè) 小鼠死亡情況為：7 d內(nèi)，對(duì)照1組小鼠全部死亡；實(shí)驗(yàn)1組死亡1只；8～15 d內(nèi)，實(shí)驗(yàn)1組小鼠死亡2只，其余5只一直存活至觀察期結(jié)束，觀察期為14 d；對(duì)照2組和實(shí)驗(yàn)2組小鼠均正常存活。鼠傷寒沙門菌強(qiáng)毒株對(duì)重組蛋白SseK1二免14 d后的小鼠攻毒產(chǎn)生60%以上的免疫保護(hù)率。

3 討論

鼠傷寒沙門菌是一種導(dǎo)致人和多種動(dòng)物食源性感染和胃腸道感染的重要病原菌，嚴(yán)重時(shí)能夠引起哺乳動(dòng)物和人死亡，對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大的負(fù)擔(dān)［9-10］。近年來，沙門菌病主要靠藥物預(yù)防和治療，但是由此引發(fā)了沙門菌耐藥株的產(chǎn)生和動(dòng)物食品藥物殘留等嚴(yán)重問題。目前，亞單位疫苗及重組疫苗已逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)，其中亞單位疫苗因?yàn)榻M成成分明確，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，安全和特異性好而備受研究者的關(guān)注［11］。而篩選有效的免疫抗原蛋白是制備新型高效沙門菌亞單位疫苗的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，這些保護(hù)性抗原的鑒定為新一代的亞單位疫苗的研制提供了方向。

在感染宿主過程中許多細(xì)菌通過表達(dá)毒力基因做出響應(yīng)，在宿主致病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，而那些在宿主體內(nèi)表達(dá)的毒力基因，如果其編碼的蛋白質(zhì)具有抗原性，那么這些基因?qū)ρ芯坎≡虏C(jī)理及研制安全有效的疫苗則具有重要的研究意義［12-13］。沙門菌毒力的一個(gè)重要組成部分是沙門菌毒力島SPI-2編碼的T3SS分泌系統(tǒng)。通過這種蛋白分泌系統(tǒng)，沙門菌能將囊泡中的效應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞中，干擾先天免疫應(yīng)答所需要的關(guān)鍵信號(hào)傳 導(dǎo) 途 徑［14］。SseK1（Salmonella secreted effector K1）作為鼠傷寒沙門菌致病島SPI-2編碼的一個(gè)重要的效應(yīng)分子，已被鑒定為鼠傷寒沙門菌感染宿主細(xì)胞過程中必不可少的毒力蛋白［15］。另外有研究表明SseK1可通過調(diào)控宿主細(xì)胞上的NF-κB信號(hào)通路來調(diào)控沙門菌對(duì)于細(xì)胞的侵染，在沙門菌的致病中發(fā)揮著重要作用，且SseK1基因在沙門菌染色體基因組上高度保守，具有良好的研究?jī)r(jià)值［16］。而關(guān)于鼠傷寒沙門菌SseK1蛋白結(jié)構(gòu)功能及免疫原性的研究在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)克隆了鼠傷寒沙門菌SseK1基因，在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)其免疫生物學(xué)特性做了初步研究。

研究表明，重組蛋白SseK1經(jīng)SDS-PAGE分析，在約43 kD處有比較明顯的特異蛋白表達(dá)帶，與預(yù)期大小一致。Western blot分析顯示，純化后的SseK1重組蛋白可與兔抗鼠傷寒沙門菌陽性血清反應(yīng)，在約43 kD處有SseK1重組蛋白單一條帶，表明SseK1蛋白具有良好的反應(yīng)原性。在重組蛋白SseK1誘導(dǎo)抗體反應(yīng)中，二免后第21天抗體效價(jià)達(dá)到最大，為1∶124 000，并于第4周起降低，且實(shí)驗(yàn)組IgG水平均顯著高于佐劑與PBS混合組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），該結(jié)果與LIAUDET等［17］將純化后沙門菌重組鞭毛蛋白腹腔注射小鼠后而引起的血清中相關(guān)炎癥因子分泌量增加的研究結(jié)果相似；在細(xì)胞免疫反應(yīng)中，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞以SseK1蛋白刺激的實(shí)驗(yàn)組和以相同劑量ConA刺激的陽性對(duì)照組均產(chǎn)生了顯著的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），陰性對(duì)照組并未引起，說明SseK1能夠有效地刺激機(jī)體的免疫功能。在重組蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效力檢測(cè)中，重組蛋白Ssek1二免14 d后的小鼠對(duì)鼠傷寒沙門菌強(qiáng)毒株攻毒產(chǎn)生60%以上的免疫保護(hù)率，充分表明重組sseK1蛋白具有良好的免疫原性和保護(hù)效力。

綜上所述，鼠傷寒沙門菌SseK1重組蛋白可被兔抗鼠傷寒沙門菌陽性血清識(shí)別，具有較高的抗體效價(jià)，能夠顯著刺激小鼠T淋巴細(xì)胞增殖，并能提供較好的免疫保護(hù)效力，表明SseK1蛋白具有生物學(xué)活性和良好的抗原性，能激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答和較好的體液免疫應(yīng)答，可以作為重組亞單位疫苗的候選抗原蛋白，為深入研究鼠傷寒沙門菌與機(jī)體在感染和免疫方面的相互作用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。