一株土壤解磷細(xì)菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

王美鑫，吳松，張媛媛，韓森匯，張曉陽，宋漳

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002)

土壤中含有難溶性磷，解磷微生物的存在可以將其轉(zhuǎn)化為可吸收利用的可溶性磷，改善植物磷素營養(yǎng)，促進(jìn)土壤中有益微生物代謝[1].在解磷的過程中，微生物還可以分泌有機(jī)酸、酶類以及一些小分子物質(zhì)[2-4]，其解磷細(xì)菌本身在環(huán)境土壤的改良中具有應(yīng)用潛力[5].不同的解磷菌的解磷能力亦不相同[6]，同種解磷菌的解磷能力在不同的土壤環(huán)境條件下表現(xiàn)仍有很大差異[7-8].在油茶林土壤微生物及解磷菌的分離篩選等領(lǐng)域，諸多科研工作者進(jìn)行了大量研究.對于根際土壤微生物的開發(fā)利用，假設(shè)可以從油茶根際土壤分離并篩選出高效能的功能菌株，探究最佳的生長環(huán)境，將對研制微生物肥料具有長遠(yuǎn)而深刻的意義[9-10].本試驗(yàn)探究不同的培養(yǎng)基、溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量等條件對解磷菌株解磷特性的影響，旨在為提高土壤磷利用率提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試菌株與供試培養(yǎng)基

供試解磷細(xì)菌CoPDB4分離自福建省閩侯桐口林場油茶根際土壤，保存于福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所.

種子液體培養(yǎng)基：蔗糖5.0 g，淀粉5 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO40.1 g，(NH4)2SO41.0 g，CaCO30.5 g，NaCl 0.2 g，H2O 1 000 mL；SP培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉0.5 g，(NH4)2SO40.5 g，Ca3(PO4)25 g，KCl 0.3 g，H2O 1 000 mL；NBRIY培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，Ca3(PO4)25 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，H2O 1 000 mL；NBRIP培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.1 g，Ca3(PO4)25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MgCl2·7H2O 5 g，KCl 0.2 g，H2O 1 000 mL；NBRIYP培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉0.5 g，(NH4)2SO40.1 g，Ca3(PO4)25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MgCl2·7H2O 5 g，KCl 0.2 g，H2O 1 000 mL.

1.2 供試菌株活化

將供試菌株CoPDB4接種于種子液體培養(yǎng)基，在溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min下?lián)u培3 d，獲得一級種子菌液.以相同的方法取一級種子菌液5 mL接種于種子液體培養(yǎng)基，在相同條件下?lián)u培相同時間，獲得二級種子菌液.同理，獲得三級種子菌液，得到活化的供試菌株.

1.3 生物量和磷含量的測定

(1)紫外分光光度計測生物量[11].將發(fā)酵處理后的種子液定量(3 mL)吸取到比色皿中，以純凈培養(yǎng)基為對照，每個樣品重復(fù)3次.對照比色皿放在第一個，其余樣品依次排列，設(shè)定分光光度計的波長為700 nm，對照組進(jìn)行校對，其余樣品依次檢測，記錄每天樣品測定值.

(2)鉬銻抗比色法[12]測定磷含量.將處理后的待測樣品pH調(diào)至顏色剛成微黃色后，加入5 mL鉬銻抗顯色劑，定容，搖勻.30 min后，于分光光度計上用2 cm光徑比色皿比色處理，將波長設(shè)定為700 nm比色，以空白試驗(yàn)溶液為參比液，調(diào)OD值到零，測定待測顯色液的OD值.

1.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

(1)培養(yǎng)基.選用SP、NBRIY、NBRIP、NBRIYP4種培養(yǎng)基優(yōu)化處理，以不接種液體培養(yǎng)基為對照，每個處理各重復(fù)3次.接種菌株種子液后，于28 ℃、160 r/min條件下?lián)u培7 d，測定生物量與磷含量.

(2)pH.將pH設(shè)定為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0優(yōu)化處理，以pH 7.0不接種培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次.測定方法同上.

(3)裝液量.設(shè)定裝液量50、75、100、125、150、175 mL優(yōu)化處理，每個處理重復(fù)3次.測定方法同上.

(4)接種量.將接種量設(shè)定為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL優(yōu)化處理，以不接種的液體培養(yǎng)基為對照，每個處理重復(fù)3次.測定方法同上.

(5)溫度.將溫度設(shè)定為24、26、28、30、32、34 ℃優(yōu)化處理，每個處理重復(fù)3次.測定方法同上.

(6)搖床轉(zhuǎn)速.設(shè)定不同轉(zhuǎn)速20、140、160、180、200、220 r/min優(yōu)化處理，每個處理重復(fù)3次.測定方法同上.

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Word 2003對試驗(yàn)數(shù)據(jù)加以處理，SPSS 21.0進(jìn)行單因素分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對解磷細(xì)菌的影響

解磷細(xì)菌在供試4種培養(yǎng)基中均能生長(圖1)，其中在NBRIY培養(yǎng)基中生長量最高，解磷能力也最強(qiáng).且在NBRIY培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌生物量和解磷能力顯著高于SP、NBRIP和NBRIYP培養(yǎng)基.對比其余3種培養(yǎng)基，只有NBRIY培養(yǎng)基中包含了FeSO4·7H2O，說明解磷細(xì)菌在含F(xiàn)e2+的培養(yǎng)基中培養(yǎng)效果更好，因此NBRIY培養(yǎng)基可作為解磷細(xì)菌的首選培養(yǎng)基.

圖1 不同培養(yǎng)基對細(xì)菌CoPDB4生長量和解磷能力的影響 圖2 pH對細(xì)菌CoPDB4生長和解磷能力的影響 Fig.1 Effects of culture media on the growth rate and Fig.2 Effects of pH on the growth rate and phosphate-solubilizing ability of bacteria CoPDB4 phosphate-solubilizing ability of bacteria CoPDB4

2.2 pH對解磷細(xì)菌的影響

解磷細(xì)菌在pH 6.8～8.2內(nèi)均能夠生長(圖2)，在pH為7.5的培養(yǎng)基中生長最好，而在pH為7.0的培養(yǎng)基中解磷能力最強(qiáng).在pH為7.0的培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌生物量和解磷能力顯著高于其余pH培養(yǎng)基，不同pH培養(yǎng)基對解磷細(xì)菌差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05).由此可說明該解磷細(xì)菌在中性偏堿性的條件中生長情況最好且作用效果最強(qiáng)，有利于解磷細(xì)菌的生長，且更好地發(fā)揮作用.

2.3 裝液量對解磷細(xì)菌的影響

解磷細(xì)菌在體積分?jǐn)?shù)為20%～70%裝液量的培養(yǎng)基中均可生長，在30%裝液量條件下OD值最高，即生長最好，在20%裝液量條件下解磷能力最強(qiáng).且在不同裝液量的培養(yǎng)基中，菌株的生長與解磷能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3).圖中表明，該解磷細(xì)菌不適宜在裝液量高的條件下生長和發(fā)揮作用，裝液量越多，菌液的相對含量降低，使得細(xì)菌存活率降低，且解磷量減少；在適宜裝液量(20%、30%)下能保證該菌的正常生長和發(fā)揮作用，有利于磷含量的提高.

圖3 裝液量對細(xì)菌CoPDB4生長量和解磷能力的影響 圖4 接種量對細(xì)菌CoPDB4生長量和解磷能力的影響Fig.3 Effects of volume on the growth rate and Fig.4 Effects of inoculum amount on the growth rate phosphate-solubilizing ability of bacteria CoPDB4 and phosphate-solubilizing ability of bacteria CoPDB4

2.4 接種量對解磷細(xì)菌的影響

解磷細(xì)菌接種體積分?jǐn)?shù)為3%～10%的菌液在培養(yǎng)基中均可生長，在7%接種量條件下OD值最高，即生長最好，生物量最高，解磷能力也最強(qiáng)，.且在不同接種量的條件下，菌株的生長和解磷能力的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖4).圖中表明，該解磷細(xì)菌對接種量有一定要求，隨著接種量的增多，解磷細(xì)菌的生長和解磷能力逐漸提高，當(dāng)接種量到達(dá)7%時，生物量和解磷量到達(dá)峰值，此后接種量的增多使得解磷細(xì)菌的生長和解磷能力降低.因此，7%接種量為該解磷細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)的最適接種量，可用于后續(xù)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，提高解磷細(xì)菌的解磷能力.

2.5 溫度對解磷細(xì)菌生長的影響

解磷細(xì)菌在24～34 ℃均可生長，在30 ℃時，生長最好且解磷能力最好.且在不同溫度下，菌株生長和解磷能力的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖5).

圖5 溫度對細(xì)菌CoPDB4生長量和解磷能力的影響 圖6 搖床轉(zhuǎn)速對細(xì)菌CoPDB4生長量和解磷能力的影響Fig.5 Effects of temperatures on the growth rate and Fig.6 Effects of shaking speed on the growth rate phosphate-solubilizing ability of bacteria CoPDB4 and phosphate-solubilizing ability of bacteria CoPDB4

圖5表明，隨著溫度的升高，解磷細(xì)菌的生長量與含磷量也在同步提高，說明溫度對于該解磷細(xì)菌的生長和發(fā)揮作用有一定影響;到30 ℃時，生長量與含磷量達(dá)到峰值，溫度高于30 ℃含量均降低，說明30 ℃是解磷細(xì)菌生長的最佳溫度.

2.6 搖床轉(zhuǎn)速對解磷細(xì)菌的影響

解磷細(xì)菌在120～220 r/min的搖床轉(zhuǎn)速之間均能生長，在搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時，解磷細(xì)菌的解磷能力最強(qiáng)，而在搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min使菌株生長最好.且在不同的搖床轉(zhuǎn)速下，菌株生長和解磷能力的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖6).在搖床轉(zhuǎn)速較高條件下，生物量和含磷量降低，說明解磷細(xì)菌在高轉(zhuǎn)速條件下受到抑制而無法正常生長和進(jìn)行解磷作用，在160、180 r/min下解磷細(xì)菌的解磷能力和生物量均達(dá)到高水平，因此可選用轉(zhuǎn)速為160、180 r/min作為解磷細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)的優(yōu)選轉(zhuǎn)速.

3 結(jié)論

磷對植物生長發(fā)育起重要的作用[13].土壤中含有大量難溶性磷，只有0.1%可供植物吸收利用，嚴(yán)重限制了作物的生長[14].土壤中的解磷微生物能將難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，促進(jìn)植物吸收，提高磷肥利用率.張海燕等[15]從小麥根際土壤中分離篩選出2株高效解磷細(xì)菌，對其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，促進(jìn)了小麥生長和根部發(fā)育；莊馥璐等[16]從蘋果根際土壤中篩選出具有礦化有機(jī)磷能力的解磷菌，提高了有機(jī)磷的利用率.培養(yǎng)條件不同時，解磷微生物的影響也不同，陳炫等[17]研究出解磷菌N1-41-43的最佳溫度30 ℃、最適pH為6.5，解磷量190.57 mg/L；武志海等[18]對水稻根際土壤分離篩選的2株解磷菌研究表明最佳碳源為葡萄糖、最佳氮源為蛋白胨、最適pH為6.0.

本試驗(yàn)以油茶根際解磷微生物為研究對象，對從油茶根際土壤中分離篩選出的解磷細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，得出解磷細(xì)菌CoPDB4在6 d時解磷能力最佳，此后培養(yǎng)時間越長解磷能力下降較快；在NBRIY培養(yǎng)基中，pH為7.5，溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min時解磷細(xì)菌生長最好；在NBRIY培養(yǎng)基，pH為7.0，溫度為30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時解磷能力最強(qiáng).該結(jié)果中的溫度條件與蘇輝蘭等[19]對貢柑果園高效解磷菌條件優(yōu)化研究所得結(jié)果一致；在裝液量為20%(體積分?jǐn)?shù))時解磷能力最好，當(dāng)裝液量逐漸增加時解磷能力下降，說明解磷細(xì)菌屬好氧型細(xì)菌，在氧氣充足的條件下自身的代謝能力更好，且該條件與李衛(wèi)榮[20]從玉米根際土壤中篩選的高效解磷菌條件優(yōu)化所得結(jié)果相同；接種量的選擇在考慮解磷能力基礎(chǔ)上還需要考慮生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)效益，試驗(yàn)所得接種量為7%時解磷能力最強(qiáng).