人源MDN1蛋白質(zhì)的電鏡結(jié)構(gòu)研究

許云濤，李明月，雷鳴

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院上海精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院，上海200125

核糖體是人體內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成的重要細(xì)胞器，影響著機(jī)體生長(zhǎng)和繁殖等一系列活動(dòng)。核糖體的組裝和成熟是一個(gè)高度復(fù)雜的過(guò)程，受到很多組裝因子的精密調(diào)控［1-3］，該過(guò)程的異常會(huì)導(dǎo)致心血管、神經(jīng)、骨骼、造血系統(tǒng)等方面的疾病，如骨髓增生異常綜合征（Shwachman-Diamond syndrome，SDS）、先 天 性 角 化 不 良（dyskeratosis congenita，DC）等［4-6］。在眾多參與調(diào)控核糖體組裝的蛋白質(zhì)因子中，AAA-ATPase（ATPase associated with various activities）［7］家族是受到廣泛關(guān)注的一類蛋白質(zhì)，該家族成員在不同階段參與釋放或者回收不同的pre-60S核糖體組裝因子，推動(dòng)核糖體的成熟過(guò)程。AAA-ATPase家族成員具有2個(gè)基本的特征：其一是氨基酸序列中含有1個(gè)或多個(gè)保守的AAA結(jié)構(gòu)域，AAA結(jié)構(gòu)域具有ATP水解酶活性，通過(guò)水解ATP獲得能量來(lái)發(fā)揮其生理功能［8］；其二是大多數(shù)AAA-ATPase能夠形成寡聚體，互相結(jié)合，協(xié)同作用，最常見(jiàn)的是形成doughnut-shaped的六聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這是其發(fā)揮生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［9-11］。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，有3種AAA-ATPase參與pre-60S核糖體成熟過(guò)程，分別為Ribosome biogenesis ATPase Rix7（Rix7）、Developmentally-regulated GTPbinding protein 1（Drg1）和Rea1［1］。Rix7是第1個(gè)與pre-60S核糖體相互作用的AAA-ATPase，主要與組裝因子NOP seven-associated protein 1（Nsa1）釋 放 有 關(guān)［12-13］；Drg1主要在胞質(zhì)中發(fā)揮作用，促進(jìn)組裝因子回收［14-15］；而Rea1促進(jìn)Pescadillo homolog（NOP7）pre-60S complex和Pre-rRNA-processing protein（Rix1）pre-60S complex中的組裝因子釋放，是pre-60S核糖體在核仁以及核質(zhì)成熟中的關(guān)鍵因子［16］。

在上述3種AAA-ATPase中，Rea1作為在核內(nèi)調(diào)控pre-60S核糖體組裝因子釋放的重要蛋白質(zhì)，其敲低、敲除可致酵母死亡，在其他真核生物中對(duì)發(fā)育也有非常大的 影 響［17-21］。實(shí) 驗(yàn) 表 明，Rea1的metal ion-dependent adhesion site（MIDAS）結(jié)構(gòu)域與pre-60S核糖體組裝因子Ribosome biogenesis protein Ytm1-Erb1-Nop7（Ytm1-Erb1-Nop7）的MIDAS-interacting domain（MIDO）結(jié)構(gòu)域相互作用，Rea1將Ytm1從pre-60S核糖體上釋放出來(lái)［16，22］；此外還發(fā)現(xiàn)Rea1在Rix1 pre-60S核糖體中豐度很高，并且通過(guò)其ATPase環(huán)狀結(jié)構(gòu)域與Rix1 pre-60S核糖體相互作用［18，22-23］。最 近發(fā)表的酵母 源（Schizosaccharomyces pombe）的結(jié)構(gòu)信息顯示，該蛋白質(zhì)由6個(gè)AAA結(jié)構(gòu)域、連接肽（linker）、天冬氨酸/谷氨酸（D/E）以及MIDAS結(jié) 構(gòu) 域組成［24-25］；通過(guò)AMPPNP和ATP-ribozinoindole1（ATP-Rbin1）2種不同狀態(tài)的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，MIDAS結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)插入AAA環(huán)與pre-60S核糖體的組分相互作用，從而介導(dǎo)多種組分從pre-60S核糖體釋放［26］。

Rea1在人源的同源蛋白質(zhì)為midasin AAA-ATPase 1（MDN1），是體內(nèi)相對(duì)分子質(zhì)量最大的蛋白質(zhì)之一，全長(zhǎng)包含5 596個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為632 000。MDN1在pre-60S核糖體成熟中發(fā)揮著非常重要的作用，但是其相關(guān)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進(jìn)展緩慢，這很大程度上限制了我們對(duì)pre-60S核糖體在核內(nèi)成熟以及裝配的理解。目前對(duì)MDN1結(jié)構(gòu)和功能的了解，較多是基于對(duì)酵母Real的研究結(jié)論，因此，解析人源MDN1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對(duì)于闡明包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物MDN1調(diào)控pre-60S核糖體成熟過(guò)程的分子機(jī)制有著非常重要的意義。本研究通過(guò)哺乳細(xì)胞表達(dá)和蛋白質(zhì)純化體系，獲得全長(zhǎng)人源MDN1蛋白質(zhì)樣品，借助120 kV透射電子顯微鏡和單顆粒（singleparticle）重構(gòu)技術(shù)，獲得了MDN1蛋白質(zhì)的負(fù)染三維結(jié)構(gòu)模型，為后續(xù)解析高分辨MDN1結(jié)構(gòu)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1主要試劑和儀器三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl）、氯化鈉（NaCl）、氯化鎂（MgCl2）、甘油（Glycerol）、二 硫 蘇 糖 醇（DTT）、20×磷 酸 緩 沖 液（PBS）、吐溫-20（Tween-20）均購(gòu)自上海生工生物工程公司，cocktail購(gòu)自瑞士Roche公司，限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，牛血清白蛋 白、dulbecco′s modified eagle medium（DMEM）、ANTI-FLAG? M2 Agarose Affinity Gel均購(gòu)自Sigma（上海）公司，懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自CELL-WISE公司；高速離心機(jī)、超速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司，冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，電泳儀與電泳槽購(gòu)自Bio-Rad（中國(guó)）公司，細(xì)胞流式分選儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、高分辨軌道阱質(zhì)譜儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，激光掃描共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)ZEISS公司，碳膜銅網(wǎng)購(gòu)自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司，透射電子顯微鏡購(gòu)自美國(guó)FEI公司。

1.1.2載體、菌株和細(xì)胞pX330-mCherry載體、pUC57載體、E.coli DH5α菌種、Expi293F細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1引物合成和DNA序列測(cè)定均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2質(zhì)粒的構(gòu)建針對(duì)MDN1基因的5′端設(shè)計(jì)包含sgRNA靶位點(diǎn)（cac cgc aag aag tgc tcc atg acc c）的引物，體外退火后連接入pX330-mCherry載體［27］，作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)［28］gRNA表達(dá)質(zhì)粒。同時(shí)構(gòu)建一段含有MDN1基因起始密碼子上游1 kb基因組序列，3×FLAG標(biāo)簽（tag）（DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGSG GS）編碼序列，以及下游1 kb基因組序列的供體序列，連接在pUC57載體，作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)修復(fù)供體質(zhì)粒。

1.2.3 FLAG-MDN1細(xì)胞株構(gòu)建將CRISPR/Cas9系統(tǒng)的sgRNA表達(dá)質(zhì)粒和修復(fù)供體質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染Expi293F細(xì)胞，采用DMEM（10% FBS）培養(yǎng)，48 h后進(jìn)行流式分選，將mCherry陽(yáng)性細(xì)胞單克隆分選至96孔板。對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。存活細(xì)胞培養(yǎng)至一定數(shù)量后，抽提基因組進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）驗(yàn) 證（MDN1-FLAG-for，CTC GGG GTG AGG GCC CTG GGT CGC CAC CAT GGA CTA CAA GGA CCA CGA CGG；MDN1-doner-rev，ACT CAC CTG TCC CGT GGC TCA CG）；全細(xì)胞裂解液用FLAG抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）驗(yàn)證。陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至懸浮狀態(tài)，懸浮細(xì)胞在無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基，37℃、5% CO2、140 rpm條件下培養(yǎng)。在細(xì)胞密度約為3×106/mL的條件下收取，后進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。

1.2.4免疫熒光（immunofluorescence，IF）鑒定提前24 h將細(xì)胞培養(yǎng)在玻片上。將培養(yǎng)基吸掉，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBST（PBS+0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，TritonX-100）處理15 min，封閉液（5% BSA+PBS+0.1% TritonX-100）封閉30 min，加FLAG一抗4℃孵育過(guò)夜。用PBST洗3次，加熒光二抗，室溫孵育40 min。之后用PBST洗3次，加DAPI室溫染色5 min，封片。之后在共聚焦顯微鏡上觀察。

1.2.5 MDN1蛋白質(zhì)純化表達(dá)目的蛋白質(zhì)的Expi293F細(xì)胞用1 000×g離心20 min，棄上清，用裂解緩沖液（50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、400 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、10%Glycerol、1 mmol/L DTT、cocktail）重懸，采用液氮凍存法凍存細(xì)胞，液氮研磨法裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解后經(jīng)39 190×g離心50 min，取上清與ANTI-FLAG?M2 Agarose Affinity Gel在4℃低速旋轉(zhuǎn)混合4 h，Gel用洗滌緩沖液（50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、400 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、10% Glycerol、1mmol/L DTT）洗去雜蛋白質(zhì)，再用含200 ng/μL FLAG Peptide的洗脫緩沖液（50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT）洗脫目的蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)樣品用100 kD濃縮管濃縮至200μL，通過(guò)10%～30%甘油密度梯度離心法，用SW60轉(zhuǎn)子，184 500×g，4℃，14 h分離純化目的蛋白質(zhì)。結(jié)束后每200μL收集，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析鑒定目的蛋白質(zhì)。

1.2.6蛋白質(zhì)組分的質(zhì)譜鑒定由于許多樣品中加有去污劑，需要事先沉淀洗滌處理之后才能上機(jī)。樣品的處理方法步驟如下：首先沉淀樣品去除樣品中去污劑如TritonX-100，乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP40），十二烷基-beta-D-麥芽糖苷（N-Dodecyl-β-D-maltoside，DDM）等。之后重新溶解樣品，還原烷基化，用胰蛋白酶，37℃酶解過(guò)夜。最后對(duì)酶解溶液進(jìn)行脫鹽處理，通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）進(jìn)行分析；質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)提交到Proteome Discoverer 2.3軟件中，使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的人（Homo sapiens）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。

1.2.7負(fù)染樣品制備、數(shù)據(jù)收集及模型構(gòu)建因甲酸雙氧鈾（uranyl formate，UF）溶液滲透能力較強(qiáng)并且顆粒非常細(xì)膩，故選擇其作為樣品的負(fù)染色液。負(fù)染電鏡實(shí)驗(yàn)步驟如下：對(duì)碳膜銅網(wǎng)進(jìn)行親水化處理后，取3μL蛋白質(zhì)溶液滴于碳膜銅網(wǎng)，吸附1 min；用濾紙從碳膜銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的溶液，滴加10μL UF負(fù)染色液（ρ=0.75%），洗2次，染色1 min；用濾紙吸去多余液體，室溫晾干；晾干后將樣品置于120 kV透射電鏡中觀察，放大倍數(shù)設(shè)置為57 000倍，欠焦值設(shè)置為-1～-2μm；選擇樣品顆粒分散性和均一性較好的區(qū)域進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。隨后利用數(shù)據(jù)處理軟件EMAN2［29］和RELION［30］對(duì)所收集的圖像進(jìn)行處理并產(chǎn)生一個(gè)三維模型。

1.2.8 MDN1蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 預(yù) 測(cè)I-TASSER（Iterative Threading ASSEmbly Refinement）是由密歇根大學(xué)開發(fā)的在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)的工具［31］，預(yù)測(cè)的原理是不相似的氨基酸序列也可以對(duì)應(yīng)著相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。它能從PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫(kù)里識(shí)別結(jié)構(gòu)模板，通過(guò)基于迭代模板的片段組裝模擬來(lái)構(gòu)建完整的結(jié)構(gòu)模型。接著通過(guò)蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫(kù)BioLiP對(duì)3D模型重新線程化，從而預(yù)測(cè)靶標(biāo)的功能。由于MDN1蛋白質(zhì)較大，只對(duì)其6個(gè)AAA結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建內(nèi)源表達(dá)FLAG-MDN1的細(xì)胞株

人源MDN1全長(zhǎng)包含5 596個(gè)氨基酸殘基，分子量較大，進(jìn)行克隆和外源表達(dá)的難度非常高，因此我們采用對(duì)Expi293F細(xì)胞內(nèi)源敲入標(biāo)簽的方法進(jìn)行內(nèi)源表達(dá)。在MDN1蛋白質(zhì)的N端敲入FLAG標(biāo)簽，用于親和層析（圖1A）。通過(guò)CRISPR/Cas9對(duì)Expi293F細(xì)胞MDN1基因組N端進(jìn)行定點(diǎn)剪切，再通過(guò)帶有FLAG標(biāo)簽的修復(fù)供體進(jìn)行修復(fù)，然后利用流式細(xì)胞術(shù)分選mCherry陽(yáng)性的單克隆Expi293F細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。獲得的單克隆細(xì)胞株抽提基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，部分的細(xì)胞株樣品能夠獲得預(yù)期的特異性PCR產(chǎn)物，說(shuō)明相應(yīng)的細(xì)胞株已經(jīng)敲入目的FLAG標(biāo)簽（圖1B）。進(jìn)一步，利用FLAG抗體對(duì)全細(xì)胞裂解液進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆細(xì)胞株能夠檢測(cè)到目的條帶（圖1C），表明帶有N端FLAG標(biāo)簽的MDN1蛋白質(zhì)可以正確表達(dá)。另外我們也采用IF技術(shù)，檢測(cè)FLAG-MDN1的表達(dá)和定位（圖1D）。上述3種不同的檢測(cè)方法，都證實(shí)FLAG純化標(biāo)簽在MDN1蛋白質(zhì)N端成功敲入，獲得正常表達(dá)FLAG-MDN1融合蛋白質(zhì)的Expi293F細(xì)胞株。

2.2 MDN1蛋白質(zhì)的純化

對(duì)標(biāo)簽敲入成功的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大懸浮培養(yǎng)，收取6 L細(xì)胞（約1.8×1010個(gè)細(xì)胞）用裂解緩沖液重懸后，采用液氮研磨法破碎細(xì)胞。細(xì)胞裂解后經(jīng)高速離心取上清，利用ANTI-FLAG親和層析方法獲得目的蛋白質(zhì)。純化富集的蛋白質(zhì)樣品采用Western blotting和銀染的方法進(jìn)行檢測(cè)（圖1E、F），證實(shí)得到的樣品主要包含目的蛋白質(zhì)FLAG-MDN1。將純化樣品采用體積分?jǐn)?shù)為10%～30%的甘油通過(guò)密度梯度離心法進(jìn)行分離純化，進(jìn)一步提高樣品的純度和均一性；密度梯度離心獲得的樣品按200μL/管進(jìn)行組分收集，通過(guò)SDS-PAGE和銀染鑒定不同的收集組分，選取純度和均一性較好的樣品用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)（圖1G，孔道9～11）。

圖1人源內(nèi)源FLAG-MDN1蛋白質(zhì)純化Fig 1 Purification of the human endogenous FLAG-tagged MDN1 protein

2.3 MDN1蛋白質(zhì)負(fù)染電鏡數(shù)據(jù)收集和三維模型的構(gòu)建

在獲得高純度且均一性較好的MDN1蛋白質(zhì)樣品后，采用負(fù)染色電鏡技術(shù)和單顆粒重構(gòu)技術(shù)分析目的蛋白質(zhì)的三維模型。對(duì)碳膜銅網(wǎng)進(jìn)行親水化后，將樣品吸附到碳膜銅網(wǎng)，經(jīng)重金屬甲酸雙氧鈾（UF）染色，通過(guò)120 kV透射電鏡觀察，結(jié)果表明樣品在負(fù)染條件下蛋白質(zhì)濃度合適，顆粒分散性和均一性較好（圖2A）。大部分顆粒的形狀為長(zhǎng)條形，長(zhǎng)度約29 nm，和預(yù)期分子量大小基本相符（圖2A）。部分顆粒的形狀偏向圓形，可能是MDN1蛋白質(zhì)6個(gè)AAA結(jié)構(gòu)域的投影。我們?cè)?7 000放大倍數(shù)條件下共收集負(fù)染照片103張，運(yùn)用EMAN2軟件手動(dòng)挑選顆粒，共挑出16 103個(gè)顆粒，之后使用RELION軟件進(jìn)行二維分類平 均（2D classification）（圖2B）和 三 維 分 類（3D classification）計(jì)算。結(jié)果表明MDN1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征明顯（圖2C），用于三維重構(gòu)的顆粒角度分布均勻（圖2D）。

2.4 MDN1蛋白質(zhì)初步結(jié)構(gòu)分析

負(fù)染數(shù)據(jù)進(jìn)一步經(jīng)過(guò)三維優(yōu)化處理（3D auto-Refine），最終獲得分辨率約為45?的人源MDN1蛋白質(zhì)負(fù)染三維結(jié)構(gòu)模型（圖3A）。整個(gè)蛋白質(zhì)大小為140?×170?×340?（圖3B），其整體輪廓和已報(bào)道的酵母源的MDN1蛋白質(zhì)較為相似［24］。已有的研究預(yù)測(cè)MDN1蛋白質(zhì)含有6個(gè)AAA結(jié)構(gòu)域（圖1A）［10］，借助I-TASSER軟件對(duì)該結(jié)構(gòu)域進(jìn)行模擬，結(jié)果如圖所示（圖3C）；進(jìn)一步對(duì)模擬結(jié)果通過(guò)UCSF Chimera［32］自動(dòng)匹配，大致確定了AAA結(jié)構(gòu)域在MDN1蛋白質(zhì)負(fù)染結(jié)構(gòu)模型中的位置（圖3D）。將我們的負(fù)染三維模型和已報(bào)道的酵母源MDN1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者的AAA結(jié)構(gòu)域在整體結(jié)構(gòu)中的定位是類似的（圖3D）［24］。這進(jìn)一步表明MDN1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在酵母和人之間是較為保守的。

3 討論

由于核糖體在細(xì)胞中的重要性，其裝配成熟過(guò)程一直是相關(guān)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。已有的研究表明，AAA-ATPase在pre-60S核糖體成熟和出核過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［10］。盡管MDN1功能有一些研究報(bào)道，也有研究者在2018年發(fā)表了酵母源MDN1的高分辨率結(jié)構(gòu)［24-25］，但是人源MDN1的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展緩慢，目前尚無(wú)任何高分辨率結(jié)構(gòu)的報(bào)道，這限制了研究人員對(duì)MDN1在哺乳動(dòng)物pre-60S核糖體成熟過(guò)程中發(fā)揮作用的分子機(jī)制的理解。雖然氨基酸序列分析表明酵母源與人源MDN1蛋白質(zhì)在某些結(jié)構(gòu)域有一定的保守性，但有研究認(rèn)為人源MDN1在pre-60S核糖體成熟過(guò)程中被招募的機(jī)制可能有所不同，與其相互作用的核糖體組裝因子也有所差異，例如在人源細(xì)胞中MDN1能夠被SUMO化的proline-，glutamic acid-and leucine-rich protein 1（PELP1）招募至pre-60S核糖體［20］。因此，解析人源MDN1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)于闡明哺乳動(dòng)物MDN1的具體功能和相關(guān)機(jī)制有重要的意義。

圖2負(fù)染電鏡分析MDN1蛋白質(zhì)Fig 2 Negative-staining electron microscopy analysis of MDN1

圖3 MDN1蛋白質(zhì)三維模型和AAA結(jié)構(gòu)域的定位Fig 3 Three-dimensional reconstruction of MDN1 and localization of AAA domains

MDN1蛋白質(zhì)分子量非常巨大，外源表達(dá)有一定的難度，并且整體結(jié)構(gòu)也不適合采用晶體結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法進(jìn)行解析，所以我們?cè)贓xpi293F細(xì)胞的MDN1蛋白質(zhì)的N端敲入親和純化標(biāo)簽FLAG，通過(guò)親和層析獲得少量的純化樣品進(jìn)行電鏡結(jié)構(gòu)解析。通過(guò)負(fù)染色技術(shù)和單顆粒重構(gòu)技術(shù)（single-particle），獲得了MDN1蛋白質(zhì)低分辨率三維結(jié)構(gòu)。從整體輪廓看，MDN1的結(jié)構(gòu)在人源細(xì)胞和酵母內(nèi)是較為保守的。另外，我們也利用結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分子對(duì)接的方法，初步確定人源MDN1的AAA結(jié)構(gòu)域在整體結(jié)構(gòu)中的定位。

MDN1屬于AAA-ATPase家族成員，該家族蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)結(jié)構(gòu)上非常保守的AAA結(jié)構(gòu)域，再組裝為功能活躍的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。不同于其他寡聚化的AAA-ATPase復(fù)合物，MDN1蛋白質(zhì)氨基酸序列包含有6個(gè)AAA結(jié)構(gòu)域，能夠通過(guò)自身的肽鏈折疊，形成相應(yīng)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，我們的負(fù)染結(jié)構(gòu)模型也表明人源MDN1是以單體的形式存在，并且有類似的AAA環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這和酵母源的MDN1是一致的。為了得到人源MDN1高分辨率的結(jié)構(gòu)，下一步我們將著重提高M(jìn)DN1的純化產(chǎn)量，嘗試?yán)鋬鲭婄R分析。由于采用Expi293F內(nèi)源表達(dá)的方法，獲得的MDN1純化樣品相對(duì)較少，6 L細(xì)胞得到的目的蛋白量為100～120μg，我們將通過(guò)擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)量，解決這個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)量限制問(wèn)題，以期獲得MDN1蛋白質(zhì)的冷凍電鏡高分辨結(jié)構(gòu)，闡明MDN1在pre-60S核糖體成熟中發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

參·考·文·獻(xiàn)

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