中華絨螯蟹表皮蛋白基因EsCAP的克隆與表達(dá)分析

儲(chǔ)俊東 刁澎云 李旭光 畢可然 周剛 周軍 鄧燕飛 許鄭超

摘要：以中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）為試驗(yàn)對(duì)象，克隆中華絨螯蟹表皮蛋白CAP基因序列，分析其表達(dá)規(guī)律，為探索中華絨螯蟹蛻皮發(fā)生機(jī)理提供參考。運(yùn)用生物信息學(xué)從中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中比對(duì)篩查表皮蛋白CAP基因序列信息，克隆擴(kuò)增獲得表皮蛋白CAP基因cDNA序列，運(yùn)用RT-qPCR分析表皮蛋白CAP基因在不同組織、不同發(fā)育階段和不同蛻皮時(shí)期的表達(dá)特征。結(jié)果表明，中華絨螯蟹表皮蛋白CAP基因cDNA序列全長380 bp，編碼101個(gè)氨基酸，包括1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)R&R結(jié)合域。表皮蛋白基因CAP主要在蛻皮后期的表皮組織中表達(dá)，在蛻皮間期不表達(dá);在不同發(fā)育階段的仔蟹1期表達(dá)量最高，根據(jù)其發(fā)育表達(dá)模式推測表皮蛋白基因CAP參與表皮的形成和鈣化，為后續(xù)深入研究表皮蛋白基因的生理功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中華絨螯蟹;表皮蛋白;基因克隆;mRNA表達(dá)

中圖分類號(hào)： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）08-0074-06

收稿日期：20200-08-11

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-48）;江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：BK20161602）;江蘇省漁業(yè)科技類重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：D2018-4）;江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項(xiàng)目（編號(hào)：PZCZ201748）;江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（中華絨螯蟹）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（編號(hào)：JATS[2019]386）;江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（編號(hào)：SJCX20_1269、SJCX20_1293）。

作者簡介：儲(chǔ)俊東（1996—），男，江蘇南通人，碩士研究生，主要從事水生甲殼類分子遺傳學(xué)研究。E-mail：qichenchu1@gmail.com。

通信作者：李旭光，副研究員，主要從事水生甲殼類繁育與生態(tài)養(yǎng)殖研究。Tel：（025）86851575;E-mail：xuguangli1981@163.com。

甲殼動(dòng)物的體表包裹著1層厚厚的外骨骼，它不但保護(hù)著甲殼動(dòng)物免受外來細(xì)菌和病毒的侵襲，還在其維持正常生命活動(dòng)和體態(tài)的建成中均發(fā)揮著非常重要的作用。甲殼類表皮由外向內(nèi)依次可分為上表皮、外表皮、內(nèi)表皮及真皮細(xì)胞，其中內(nèi)表皮是表皮皮層中的主要組成部分，主要由幾丁質(zhì)、表皮蛋白及鈣鹽等構(gòu)成[1]。堅(jiān)硬外骨骼雖然極大地增強(qiáng)了甲殼動(dòng)物的生存和適應(yīng)能力，但也限制了其生長。因此，甲殼類需要周期性地蛻去舊表皮，合成新表皮。甲殼類動(dòng)物的蛻皮周期主要分為蛻皮前期（D）、蛻皮期（E）、蛻皮后期（A、B）和蛻皮間期（C）4個(gè)階段。蛻皮前期（D），在蛻皮類調(diào)控激素的誘導(dǎo)下舊表皮被幾丁質(zhì)代謝酶類及蛋白水解酶類部分消化和再吸收，新表皮開始逐漸分泌形成;蛻皮期（E），機(jī)體舊表皮褪去，新表皮替代舊表皮;蛻皮后期（A、B），機(jī)體吸收大量水分迅速增長增質(zhì)量，同時(shí)表皮組織迅速鈣化;當(dāng)表皮鈣化終止，機(jī)體進(jìn)入蛻皮間期（C）[2-3]。

表皮蛋白是構(gòu)成甲殼類表皮的重要結(jié)構(gòu)蛋白，不同類型的表皮蛋白與長鏈幾丁質(zhì)相結(jié)合，從而影響表皮結(jié)構(gòu)及其性能。早期由于傳統(tǒng)的提取分離純化方法的局限性限制了對(duì)表皮蛋白的發(fā)掘，因此有關(guān)表皮蛋白種類與數(shù)量的報(bào)道較少。近年來，隨著基因組、轉(zhuǎn)錄組等測序技術(shù)的興起，大大加速了人們對(duì)于表皮蛋白的發(fā)現(xiàn)，目前已在一些模式昆蟲如黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、家蠶（Bombyx mori）及一些重要經(jīng)濟(jì)甲殼類如南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei）、紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）中鑒別出大量表皮蛋白基因家族[4-5]。其中，具有與幾丁質(zhì)相結(jié)合R&R結(jié)構(gòu)域（rebers & riddiford consensus）的CPR家族數(shù)量多、分布廣，是迄今為止表皮蛋白家族中含量最豐富的一個(gè)家族。根據(jù)R&R結(jié)構(gòu)域的保守型序列，CPR家族又可細(xì)分為RR-1、RR-2和 RR-3 等3 個(gè)亞家族。其中，RR-1亞族主要存分布于柔軟的未鈣化表皮;而RR-2亞族主要存在于堅(jiān)硬的鈣化表皮;RR-3家族數(shù)量最少，其分布特征還不太明確[6-7]。值得注意的是，在克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）中發(fā)現(xiàn)的一種特殊的鈣相關(guān)蛋白CAP-1和CAP-2，序列分析發(fā)現(xiàn)其屬于CPR家族，同時(shí)具有幾丁質(zhì)結(jié)合能力和抑制碳酸鈣沉淀的能力，這種具有多重功能的表皮蛋白是現(xiàn)在研究的重點(diǎn)。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）又稱河蟹，是重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蟹類，廣泛分布于我國東南沿海以及長江、甌江、遼河水域。江蘇是長江流域中華絨螯蟹的發(fā)源地和故鄉(xiāng)，跨江臨海，水網(wǎng)密布，河湖眾多，有著得天獨(dú)厚的發(fā)展河蟹繁育與養(yǎng)殖的自然條件。2018年，江蘇河蟹養(yǎng)殖面積2 666.67 km2，年產(chǎn)量32 萬t，總產(chǎn)值270 億元，總產(chǎn)量和總產(chǎn)值均占全國總量的1/2，河蟹養(yǎng)殖業(yè)成為江蘇漁業(yè)的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[8]。目前，有關(guān)甲殼類表皮蛋白的研究主要集中在蝦類和鰲蝦類上，有關(guān)短尾派中華絨螯蟹R&R型表皮蛋白還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過轉(zhuǎn)錄組結(jié)合分子克隆獲得中華絨螯蟹表皮蛋白CAP（calcification-associated peptide）cDNA序列，命名為EsCAP，采用定量PCR檢測EsCAP在不同組織的分布，分析EsCAP在不同發(fā)育階段以及蛻皮周期的表達(dá)規(guī)律，為后續(xù)進(jìn)一步研究其在蛻皮生長中的功能作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2019年4月從江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚(yáng)中基地挑取健康中華絨螯蟹1齡幼蟹作為試驗(yàn)樣本，運(yùn)至江蘇省淡水水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室室溫下暫養(yǎng)并開展后續(xù)試驗(yàn)，水深50 cm，使用空氣泵不間斷通氧，確保養(yǎng)殖時(shí)箱內(nèi)水體溶氧。試驗(yàn)開展期間采用人工飼料飼喂，每晚喂食，早上對(duì)水族箱底部污物進(jìn)行及時(shí)的清理，保證養(yǎng)殖水環(huán)境清潔。

1.2 主要試劑

Total RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，PCR試劑購自生工生物（上海）股份有限公司，qPCR試劑（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 和熒光染料 ROX） 購自寶生物工程（大連）有限公司，DNA marker、PUCm-T載體、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 組織樣品的收集

參考甲殼類分期方法，根據(jù)中華絨螯蟹殼色與硬度等形態(tài)學(xué)特征分為蛻皮前期（D）、蛻皮后期（A、B期）、蛻皮間期（C期）4個(gè)蛻皮時(shí)期。蛻皮前期（D），外表皮內(nèi)陷，新的外表皮建逐漸形成，新生剛毛逐步從舊剛毛中分離;蛻皮后期（A期），中華絨螯蟹剛剛從老舊的殼中掙脫出來，新生殼柔軟黑亮而有彈性;蛻皮后期（B期），新生表皮開始鈣化，新殼逐漸硬化，體長固定;蛻皮間期（C期），新表皮鈣化完成，中華絨螯蟹開始大量攝食，進(jìn)行營養(yǎng)積累，為下次蛻皮做準(zhǔn)備。分別采集中華絨螯蟹蛻皮間期與蛻皮后期（B期）表皮、肝胰腺、肌肉、鰓、眼柄、附肢、心臟、腸道、胃、血淋巴共10個(gè)組織樣本。在解剖樣品前先對(duì)樣品進(jìn)行清洗并用冰袋降低中華絨螯蟹的活躍度。采集中華絨螯蟹受精卵、溞1期（ZⅠ）、溞3期（ZⅢ）、溞5期（ZⅤ）、大眼幼體和仔蟹1期6個(gè)不同發(fā)育階段的個(gè)體樣本。所有收集樣本經(jīng)液氮冷卻后放在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA的提取與cDNA的逆轉(zhuǎn)錄

用TaKaRa Mini BEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取中華絨螯蟹各組織、不同蛻皮時(shí)期表皮和不同發(fā)育階段個(gè)體總RNA。提取出的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)檢測其濃度，測完后立即置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑說明書進(jìn)行，獲得第1鏈cDNA，用于RT-qPCR反應(yīng)，合成之后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 設(shè)計(jì)引物

利用在線設(shè)計(jì)引物軟件Primer 3 input設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增全長引物EsCAP F1/R1，由表1可知PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s;55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。配制1%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，回收所需DNA片段，之后按照FastPureGel DNA Extraction Mini Kit試劑盒進(jìn)行純化操作。純化后的產(chǎn)物與PUCm-T載體結(jié)合，將結(jié)合產(chǎn)物導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取目的菌落。經(jīng)PCR篩選后送到生工生物（上海）股份有限公司測序。獲得EsCAP開放閱讀框（ORF）后，再設(shè)計(jì)定量引物RT-EsCAP F2/R2并用以進(jìn)行RT-qPCR。

1.6 RT-qPCR檢測

以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，無菌超純水為陰性對(duì)照，采用RT-qPCR（SYBR Green）檢測表皮蛋白CAP在不同組織、不同蛻皮時(shí)期和不同發(fā)育階段的表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min，1次循環(huán);PCR反應(yīng)95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后獲得擴(kuò)增曲線。反應(yīng)在LightCycler480熒光定量PCR儀上進(jìn)行，設(shè)cDNA樣品3次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后采集目標(biāo)基因的CT值（C表示循環(huán)數(shù);T表示熒光閾值）和內(nèi)參基因的CT值，qRT-PCR結(jié)果采用2-ΔΔCT法分析，數(shù)據(jù)處理和作圖使用Excel和Sigma Polt 14.0軟件，結(jié)果均以“x±s”表示。采用SPSS軟件的鄧肯法分析EsCAP表達(dá)量是否具有顯著差異。

1.7 生物信息學(xué)分析

用DNA MAN 軟件將所得的DNA序列翻譯成蛋白序列，用Edit seq軟件對(duì)蛋白序列理化性質(zhì)和相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測，用NCBI在線工具ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）搜索EsCAP開放閱讀框;從NCBI數(shù)據(jù)庫中用BLASTP程序檢索氨基酸同源性序列，并用Clustalw2和Genedoc軟件對(duì)中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP基因和檢索出的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，用DNA MAN對(duì)其進(jìn)行序列一致性分析，使用在線軟件SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)行氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域分析，使用cuticleDB（http：//bioinformatics2.biol.uoa.gr/cuticleDB/index.jsp）在線分析R&R序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華絨螯蟹表皮蛋白基因EsCAP cDNA的序列分析

序列結(jié)果顯示，中華絨螯蟹表皮蛋白基因EsCAP cDNA序列全長380 bp，其中包括29 bp的5′端非編碼區(qū)、45 bp 3′端非編碼區(qū)和306 bp的開放閱讀框，共編碼101個(gè)氨基酸殘基（GenBank登陸號(hào)為MT771647）。編碼蛋白的理化性質(zhì)分析預(yù)測該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為10.9 ku，理論等電點(diǎn)為387。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果（圖1）表明，中華絨螯蟹EsCAP氨基酸序列主要有1個(gè)信號(hào)肽、1個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域ChtBD4和1個(gè)低復(fù)雜度區(qū)域。其中，幾丁質(zhì)結(jié)合域包含R&R保守序列Gx8Gx6YxAxExGYx7P（其中x表示多個(gè)氨基酸占據(jù)的位置，數(shù)字表示氨基酸的數(shù)目），表明EsCAP屬于RR1亞族。此外，EsCAP氨基酸序列C端富含天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸，屬于典型酸性蛋白。

2.2 中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP的同源性分析

由圖2可知，與其他甲殼類表皮蛋白基因序列比較發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP氨基酸序列與藍(lán)蟹（Callinectes sapidus）、南美白對(duì)蝦、克氏原螯蝦（P. clarkii）、遠(yuǎn)海梭子蟹（Portunus pelagicus）的表皮蛋白相似度在40.6%～59.5%間。其中，中華絨螯蟹EsCAP與克氏原螯蝦CAP2氨基酸序列同源性最高，為59.5%。采用Mega 6.0軟件對(duì)包括中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP在內(nèi)的12組表皮蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。使用軟件中的Neighbor-Joining（NJ）方法，進(jìn)行1 000次獨(dú)立分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果（圖3）表明，中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP與其他蝦蟹類酸性表皮蛋白聚類為一支，而昆蟲類表皮蛋白聚為另一支，系統(tǒng)進(jìn)化樹表明EsCAP與蝦蟹類CAP類表皮蛋白同源性較高。

2.3 中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP在不同組織中的表達(dá)

由圖4可知，以中華絨螯蟹肌球蛋白β-actin為內(nèi)參對(duì)照，通過RT-qPCR方法檢測中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP的組織分布情況。結(jié)果表明，EsCAP在蛻皮間期不表達(dá)，主要在蛻皮后期的表皮組織中表達(dá)。

2.4 中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP在不同蛻皮時(shí)期的表達(dá)

選取中華絨螯蟹蛻皮前期（D）、蛻皮后期（A、B）、蛻皮間期（C）的表皮組織，以中華絨螯蟹肌球蛋白基因β-action為內(nèi)參對(duì)照，通過RT-qPCR方法檢測中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP基因在不同蛻皮時(shí)期的表達(dá)。由圖5可知， 中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP進(jìn)入到蛻皮前期（D）表達(dá)量較低，到蛻皮后期（A、B）高表達(dá)，在蛻皮間期（C）不表達(dá)。中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP在蛻皮時(shí)期的表達(dá)趨勢與表皮形成及鈣化時(shí)間相一致。

2.5 中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

選取中華絨螯蟹受精卵、溞1期（ZⅠ）、溞3期（ZⅢ）、溞5期（ZⅤ）、大眼幼體和仔蟹1期共6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期個(gè)體，以中華絨螯蟹肌球蛋白β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，通過RT-qPCR方法來檢測EsCAP基因的表達(dá)趨勢。由圖6可知，表皮蛋白EsCAP基因在受精卵時(shí)期表達(dá)最低，進(jìn)入到溞狀幼體時(shí)期與大眼幼體時(shí)期表達(dá)量有所升高，到仔蟹1期表達(dá)量明顯升高，EsCAP的表達(dá)量隨著中華絨螯蟹發(fā)育階段的推進(jìn)而產(chǎn)生變化，總體呈升高的趨勢。

3 討論與結(jié)論

表皮蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合構(gòu)成支撐機(jī)體抵御外界不良環(huán)境的外骨骼，在甲殼類的生長發(fā)育及蛻皮硬化中具有重要的作用[3]。甲殼類表皮蛋白數(shù)量龐大，根據(jù)其保守序列的不同，可分為CPR、CPAP、Crust-18、postmolt-18等家族，其中具有R&R保守結(jié)構(gòu)域序列的CPR家族分布最為廣泛，在甲殼類與昆蟲中均存在[9-10]。本研究克隆獲得的中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP含有與幾丁質(zhì)結(jié)合的R&R結(jié)構(gòu)域，屬于CRP家族中RR-1亞類，對(duì)中華絨螯蟹表皮的形成是至關(guān)重要的。EsCAP蛋白的N端與C端富含親水氨基酸，如丙氨酸、纈氨酸、脯氨酸和甘氨酸，親水性強(qiáng)，主要分布于未鈣化的表皮，通過R&R結(jié)構(gòu)域與幾丁質(zhì)相結(jié)合，多肽N端和C端區(qū)域延伸至纖維間隙，形成水填充的非共價(jià)鍵網(wǎng)絡(luò)，對(duì)保持表皮的柔韌性不可或缺[5]。此外EsCAP蛋白的C端富含天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸，等電點(diǎn)為3.87，是個(gè)典型的酸性分子。酸性大分子在表皮的硬化過程中起著至關(guān)重要的作用[11-12]。在日本對(duì)蝦（Penaeus japonicus）蛻皮后期尾扇表皮組織中克隆獲得DD4（后來命名為Crustocalcin）和DD5酸性表皮蛋白，具有鈣結(jié)合能力[13-14]。從克氏原螯蝦表皮基質(zhì)中分離純化出2種鈣化相關(guān)肽CAP-1和CAP-2，富含酸性氨基酸[15-16]。其中，CAP-1的鈣結(jié)合能力明顯大于CAP-2，這與CAP-1酸性氨基酸的數(shù)量多，在C末端分布更為集中有關(guān)[15-16]。中華絨螯蟹EsCAP氨基酸殘基結(jié)構(gòu)和分布與其他鈣化相關(guān)肽相似，是否具有鈣離子結(jié)合能力還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

雖然R&R保守結(jié)構(gòu)域具有一定的保守性，但甲殼類表皮蛋白CAP在不同物種之間的相似度并不高。EsCAP與其他蝦蟹類相似度在50%左右，與昆蟲類相似度在30%左右（圖2），這遠(yuǎn)低于同一親緣關(guān)系水平的相似度。而近源的一些蝦蟹類表皮蛋白CAP之間的相似度也不高，克氏原螯蝦CAP-1與CAP-2的氨基酸相似度為46.2%。雖然表皮蛋白EsCAP的氨基酸殘基相似性不高，但是該基因結(jié)構(gòu)域保守序列位點(diǎn)非常保守。根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測，這些保守位點(diǎn)是R&R結(jié)構(gòu)域形成β折疊構(gòu)象的關(guān)鍵位點(diǎn)，影響著與幾丁質(zhì)結(jié)合[17-18]。

表皮蛋白基因的表達(dá)具有明顯的組織分布差異性與時(shí)期特異性。中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP僅在蛻皮后期的表皮組織中高表達(dá)，而在其他時(shí)期以及其他組織中幾乎不表達(dá)，具有明顯的時(shí)空表達(dá)特異性（圖4、圖5）。這與藍(lán)蟹表皮蛋白CAP、克氏原螯蝦表皮蛋白CAP-2和CAP-1、日本對(duì)蝦表皮蛋白DD4和DD5基因的表達(dá)趨勢一致，均集中于蛻皮后期的表皮組織中高表達(dá)[11，13-16]。剛完成蛻皮后的甲殼類新表皮吸水后迅速延展，這一時(shí)期的表皮組織正伴隨著表皮的快速擴(kuò)張和鈣化，具有幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域的表皮蛋白EsCAP可能通過R&R結(jié)構(gòu)域與幾丁質(zhì)結(jié)合形成幾丁質(zhì)纖維復(fù)合物框架，參與新表皮的形成[19-20];與此同時(shí)，EsCAP中的酸性氨基酸與鈣離子相結(jié)合，促進(jìn)表皮組織碳酸鈣沉淀，加速表皮鈣化進(jìn)程[21-22]。在不同發(fā)育時(shí)期，中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP在仔蟹1期的表達(dá)量最高，這與一些昆蟲類RR1型表皮蛋白的表達(dá)趨勢相似[23]。中華絨螯蟹從受精卵的孵化到仔蟹的發(fā)育，表皮的積累也越來越多，至仔蟹期表皮結(jié)構(gòu)基本成型，表皮代謝需求量大，暗示表皮蛋白CAP可能參與不同發(fā)育階段新表皮的合成。

中華絨螯蟹表皮蛋白EsCAP具有典型的R&R幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，富含大量酸性氨基酸殘基，主要在蛻皮后期的表皮組織中表達(dá)，推測EsCAP可能參與表皮的形成與鈣化，其具體功能還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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