同卵、異卵、非雙胞胎外周血TCRβ鏈假基因和功能性CDR3受體庫前后5年動態(tài)變化分析①

蘇丹華 董曉衡 賀曉燕 王小妹 馬 銳 馬 龍 姚新生（遵義醫(yī)科大學(xué)免疫教研室貴州省基因檢測治療與特色重點實驗室，貴州省免疫分子工程研究中心，遵義563000）

T細胞受體（αβ異二聚體）通過識別抗原提呈細胞提呈的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）-抗原肽復(fù)合物參與機體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答［1］。影響個體外周T細胞TCR受體庫的主要因素包括：①TCR初始重組中各V（D）J基因的取用和配對；②胸腺中TCR自身耐受過程中的選擇；③外周環(huán)境中TCR應(yīng)答的克隆增生。

多項研究證實，T/B細胞在進行自身抗原選擇前的V（D）J重組并非“隨機”，如重組信號序列（RSSs）中的七聚體/九聚體保守性［2］；12 bp/23 bp間隔子的序列和長度［3-4］；V（D）J基因片段的近端/遠端間距等［5-6］，均會造成T/B細胞在自身抗原耐受選擇前受體庫的特征性差異，提示個體遺傳因素對V（D）J重組中的偏向性作用。T細胞在初始重排后，在胸腺中與MHC-自身抗原進行耐受選擇，輸出到外周并形成個體初始獨特的T細胞受體庫［1，7-9］。

人雙胞胎是研究T細胞受體庫差異形成機制的最適研究對象，早期采用CDR3譜系等技術(shù)研究同卵雙胞胎T細胞受體庫的特征，發(fā)現(xiàn)同卵雙胞胎在腫瘤、自身免疫病等疾病中，TCR受體庫存在部分同質(zhì)性［10-14］。隨著高通量測序技術(shù)在T/B細胞受體庫解析中的應(yīng)用，ZVYAGIN等［15］、RUBELT等［16］、MAYER等［17］、JIANG等［18］、HEIKKIL?等［19］利 用TCRCDR3受體庫的數(shù)據(jù)探討同卵雙胞胎TCR受體庫的差異性和免疫特性的差異性，總體結(jié)果提示同卵雙胞胎V、D、J取用的相似性表明了遺傳因素在重組過程中的重要性。總體上，在目前探討雙胞胎的特異遺傳因素對T細胞（或B細胞）V（D）J重排的影響研究中，提示框架外重排CDR3受體庫和遺傳因素密切相關(guān)，而功能性CDR3受體庫因受到復(fù)雜環(huán)境因素的影響，其體內(nèi)研究存在一定困難，這些初步的研究為TCR的經(jīng)典隨機重排理論中可能和“遺傳”存在聯(lián)系的研究提供基礎(chǔ)［20］。

假基因重排后形成的CDR3序列不參與自我耐受的選擇和外界環(huán)境中的免疫應(yīng)答，理論上更能反映個體遺傳因素對V（D）J重排的影響［21-24］。本實驗對比分析同卵、異卵和非雙胞胎的TCRβ鏈外周血假基因CDR3受體庫、功能性CDR3受體庫前后5年的動態(tài)變化，以分析雙胞胎假基因CDR3受體庫為創(chuàng)新點，為進一步解析個體遺傳因素對V（D）J重組、耐受選擇和適應(yīng)性應(yīng)答的效應(yīng)和機制提供基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料 兩對同卵雙胞胎和一對異卵雙胞胎健康志愿者基本信息見網(wǎng)絡(luò)版附表1（http://www.immune99.com），本實驗獲得3對雙胞胎志愿者知情同意并獲得遵義醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA樣本制備 2012年和2017年分別采集3對健康雙胞胎志愿者（A、B、c）的外周血各10 ml（2012年的采集由課題組完成），實時分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）并提取總DNA，以總DNA為模版進行TCRβCDR3建庫。

1.2.2 HLA分型檢測 將3對雙胞胎志愿者的DNA樣本送至北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司進行HLA分型檢測。

1.2.3 TCRβCDR3受體庫的構(gòu)建和測序 設(shè)計合成人TRBV基因家族上游引物30條，TRBJ下游引物14條，GAPDH對照上下游引物2條，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司（上海）合成（網(wǎng)絡(luò)版附表2、3、4，http://www.immune99.com）。2012年將3對雙胞胎DNA樣本送至美國華盛頓醫(yī)院（美國華盛頓），采用多重PCR技術(shù)，建立TCRβCDR3受體庫。2017年將3對雙胞胎DNA樣本送至華大基因（湖北武漢），采用多重PCR技術(shù)，構(gòu)建TCRβCDR3受體庫，2012和2017年均采用Illumina Solexa高通量技術(shù)對各樣本的TCRβCDR3受體庫進行測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計分析 將高通量測序的CDR3序列轉(zhuǎn)換為FASTA格式并上傳IMGT數(shù)據(jù)庫，對IMGT下載的數(shù)據(jù)進行篩選：①篩除“No results”序列；②篩除“Unkown functionality”序列；③篩除“Warnings”序列；④篩除“Junction frame=null”序列；⑤篩除104位不是“cysteine，C”或118位不是“Phenylalanine，F(xiàn)”的氨基酸序列。將篩選的CDR3序列分為假基因CDR3序列和功能性CDR3序列，本文所有圖均用Pseudogene CDR3表示假基因CDR序列，Productive CDR3表示功能性CDR序列。采用Excel軟件、IMGT/HighV-QUEST（http：//www.imgt.org）軟件、Graphpad Prism8.0軟件、Heml、SPSS22（配對T檢驗）和Draw Venn Diagram在線軟件工具等分析每個樣本。a.克隆增殖分析（多樣性分析）：采用反辛普森指數(shù)（the inverse Simpson′s diversity index，1/DS）分析功能性CDR3受體庫的克隆增殖，計算公式為1/DS=1/∑｛ni×（ni-1）｝/｛n×（n-1）｝，ni指第i條序列的總數(shù)，1/DS數(shù)值越高則多樣性越豐富，獨特序列的頻率按從高到低進行排序，Y軸用Log10來展現(xiàn)頻率大?。?5-26］。b.基因取用分析：TRBV/TRBJ基因家族前后5年的取用頻率變化。c.V-J配對：V（D）和J連接或V和（D）J連接。c.核苷酸剪切與插入：在V（D）J連接處有核苷酸的剪切與插入。d.CDR3長度和AA取用：TCRβCDR3區(qū)有不同長度的AA序列，用不同長度的氨基酸序列表征CDR3長度；CDR3區(qū)不同氨基酸的取用頻率不同。e.前后5年Overlap重疊：將個體內(nèi)前后5年重疊的氨基酸數(shù)目、同卵雙胞胎之間前后5年重疊的氨基酸數(shù)目、異卵雙胞胎之間前后5年重疊的氨基酸數(shù)目進行標(biāo)準(zhǔn)化分析，兩個個體之間重疊的數(shù)目為a，兩個個體各自獨特的氨基酸數(shù)目為M和N，標(biāo)準(zhǔn)化的方法為a/M×N，并將標(biāo)準(zhǔn)化的重疊進行統(tǒng)計分析［8］。

本研究2012年和2017年采集的3對雙胞胎分為5年前（A1-2012、A2-2012、B1-2012、B2-2012、c1-2012、c2-2012）和5年后（A1-2017、A2-2017、B1-2017、B2-2017、c1-2017、c2-2017），采用配對T檢驗對雙胞胎前后5年進行統(tǒng)計，對比分析同卵雙胞胎（A1/A2，B1/B2），異卵雙胞胎（c1/c2）和非雙胞胎（A1/B1，A1/c1，A1/c2，B1/c1，B1/c2）TCRβ CDR3受體庫前后5年的動態(tài)變化。以下圖中分別用MZ（monozygotic，MZ）代表同卵雙胞胎，DZ（dizygotic，DZ）代表異卵雙胞胎，NT（non twins，NT）代表非雙胞胎。*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001。

2 結(jié)果

2.1 3對雙胞胎志愿者的HLA分型 根據(jù)HLA定型，A1/A2，B1/B2是同卵雙胞胎；c1/c2是異卵雙胞胎。對同卵雙胞胎具有相同的MHC等位基因譜，1對異卵雙胞胎至少有1個不同的MHC等位基因譜（表1）。

2.2 3對雙胞胎志愿者前后5年TCRβCDR3受體庫數(shù)目 3對雙胞胎志愿者前后5年高通量測序（high throughput sequencing，HTS）的TCRβ鏈假基因CDR3序列、功能性CDR3序列中的unique/total數(shù)目和比例見網(wǎng)絡(luò)版附表5、6（http://www.immu ne99.com）。

2.3 3對雙胞胎志愿者TCRβ鏈功能性CDR3受體庫前后5年多樣性分析 3對雙胞胎前后5年的克隆增殖情況差異（圖1A），且前后5年的1/DS差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1B）。

2.4 同卵、異卵和非雙胞胎TCRβCDR3受體庫TRBV/TRBJ基因家族頻率、V-J配對前后5年對比分析TRBV基因取用：在TCRβ鏈假基因CDR3受體庫中，TRBV2 1-1和TRBV3-2基因家族頻率在前后5年有統(tǒng)計學(xué)差異（圖2A），且在同卵雙胞胎之間前后5年變化一致（圖2B、C），但在異卵雙胞胎之間和非雙胞胎之間前后5年變化不一致（圖2D～I）。在TCRβ鏈功能性CDR3受體庫中，10/48個TRBV基因家族取用頻率前后5年有統(tǒng)計學(xué)差異，45/48個基因家族（2對雙胞胎的均值）取用頻率在同卵雙胞胎之間前后5年變化一致（網(wǎng)絡(luò)版附圖1B、C，http://www.immune99.com），43/48個基因家族取用頻率在異卵雙胞胎之間前后5年變化一致（網(wǎng)絡(luò)版附圖1D，http://www.immune99.com）。45/48個基因家族（5對異卵雙胞胎均值）取用頻率在非雙胞胎之間前后5年變化一致（網(wǎng)絡(luò)版附圖2，http://www.immune99.com）。以上結(jié)果提示，假基因CDR3受體庫中同卵雙胞胎之間TRBV的動態(tài)變化更為一致。

TRBJ基因取用：在TCRβ鏈假基因CDR3受體庫中，2/14個TRBJ基因家族取用頻率前后5年有統(tǒng)計學(xué)差異，10/14個TRBJ基因家族取用頻率在同卵、異卵和非雙胞胎之間前后5年變化一致（圖3）。在TCRβ鏈功能性CDR3受體庫中，5/14個TRBJ基因家族取用頻率前后5年有統(tǒng)計學(xué)差異，9/14個TRBJ基因家族取用頻率在同卵雙胞胎之間、異卵雙胞胎之間、非雙胞胎之間前后5年變化一致（網(wǎng)絡(luò)版附圖3，http://www.immune99.com）。以上結(jié)果提示，TCRβ鏈假基因CDR3序列和功能性CDR3序列中，TRBJ的動態(tài)變化在同卵、異卵和非雙胞胎之間相似。

表1 3對雙胞胎HLA-A、B、C和DRB1基因分型結(jié)果Tab.1 HLA-A，B，C and DRB1 genotyping results of 3 pairsof twins

V-J配對：聚類分析的枝長越短，表示個體之間越相似。在TCRβ鏈假基因CDR3受體庫中，同卵雙胞胎之間前后5年差異最相似，異卵雙胞胎次之，非雙胞胎之間隨機分布（圖4A）；在TCRβ鏈功能性CDR3受體庫中，同卵、異卵和非雙胞胎前后5年差異隨機分布（圖4B）。

圖2 同卵、異卵和非雙胞胎TCRβ鏈假基因CDR3受體庫TRBV基因取用前后5年對比分析Fig.2 Comparison for TRBV gene usage of TCRβchain pseudogene CDR3 repertoires before and after 5 years among MZ，DZ and NT

2.5 同卵、異卵和非雙胞胎TCRβCDR3受體庫核苷酸插入和刪除前后5年對比分析 本實驗將同卵、異卵和非雙胞胎前后5年插入和刪除的核苷酸平均數(shù)目進行分析。在TCRβ鏈假基因CDR3受體庫中，VD insertions、V deletions和Jdeletions的平均數(shù)目前后5年具有統(tǒng)計學(xué)差異（圖5A），但在同卵雙胞胎之間前后5年變化一致（圖5B、C），VD insertions、V deletions的平均數(shù)目在異卵雙胞胎之間和非雙胞胎之間前后5年變化不一致（圖5D～I）。在TCRβ鏈功能性CDR3受體庫中，VD insertions、DJ insertions、V deletions和Jdeletions的平均數(shù)目前后5年具有統(tǒng)計學(xué)差異（網(wǎng)絡(luò)版附圖4A，http://www.immune99.com），但其5年動態(tài)變化在同卵、異卵和非雙胞胎之間無顯著差異（網(wǎng)絡(luò)版附圖4B～I，http://www.immune99.com）。

圖3 同卵、異卵和非雙胞胎TCRβ鏈假基因CDR3受體庫TRBJ取用前后5年對比分析Fig.3 Comparison for TRBJ gene usage of TCRβchain pseudogene CDR3 repertoires before and after 5 yearsamong MZ，DZ and NT

圖4 同卵、異卵和非雙胞胎TCRβCDR3受體庫V-J配對5年差異的聚類分析Fig.4 Cluster Analysis for V-J pairing 5-year differences of TCRβCDR3 repertoires among MZ，DZ and NT

圖5 同卵、異卵和非雙胞胎TCRβ鏈假基因CDR3受體庫核苷酸插入與刪除平均數(shù)目前后5年對比Fig.5 Comparison for average number of nucleotides insertions and deletions of TCRβchain pseudogene CDR3 repertoires before and after 5 years among MZ，DZ and NT

圖6 同卵、異卵和非雙胞胎和個體內(nèi)TCRβCDR3受體庫前后5年標(biāo)準(zhǔn)化的Overlap統(tǒng)計Fig.6 Statistics of Overlap normalized of TCRβCDR3 repertoires before and after 5 years among MZ，DZ，NT and within donor

2.6 同卵、異卵和非雙胞胎TCRβ鏈功能性CDR3受體庫AA取用以及AA長度前后5年分析 同卵、異卵和非雙胞胎CDR3受體庫的AA取用和AA長度分布前后5年差異隨機分布（網(wǎng)絡(luò)版附圖5，http://www.immune99.com）。

2.7 同卵、異卵和非雙胞胎TCRβCDR3受體庫Overlap前后5年分析 在TCRβ鏈假基因CDR3受體庫和功能性CDR3受體庫中，個體內(nèi)前后5年的Overlap比率大于同卵雙胞胎、異卵雙胞胎和非雙胞胎前后5年的重疊比率，同卵、異卵和非雙胞胎之間前后5年的Overlap比率無統(tǒng)計學(xué)差異（圖6和網(wǎng)絡(luò)版附圖6、7，http://www.immune99.com）。

3 討論

人雙胞胎更適合探討遺傳和環(huán)境因素影響機體的生理和病理機制［27］。在T細胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答效應(yīng)和機制的差異性研究中，早期采用CDR3譜型分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在腫瘤、感染、自身免疫病的T細胞應(yīng)答受體庫中，同卵雙胞胎之間存在一定的同質(zhì)性［10］。在個體遺傳因素對T細胞受體庫初始重排和胸腺耐受選擇的影響研究中，ZVYAGIN等［15］的結(jié)果顯示，3對同卵雙胞胎內(nèi)αβTCR的V基因取用在in frame和out of frame中都表現(xiàn)出高度相似性，而α鏈的J基因取用在out of frame中與遺傳關(guān)系不大，但在in frame中雙胞胎表現(xiàn)出高度相關(guān)性。RUBELT等［16］量化了遺傳因素對V（D）J重組過程和胸腺選擇的影響，發(fā)現(xiàn)V（D）J取用和N/P長度的偏差導(dǎo)致CDR3區(qū)域的顯著變化。HEIKKIL?等［20］研究發(fā)現(xiàn)，框架外重排CDR3和功能性CDR3序列中的V/J基因取用及框架外重排CDR3序列的Overlap存在遺傳偏向性，而CDR3的AA長度分布及非模板核苷酸的插入比較隨機。

因獲取人類胸腺和外周T細胞受體庫的樣本對照研究有一定困難，個體遺傳因素對人T細胞受體庫的初始重排和胸腺中耐受選擇的具體效應(yīng)和詳細機制的闡明，有待在雙胞胎等特殊研究對象中獲取更多研究數(shù)據(jù)。本實驗以同卵、異卵和非雙胞胎為研究對象，采用HTS技術(shù)詳細對比分析TCRβ鏈假基因CDR3受體庫和功能性CDR3受體庫前后5年的動態(tài)變化，研究主要發(fā)現(xiàn)：

（1）同卵、異卵和非雙胞胎外周血總T細胞TCRβ鏈功能性CDR3受體庫前后5年的克隆增殖（多樣性）分析發(fā)現(xiàn)，前后5年的克隆增殖情況無顯著差異，且前后5年的1/DS無統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)回訪，5年期間雙胞胎A、B、c彼此之間生活在同一城市。個體外周血總T細胞受體庫多樣性除了源于基因片段的組合多樣性和核苷酸插入與刪除的連接多樣性，還與年齡、環(huán)境應(yīng)答等多種因素密切相關(guān)［28］。而基因片段的組合與核苷酸的插入和刪除在重組階段完成，且ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］的結(jié)果提示核苷酸的插入和刪除有遺傳偏向性。本研究提示在健康雙胞胎之間的環(huán)境沒有顯著不同的情況下，外周血總T細胞TCRβ鏈功能性CDR3受體庫的多樣性在前后5年無顯著差異。

（2）同卵、異卵和非雙胞胎TCRβCDR3受體庫TRBV/TRBJ基因家族頻率、V-J配對前后5年對比分析發(fā)現(xiàn)，在TCRβ鏈假基因CDR3受體庫中，TRBV21和TRBV3-2取用頻率前后5年具有統(tǒng)計學(xué)差異，且在同卵雙胞胎之間前后5年變化一致；而TRBJ基因家族取用頻率前后5年的動態(tài)變化在同卵、異卵和非雙胞胎之間無顯著差異；在TCRβ鏈功能性CDR3受體庫中，TRBV/TRBJ基因家族取用頻率前后5年的動態(tài)變化在同卵、異卵和非雙胞胎之間無顯著差異。TCRβ鏈假基因參與重排形成的無功能的CDR3序列，間接或被動地參與中樞選擇（假基因重排，導(dǎo)致另一條染色體重排參與中樞選擇），因此更能用于表征初始重組和胸腺選擇后的T細胞初始庫［21-24］。ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］的結(jié)果提示，T細胞初始重排階段TRBV/TRBJ基因取用具有遺傳偏向性。本研究提示TCRβ鏈假基因CDR3受體庫中，TRBV基因取用前后5年的動態(tài)變化受遺傳因素調(diào)控，而TRBV基因家族（功能性CDR3受體庫）及TRBJ基因家族（假基因CDR3受體庫和功能性CDR3受體庫）前后5年的動態(tài)變化與遺傳因素關(guān)系不密切，本實驗的結(jié)果與ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］的結(jié)果部分一致（TRBV基因），更進一步地證實了個體遺傳因素對T細胞TRBV基因的偏向性等效應(yīng)，而功能性CDR3受體庫受到環(huán)境因素影響，可能是環(huán)境因素削弱了同卵、異卵和非雙胞胎之間的差異。

本實驗進一步分析TCRβCDR3受體庫V-J配對前后5年的動態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，在TCRβ鏈假基因CDR3受體庫中，同卵雙胞胎之間前后5年動態(tài)變化最相似，異卵雙胞胎次之；在TCRβ鏈功能性CDR3受體庫，同卵雙胞胎、異卵雙胞胎和非雙胞胎前后5年動態(tài)變化無顯著差異。

假基因CDR3受體庫可表征胸腺選擇之前的TCR受體庫，而最初的重排中，調(diào)控V-D-J配對選擇的因素非常復(fù)雜，V-J的配對取用與個體遺傳因素相關(guān)的七聚體/九聚體的保守性、12/23間隔、V-D-J之間的間距等“調(diào)控”因素相關(guān)［2-6］。本部分實驗結(jié)果提示，在5年期間假基因CDR3受體庫中，V-J配對的變化受遺傳因素調(diào)控，進一步提示了遺傳因素對V-J配對的調(diào)控作用。

（3）同卵、異卵和非雙胞胎TCRβCDR3受體庫核苷酸插入和刪除前后5年對比分析發(fā)現(xiàn)，在TCR β鏈假基因CDR3受體庫中，核苷酸插入與刪除的平均數(shù)目在同卵雙胞胎之間前后5年變化更一致；在TCRβ鏈功能性CDR3序列中，同卵、異卵和非雙胞胎之間無顯著差異。CDR3受體庫的多樣性除了與參與V（D）J基因家族的重組有關(guān)，其進一步的多樣性是由于在V→D（N1）和D→J（N2）的連接處添加了“N”核苷酸，核酸外切酶修剪（3′V trimmed，5′D trimmed，3′D trimmed and 5′Jtrimmed）并添加回文“P”核苷酸（P3′V，P5′D，P3′D and P5′J）。VD insertions=P3′V+N1+P5′D；DJ insertions=P3′D+N2+P5′J；V deletions=3′V trimme；D5 deletions=5′D trimmed；D3 deletions=3′D trimmed；Jdeletions=5′Jtrimmed［21］。核苷酸插入和刪除主要由核酸外切酶和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）完成［29］。核苷酸的插入與刪除發(fā)生在V（D）J的初始重排過程，理論上認為插入與刪除是“隨機的”，特征性插入與刪除與胸腺的耐受選擇和外周適應(yīng)性應(yīng)答相關(guān)。ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］的研究結(jié)果提示TCRβ鏈CDR3受體庫中核苷酸的剪切和插入受遺傳因素影響。本實驗進一步提示核苷酸的插入和刪除前后5年的動態(tài)變化受遺傳因素調(diào)控，而在功能性CDR3受體庫中，同卵、異卵和非雙胞胎前后5年的動態(tài)變化一致，提示外周T細胞受體庫中的環(huán)境因素可能削弱初始T細胞受體庫中的差異。盡管造成假基因CDR3受體庫中插入與刪除差異的機制沒有闡明，但以同卵和異卵雙胞胎為研究對象，分析突出的CDR3受體庫的動態(tài)變化，特別是假基因CDR3序列，可為進一步的研究提供基礎(chǔ)和手段。

（4）同卵、異卵和非雙胞胎TCRβ鏈功能性CDR3受體庫AA取用以及AA長度前后5年分析發(fā)現(xiàn)，同卵、異卵和非雙胞胎前后5年差異隨機分布，進一步提示了遺傳因素與TCRβ鏈功能性CDR3受體庫的AA取用及CDR3區(qū)AA的長度分布的關(guān)系，且課題組關(guān)于BALB/c小鼠的研究也顯示出AA取用和長度分布沒有隨時間變化發(fā)生顯著改變［30-31］。

（5）同卵、異卵和非雙胞胎TCRβCDR3受體庫Overlap前后5年分析發(fā)現(xiàn)，在TCRβ鏈假基因CDR3和TCRβ鏈功能性CDR3的全部氨基酸序列中，個體內(nèi)前后5年的Overlap大于同卵、異卵和非雙胞胎前后5年的Overlap，同卵、異卵和非雙胞胎前后5年的Overlap無統(tǒng)計學(xué)差異。無論是假基因CDR3序列還是功能性CDR3序列，重疊序列的形成均與核苷酸的剪切、插入及TdT 3個因素有關(guān)，雖然假基因CDR3受體庫中核苷酸剪切、插入的平均數(shù)目和遺傳因素有一定相關(guān)性，但本實驗的結(jié)果提示，在CDR3受體庫中，不同個體之間剪切和插入的堿基可能是隨機的，因此同卵、異卵和非雙胞胎之間Overlap序列的數(shù)目無顯著差異。經(jīng)回訪，雙胞胎A、B、c彼此之間5年期間生活環(huán)境在同一城市。理論上，兩個TCR受體庫相同的人接觸相同環(huán)境抗原，其TCR應(yīng)答也可能存在差異［25］。同卵、異卵和非雙胞胎前后5年的Overlap均提示Overlap與遺傳因素相關(guān)性不大，而個體外在的環(huán)境因素可能是影響特異CDR3克隆增殖的主要因素。

本實驗在ZVYAGIN等［15］和RUBELT等［16］探討同卵雙胞胎外周T細胞CDR3組庫同質(zhì)性的基礎(chǔ)上，采用HTS對3對雙胞胎前后5年外周血總T細胞TCRβ鏈CDR3受體庫進行對比分析，獲得了遺傳因素對V（D）J重排偏向性影響的部分基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，特別是首次在雙胞胎中進行了假基因家族CDR3受體庫的動態(tài)對比分析。目前只有少數(shù)研究者在利用雙胞胎的基因一致性探討遺傳因素對V（D）J重排的影響效應(yīng)。在人體內(nèi)，目前無法開展明確的機制研究（很難獲得雙胞胎的胸腺樣本），在外周血的T細胞受體庫研究中，存在個體經(jīng)歷的環(huán)境應(yīng)答對遺傳因素所造成影響的“稀釋”性，探討V（D）J重排和遺傳影響相關(guān)性并未獲得突破進展。通過本實驗的初步探討，為深入探討遺傳因素對TCR初始重排、耐受選擇及外周適應(yīng)性應(yīng)答的效應(yīng)和機制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和新的方法。