外周血TBNK淋巴細(xì)胞亞群和血清Th1/Th2細(xì)胞因子與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究

楊攀玉 曲 婷 曾 莉 孟慶甜 羅成松 解夢媛 鄭 渠（成都西囡婦科醫(yī)院，成都610000）

胎兒相對于母體是同種半異體移植物，正常妊娠需要母體免疫系統(tǒng)對父方來源的胎兒組織發(fā)生免疫識別和產(chǎn)生免疫反應(yīng)，建立起一個對胎兒局部免疫耐受環(huán)境，如果免疫微環(huán)境失調(diào)則會導(dǎo)致流產(chǎn)［1］。

美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會（ASRM）將復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）定義為與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，在育齡婦女中發(fā)生率為1%～5%，是當(dāng)前婦產(chǎn)科醫(yī)生及患者面臨的一個相當(dāng)棘手的問題［2］。目前已知的病因有遺傳因素（父母雙方染色體異常、流產(chǎn)物絨毛染色體檢查異常等）、解剖因素（子宮畸形、宮腔黏連、子宮內(nèi)膜息肉、子宮肌瘤等）、感染因素（衣原體感染、病毒感染等）、內(nèi)分泌因素（甲狀腺功能異常、多囊卵巢綜合征、胰島素分泌異常、高泌乳素血癥等）和自身免疫?。沽字贵w綜合征、未分化結(jié)締組織病、紅斑狼瘡等），除此之外仍有50%～60%的患者無法找到明確的病因，定義為原因不明的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［3-4］。多年來，由于檢測方法缺乏、治療手段有限，URSA保胎成功率非常低。近年來，隨著對URSA病因的深入探究，人們逐漸意識到80%左右的URSA可能與免疫功能異常相關(guān)［5］。目前，雖然RSA的機(jī)制已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，但大多是針對淋巴細(xì)胞亞群比率與流產(chǎn)的相關(guān)性研究，例如胡道琴等［6］研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者淋巴治療前后T淋巴細(xì)胞亞群比率的變化。毛立群等［7］研究RSA患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞比率的變化等，研究因素相對單一。而對于Th1/Th2細(xì)胞因子的流產(chǎn)機(jī)制，國內(nèi)大多用傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)進(jìn)行檢測，例如趙靜［8］通過采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測72例URSA患者和30例正常婦女的外周血Th1和Th2細(xì)胞因子水平來研究復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者Th1/Th2細(xì)胞因子的失衡機(jī)制。陳廣莉等［9］也是采用ELISA技術(shù)研究URSA患者血清Th1（TNF-α）和Th2（IL-6）水平變化等。而本研究通過運(yùn)用先進(jìn)的流式技術(shù)同時檢測URSA病例組和正常對照組的淋巴細(xì)胞亞群和人Th1/Th2細(xì)胞因子的含量，探討URSA患者相對于正常對照女性在淋巴細(xì)胞和免疫學(xué)細(xì)胞因子方面的差異。同時正常妊娠URSA患者作為自身對照，比較臨床治療，妊娠前后自身淋巴細(xì)胞亞群和Th1/Th2細(xì)胞因子的變化。隨訪URSA患者根據(jù)不同的妊娠結(jié)局對URSA患者進(jìn)行分組，對其外周血TBNK淋巴亞群和Th1/Th2細(xì)胞因子的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的數(shù)據(jù)分析，從而探討URSA患者的發(fā)病機(jī)制，為臨床診斷和防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 URSA病例組：選擇2018年5月至2019年5月成都西囡婦科醫(yī)院就診的60例URSA患者，同時具備以下條件：①既往連續(xù)發(fā)生2次或2次以上自然流產(chǎn)，年齡20～35歲，平均年齡（27.02±3.1）歲，流產(chǎn)史均為早期流產(chǎn)（孕20周以內(nèi)）；②夫妻雙方染色體正常；③男方精液常規(guī)檢查正常，且衣原體，支原體，淋球菌檢查陰性；④女方生殖道正常，無畸形；⑤女方陰道分泌物正常，無感染；⑥女方激素結(jié)果正常；⑦女方TORTCH結(jié)果正常；⑧女方未患有自身免疫病。排除遺傳、男方因素、女方生殖道畸形、內(nèi)分泌因素異常和感染、自身免疫病后的RSA患者稱為URSA。正常對照組：同時選擇2018年5月至2019年5月有健康分娩史的30例婦女作為正常對照組。同時滿足以下條件①既往無不良孕產(chǎn)史，有1胎以上足月正常分娩史；②年齡20～35歲；平均年齡（28.30±2.96）歲。以上2組婦女年齡、體重指數(shù)、流產(chǎn)次數(shù)進(jìn)行t檢驗(yàn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.1.2 試劑與儀器 BD FacscantoⅡ流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。CD3-FITC/CD16+CD56-PE/C D45-PerCP-Cy5.5/CD4-PC7/CD19-APC/CD8-APCCy7熒光單克隆抗體試劑盒（流式細(xì)胞儀法）和TSCell-Count絕對計(jì)數(shù)微球試劑盒均購自北京同生時代生物技術(shù)有限公司；人Th1/Th2亞群檢測試劑盒（流式熒光法）購自杭州賽基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 隨訪計(jì)劃及內(nèi)容 隨訪40例URSA患者中22例經(jīng)臨床治療和18例未經(jīng)臨床治療后的妊娠結(jié)局。隨訪結(jié)果顯示22例URSA患者經(jīng)臨床治療后，正常妊娠且妊娠結(jié)局均為正常分娩，18例未經(jīng)臨床治療再次妊娠后妊娠結(jié)局均為再次流產(chǎn)。流產(chǎn)組織送CMA（染色體芯片分析）檢查，結(jié)果顯示正常，排除染色體異常導(dǎo)致的流產(chǎn)。臨床醫(yī)生在再次妊娠前告知未經(jīng)治療的18例患者再次流產(chǎn)的風(fēng)險，患者知情同意。

1.2.2 臨床治療 淋巴亞群異?；颊呷鬋D19+高的采用羥氯喹（200～400 mg/d）治療，其他異常者均采用環(huán)孢素（25 mg po bid～25 mg po tid）治療，細(xì)胞因子異?；颊呷鬒FN-γ高采用他克莫司，其他細(xì)胞因子異常者采用環(huán)孢素（25 mg po bid～25 mg po tid）；若淋巴亞群和細(xì)胞因子2項(xiàng)結(jié)果均異常的患者根據(jù)具體情況采用環(huán)孢素加他克莫司或環(huán)孢素加腫瘤壞死因子拮抗劑連用治療，一般治療周期為1個月，治療后黃體期采血監(jiān)測治療效果，若指標(biāo)未恢復(fù)正常者再加1個周期，待黃體期采血結(jié)果恢復(fù)正常為止。

1.2.3 標(biāo)本采集和處理 ①淋巴細(xì)胞亞群及絕對值計(jì)數(shù)用EDTA抗凝全血，常溫下保存，24 h以內(nèi)檢測；②細(xì)胞因子用有分離膠的黃頭管分離血清，4℃冷藏保存，48 h以內(nèi)檢測；③URSA病例組和正常對照組淋巴亞群和細(xì)胞因子均為黃體期采血，隨訪22例正常妊娠URSA患者（妊娠結(jié)局正常分娩）治療后孕前黃體期，孕后4周、8周、12周、16周分別采集淋巴亞群和細(xì)胞因子標(biāo)本進(jìn)行檢測，18例再次流產(chǎn)患者，孕后（至流產(chǎn)前）與正常妊娠患者同一時間采集淋巴亞群和細(xì)胞因子進(jìn)行檢測。

1.2.4 淋巴細(xì)胞亞群檢測 ①標(biāo)本的準(zhǔn)備：取出冰箱試劑，恢復(fù)至室溫。將采集好的EDTA抗凝全血樣本編號，如1，以此類推，并掃入相應(yīng)的LIS系統(tǒng)，核對信息無誤后，準(zhǔn)備好對應(yīng)數(shù)量的淋巴絕對計(jì)數(shù)管，對應(yīng)標(biāo)號；②吸取50μl混勻的EDTA抗凝全血，加入絕對計(jì)數(shù)微球管底部，移液器前端避免接觸管底（避免帶出微球，影響淋巴亞群的絕對計(jì)數(shù)），同時避免血液碰到管壁上部；③在已加樣本的微球管底部加入20μl的熒光抗體試劑。注意將槍頭接觸靠近微球的管壁快速打入，避免帶出血液影響絕對值計(jì)數(shù)；④充分渦動混勻約10 s，室溫避光反應(yīng)20 min；⑤向管內(nèi)加入450μl溶血劑，室溫避光反應(yīng)10 min；⑥加入450μl磷酸緩沖液（PBS），上機(jī)檢測。按照標(biāo)本標(biāo)號依次放置于轉(zhuǎn)盤內(nèi)，在樣本后準(zhǔn)備兩個流式上樣管，分別加入2 ml HClO和3 ml蒸餾水，將裝有HClO的管子放在緊接樣本的位置。蒸餾水的管子放在最后一個位置。點(diǎn)擊開始，臨床軟件自動化操作；⑦結(jié)果處理：在CD45/SSC散點(diǎn)圖中圈出CD45高表達(dá)，SSC低表達(dá)的淋巴細(xì)胞群。然后再分別手動選擇CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD16+CD56+、CD19+細(xì)胞群，如圖1。

1.2.5 細(xì)胞因子檢測方法 采用流式CBA（多重蛋白定量檢測）技術(shù)。①標(biāo)本準(zhǔn)備：取出冰箱試劑，恢復(fù)至室溫，將檢測樣本編號，如1，以此類推，并掃入相應(yīng)的LIS（成都信通實(shí)驗(yàn)室信息）系統(tǒng)，核對信息無誤后，準(zhǔn)備好對應(yīng)數(shù)量的流式上樣管，對應(yīng)標(biāo)號；②計(jì)算樣本數(shù)量n（n=標(biāo)準(zhǔn)品管數(shù)10+檢測樣本數(shù)量）；③取試劑盒捕獲微球混合液（A），漩渦振蕩3～5 s，取n*25μl（可適當(dāng)多?。┯谠嚬苤胁?biāo)記，200 g離心5 min后用移液槍小心吸取上清棄掉，再取等量微球緩沖液（H）重懸微球。漩渦振蕩3～5 s后避光孵育30 min；④從試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品管（B），轉(zhuǎn)移至試管后加入2 ml樣本稀釋液后靜置15 min，并標(biāo)記為最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度（注意動作輕柔，請勿劇烈振蕩）；⑤取10只試管，分別標(biāo)記為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256和1∶512，每管分別加入300μl樣品稀釋液（G）；⑥從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品管中吸取300μl樣本至1∶2管，輕輕吹打混勻20次，再從1∶2管中取300μl樣品至1∶4管，吹打混勻，如此類推，直到1∶512管。⑦取n只上樣管，依次標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)品管：0（記為陰性對照）、1、2、……10，樣本管：test1、test2……test（n-11）其中標(biāo)準(zhǔn)品管濃度對應(yīng)關(guān)系見表1；⑧將孵育好的捕獲微球振蕩混勻后，向標(biāo)準(zhǔn)品管中加入25μl對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，樣本管中各加25μl待檢測樣本，向所有標(biāo)準(zhǔn)品管及樣品管中分別加入25μl熒光檢測試（C）；⑨所有上樣管振蕩混勻，室溫避光孵育2.5 h。孵育完成后，每管加入1 ml PBS溶液洗滌，200 g離心5 min，棄上清。每管加入100μl PBS溶液，振蕩重懸后上機(jī)。上機(jī)后軟件自動分析數(shù)據(jù)。

圖1 淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果處理圖Fig.1 Processing chart of lymphocyte subsets detection results

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本和配對樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 URSA病例組和正常對照組比較 URSA病例組外周血的Th細(xì)胞（CD4+及CD4+/CD8+），B細(xì)胞（CD19+）以及NK細(xì)胞（CD16+CD56+）比例和絕對值計(jì)數(shù)結(jié)果均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而CD8+和CD3+細(xì)胞百分率和絕對值計(jì)數(shù)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；URSA患者外周血Th1/Th2細(xì)胞因子中的TNF-α、IFN-γ和IL-6均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IL-10差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2、3。

2.2 比較正常妊娠組和再次流產(chǎn)組URSA患者的TBNK淋巴亞群和Th1/Th2細(xì)胞因子 根據(jù)URSA患者再次妊娠的妊娠結(jié)局進(jìn)行分組（正常妊娠組和再次流產(chǎn)組），再次流產(chǎn)URSA患者外周血的Th細(xì)胞，B細(xì)胞以及NK細(xì)胞比例和絕對值計(jì)數(shù)結(jié)果均高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而CD8+和CD3+細(xì)胞百分率和絕對值計(jì)數(shù)結(jié)果在不同妊娠結(jié)局患者中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；同時再次流產(chǎn)URSA患者外周血Th1/Th2細(xì)胞因子中的TNF-α、IFN-γ和IL-6均高于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IL-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4、5。

表1 細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品管濃度對應(yīng)關(guān)系表Tab.1 Correspondence table of cytokine standard quality control concentration

表2 URSA病例組和正常對照組淋巴亞群比例及絕對值計(jì)數(shù)水平比較（±s，n=60，%，cells/μl）Tab.2 Comparison of lymphocyte subsets ratio and level of absolute count between URSA group and normal control group（±s，n=60，%，cells/μl）

表2 URSA病例組和正常對照組淋巴亞群比例及絕對值計(jì)數(shù)水平比較（±s，n=60，%，cells/μl）Tab.2 Comparison of lymphocyte subsets ratio and level of absolute count between URSA group and normal control group（±s，n=60，%，cells/μl）

Groups CD3+CD3+CD3+CD4+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD8+CD4+/CD8+CD19+CD19+CD16+CD56+CD16+CD56+URSA case 70.05±6.20 1 025±92 55.92±5.28 1 120±35 29.02±3.29 485±72 1.85±0.29 25±2.30 382±56 28±4.60 359±76 Normal control P 68.92±5.90＞0.05 989±86＞0.05 32.89±4.26＜0.05 725±18＜0.05 28.96±3.00＞0.05 479±89＞0.05 1.10±0.30＜0.05 16±3.20＜0.05 253±49＜0.05 18±3.20＜0.05 159±39＜0.05

表3 URSA組和正常對照組外周血Th1/Th2細(xì)胞因子比較（±s，n=60，pg/ml）Tab.3 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood between URSA group and normal control group（±s，n=60，pg/ml）

表3 URSA組和正常對照組外周血Th1/Th2細(xì)胞因子比較（±s，n=60，pg/ml）Tab.3 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood between URSA group and normal control group（±s，n=60，pg/ml）

Groups URSA case IL-2 3.25±1.50 TNF-α 20.36±3.20 IFN-γ 18.26±2.50 IL-4 2.69±0.50 IL-6 25.26±1.60 IL-10 2.80±0.70 Normal control 3.19±1.10 1.90±0.20 5.20±1.50 3.20±0.60 3.52±1.30 3.69±0.80 P ＞0.05＜0.05＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05

2.3 正常妊娠URSA患者治療前后變化 結(jié)果顯示治療后與正常妊娠后患者外周血Th細(xì)胞，B細(xì)胞以及NK細(xì)胞比例和絕對值計(jì)數(shù)結(jié)果均比未治療妊娠前有所明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CD8+和CD3+細(xì)胞百分率和絕對值計(jì)數(shù)結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。同時，治療后與妊娠后外周血Th1/Th2細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6均比未治療妊娠前有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而細(xì)胞因子IL-2、IL-4和IL-10水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表6、7。

表4 不同結(jié)局妊娠結(jié)局URSA患者間外周血淋巴亞群比例及絕對值計(jì)數(shù)水平比較（±s，%，cells/μl）Tab.4 Comparison of rat and absolute value of peripheral blood lymph subsets among URSA patients with different pregnancy outcome（±s，%，cells/μl）

表4 不同結(jié)局妊娠結(jié)局URSA患者間外周血淋巴亞群比例及絕對值計(jì)數(shù)水平比較（±s，%，cells/μl）Tab.4 Comparison of rat and absolute value of peripheral blood lymph subsets among URSA patients with different pregnancy outcome（±s，%，cells/μl）

Note：Resultsof blood samplingin same gestational week between recurrent abortion group and thenormal pregnancy group.

CD16+CD56+372±58 132±41＜0.05 Groups CD3+CD3+CD3+CD4+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD8+CD4+/CD8+CD19+CD19+Abortion（n=18）Normal pregnancy（n=22）P 67.05±4.90 68.92±5.90＞0.05 972±86 999±86＞0.05 62.92±5.08 38.89±3.99＜0.05 1 256±39 785±20＜0.05 26.02±3.20 27.96±3.21＞0.05 475±62 462±79＞0.05 1.98±0.31 1.08±0.29＜0.05 28±1.90 16±3.00＜0.05 395±42 242±39＜0.05 CD16+CD56+35±4.00 17±3.50＜0.05

表5 不同結(jié)局妊娠結(jié)局URSA間外周血Th1/Th2細(xì)胞因子比較（±s，pg/ml）Tab.5 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood of URSA with different pregnancy outcome（±s，pg/ml）

表5 不同結(jié)局妊娠結(jié)局URSA間外周血Th1/Th2細(xì)胞因子比較（±s，pg/ml）Tab.5 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood of URSA with different pregnancy outcome（±s，pg/ml）

Note：Results of blood sampling in the same gestational week between the abortion group and the normal pregnancy group.

IL-10 2.68±0.80 3.48±0.80＞0.05 Groups Abortion（n=18）Normal pregnancy（n=22）P IL-2 3.85±1.00 3.00±1.50＞0.05 TNF-α 29.56±2.50 0.90±0.30＜0.05 IFN-γ 25.26±3.20 3.20±1.00＜0.05 IL-4 3.02±0.60 3.32±0.60＞0.05 IL-6 25.32±2.00 3.02±1.00＜0.05

表6 正常妊娠URSA患者治療前后和妊娠后外周血淋巴亞群比例及絕對值計(jì)數(shù)水平比較（±s，%，n=22，cells/μl）Tab.6 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets and level of absolute count before and after treatment in URSA patients with normal pregnancy（±s，%，n=22，cells/μl）

表6 正常妊娠URSA患者治療前后和妊娠后外周血淋巴亞群比例及絕對值計(jì)數(shù)水平比較（±s，%，n=22，cells/μl）Tab.6 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets and level of absolute count before and after treatment in URSA patients with normal pregnancy（±s，%，n=22，cells/μl）

Note：P1 valueswasbeforetreatment compared with after treatment.Valueof P2 wasbeforetreatment compared with after normal pregnancy.

CD16+CD56+369±59 140±45 132±41＜0.05＜0.05 Groups CD3+CD3+CD3+CD4+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4+/CD8+CD19+CD19+Before treatment After treatment After pregnancy P1 P2 69.05±5.20 68.85±4.90 68.92±5.90＞0.05＞0.05 989±90 992±78 999±86＞0.05＞0.05 58.92±5.08 36.54±4.02 38.89±3.99＜0.05＜0.05 1 100±40 779±18 785±20＜0.05＜0.05 28.02±3.59 28.96±3.02 27.96±3.21＞0.05＞0.05 CD3+CD8+470±62 465±69 462±79＞0.05＞0.05 1.92±0.31 1.10±0.25 1.08±0.29＜0.05＜0.05 25±2.10 14±3.50 16±3.00＜0.05＜0.05 384±50 239±40 242±39＜0.05＜0.05 CD16+CD56+29±4.00 15±3.60 17±3.50＜0.05＜0.05

表7 正常妊娠URSA患者治療前后和妊娠后外周血Th1/Th2細(xì)胞因子比較（±s，n=22，pg/ml）Tab.7 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood of URSA patients with normal pregnancy before and after treatment（±s，n=22，pg/ml）

表7 正常妊娠URSA患者治療前后和妊娠后外周血Th1/Th2細(xì)胞因子比較（±s，n=22，pg/ml）Tab.7 Comparison of Th1/Th2 cytokines in peripheral blood of URSA patients with normal pregnancy before and after treatment（±s，n=22，pg/ml）

Note：P1 wasbeforetreatment compared and after treatment；P2 valuewascomparison between beforetreatment and after normal pregnancy.

IL-10 2.78±0.70 2.89±0.90 3.32±0.80＞0.05＞0.05 Groups Before treatment After treatment After pregnancy P1 P2 IL-2 3.15±1.60 3.05±1.50 3.00±1.50＞0.05＞0.05 TNF-α 22.56±2.50 1.00±0.20 0.90±0.30＜0.05＜0.05 IFN-γ 19.26±2.30 2.95±0.94 3.20±1.00＜0.05＜0.05 IL-4 2.68±0.50 2.80±0.60 3.31±0.60＞0.05＞0.05 IL-6 23.82±1.30 4.02±0.96 3.02±1.00＜0.05＜0.05

3 討論

妊娠的免疫機(jī)制：妊娠是一個復(fù)雜的生理過程，生殖免疫學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，妊娠是一種同種半異體移植的現(xiàn)象，正常妊娠取決于母胎免疫系統(tǒng)間精確的動態(tài)平衡。但如果母胎雙方免疫平衡被打破，則會引起母體對胎兒的排斥而發(fā)生流產(chǎn)［10］。目前，國內(nèi)外研究表明，URSA主要與免疫因素有關(guān)，母胎界面的免疫耐受維持正常胚胎不被母體排斥，一旦打破這種平衡狀態(tài)，將會導(dǎo)致URSA的發(fā)生［11-12］。

淋巴亞群與URSA的相關(guān)討論：成熟的T淋巴細(xì)胞表面均可表達(dá)CD3+分子，并可分為CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞兩個亞群，其中CD4+T細(xì)胞屬于輔助性/誘導(dǎo)性T淋巴細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，其比率和絕對值增加可使母體細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，對胚胎的免疫排斥反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致妊娠不能繼續(xù)。CD8+T細(xì)胞屬于殺傷性/抑制性T淋巴細(xì)胞，它既可抑制由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫，也可抑制CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)及增殖反應(yīng)等，從而保證胚胎半同種抗原不被排斥［13］。本研究顯示URSA病例組CD4+T、CD4+T/CD8+T均較健康分娩正常對照組高（P＜0.05），在URSA患者治療后與正常妊娠后CD4+T、CD4+T/CD8+T均比未治療前有所明顯下降（P＜0.05），在URSA患者不同妊娠結(jié)局比對中，再次流產(chǎn)組CD4+T、CD4+T/CD8+T均高于正常妊娠組（P＜0.05），以上結(jié)果都體現(xiàn)了CD4+T、CD4+T/CD8+T隨不同妊娠結(jié)局的變化規(guī)律，進(jìn)一步證實(shí)了CD4+T、CD4+T/CD8+T的異常增高與流產(chǎn)相關(guān)，對妊娠不利。

外周血NK細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞膜表面標(biāo)記可分為CD16+CD56+，CD16-CD56+。CD16+CD56+細(xì)胞含有溶細(xì)胞顆粒，對胚胎起免疫殺傷和排斥作用，CD16-CD56+不含有溶細(xì)胞顆粒，能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，對胚胎起免疫保護(hù)和營養(yǎng)作用［14］。KIM等［15］研究發(fā)現(xiàn)，URSA患者與正常婦女中外周血NK細(xì)胞在妊娠前后并無明顯改變，具體分析NK細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)URSA患者外周血CD56+CD16+NK細(xì)胞明顯升高［16］。有研究表明URSA患者無論是外周血，黃體期內(nèi)膜還是子宮蛻膜組織中CD56+CDl6+均增高［17］。本實(shí)驗(yàn)采用CD3-CD16+CD56+標(biāo)記NK細(xì)胞，研究結(jié)果顯示URSA病例組外周血CD56+CD16+NK細(xì)胞較健康分娩正常對照組高（P＜0.05），在URSA患者治療后與正常妊娠后CD56+CD16+NK細(xì)胞比未治療前有明顯下降（P＜0.05），在URSA患者不同妊娠結(jié)局比對中，再次流產(chǎn)組CD56+CD16+NK細(xì)胞明顯高于正常妊娠組（P＜0.05），說明了CD56+CD16+NK細(xì)胞異常增高對胚胎產(chǎn)生殺傷作用從而導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，結(jié)論與上述研究結(jié)果一致。

CD19+淋巴細(xì)胞又稱為成熟B淋巴細(xì)胞，表示人體體液免疫功能的狀態(tài)。相關(guān)的研究資料結(jié)果顯示URSA患者其外周血液中的CD19+表達(dá)量會相對更高，但是目前在該方面意見還未達(dá)成一致［18］。梁逸仙等［19］結(jié)果發(fā)現(xiàn)有URSA病史或者難免會出現(xiàn)流產(chǎn)的孕婦其血樣中的CD19+表達(dá)量相較于正常妊娠或者正常女性的表達(dá)量明顯較高（P＜0.05）。本研究結(jié)果顯示URSA病例組CD19+較健康分娩正常對照組高（P＜0.05），URSA患者治療后和正常妊娠后CD19+比未治療前明顯下降（P＜0.05）。URSA患者不同妊娠結(jié)局比對中，再次流產(chǎn)組CD19+明顯高于正常妊娠組（P＜0.05），說明患者體內(nèi)CD19+異常升高導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，說明可能過多的B細(xì)胞產(chǎn)生過多的自身抗體導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)紊亂，自身抗體攻擊胚胎，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。

人Th1/Th2細(xì)胞因子與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性：現(xiàn)代生殖免疫學(xué)認(rèn)為，妊娠是一種成功的半同種移植現(xiàn)象，而妊娠是否成功有賴于母胎間的相互作用，既要避免胎兒被母體排斥，又要防止過度入侵，這在很大程度上取決于Th1/Th2細(xì)胞因子的動態(tài)平衡［20］。CD4+T細(xì)胞又稱為輔助性T細(xì)胞，是人體內(nèi)T細(xì)胞的一個亞群，在妊娠免疫中發(fā)揮重要的作用，CD4+T細(xì)胞可根據(jù)其分泌細(xì)胞因子的功能不同，可分為Th1和Th2兩亞群，其中Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，Th1型細(xì)胞因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，從而產(chǎn)生胚胎排斥作用。Th2細(xì)胞主要分IL-4、IL-6和IL-10，主要介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，促進(jìn)嗜酸細(xì)胞和肥大細(xì)胞分化，抑制免疫炎癥，減少過度損傷，具有免疫營養(yǎng)作用，從而形成免疫耐受保護(hù)，使胚胎不受母體免疫系統(tǒng)的排斥［21-22］。在正常條件下，Th1/Th2的比例維持在一定范圍，任何一方的增多或減少都可能使原有的比例發(fā)生偏移。研究發(fā)現(xiàn)，母體在妊娠期間細(xì)胞免疫功能受抑制，體液免疫功能增強(qiáng)，Th1/Th2細(xì)胞比值向Th2細(xì)胞方向偏移，Th2細(xì)胞優(yōu)勢環(huán)境對妊娠有利，而Th1細(xì)胞因子對妊娠有害，可導(dǎo)致不良妊娠［23］。

據(jù)研究報道，外周血Th1細(xì)胞因子INF-α、IFN-γ和IL-2等的作用是造成妊娠丟失的主要原因之一［24］。沈茜等［25］研究發(fā)現(xiàn)URSA組外周血IL-4、IL-6和IL-10較正常妊娠組低，證明Th2型細(xì)胞因子是正常妊娠時必需的。本文通過應(yīng)用先進(jìn)的流式CBA技術(shù)探討Th1/Th2細(xì)胞因子與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)性結(jié)果可得，URSA組INF-α、IFN-γ和IL-6較健康分娩正常對照組高（P＜0.05），在URSA患者治療后和正常妊娠后INF-α、IFN-γ和IL-6比未治療前有明顯下降（P＜0.05），在URSA患者不同妊娠結(jié)局比對中，再次流產(chǎn)組INF-α、IFN-γ和IL-6明顯高于正常妊娠組（P＜0.05），而IL-2、IL-4和IL-10在3個組間均無顯著性差異（P＞0.05）。本研究結(jié)果中INF-α和IFN-γ是Th1型細(xì)胞因子，與報道結(jié)果一致，但I(xiàn)L-2、IL-4、IL-6和IL-10與報道結(jié)果不一致。首先，IL-2在3組間比較無顯著性差異，本研究組認(rèn)為IL-2高的患者較為少見，由于本文研究納入樣本數(shù)量有限，造成差異存在。Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-10在3組間比對無顯著性差異，這一點(diǎn)，本課題組認(rèn)為外周血細(xì)胞因子的參考值本來就很低，而實(shí)驗(yàn)所用的試劑檢測線范圍為2.5～5 000 pg/ml，所以低于2.5 pg/ml是無法檢測出具體數(shù)值的，因此即使URSA病例組患者IL-4和IL-10的值低于正常對照組或者再次流產(chǎn)組URSA患者IL-4和IL-10值低于正常妊娠組URSA患者，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的方法學(xué)檢測范圍局限也無法得出顯著性差異。IL-6作為Th2細(xì)胞因子，URSA病例組患者明顯高于正常對照組與上述研究結(jié)果不符，也與國內(nèi)大多數(shù)研究報道的結(jié)果不一致。國內(nèi)大多數(shù)報道Th1/Th2細(xì)胞因子與RSA相關(guān)性研究時采用ELISA，如邵劍春等［26］通過ELISA技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)外周血中IL-6水平復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者亦明顯低于正常妊娠婦女。如趙愛民等［27］通過采用ELISA技術(shù)檢測自然流產(chǎn)小鼠模型外周血Th1/Th2型細(xì)胞因子探討Th1/Th2細(xì)胞因子與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性等，均與本研究采用的方法不一樣。近年來，流式細(xì)胞分析術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床。流式微球分析技術(shù)所需樣本量少，并大大縮短操作時間，同時其特異性強(qiáng)，靈敏度高，如果將多種熒光強(qiáng)度具有明顯差異的微球，分別耦聯(lián)不同特異性的抗體，各種微球按比例混合，可對樣本中多種可溶性細(xì)胞因子或蛋白質(zhì)同時進(jìn)行多參數(shù)聯(lián)合檢測［28］。令狐穎等［29］通過對自建IL-6、TNF-α和MCP-1的流式微球聯(lián)合檢測方法進(jìn)行評價，證實(shí)CBA技術(shù)具有高通量、高敏感、重復(fù)性好、線性范圍寬、準(zhǔn)確度高、抗干擾性好等優(yōu)點(diǎn)，對拓展流式細(xì)胞分析技術(shù)、延伸流式細(xì)胞儀應(yīng)用領(lǐng)域，有著積極的作用。李如林等［30］通過ELISA、流式微球載體技術(shù)檢測梅毒抗體的比較得出流式微球載體技術(shù)的靈敏度（100%）優(yōu)于ELISA（96%）。ELISA法導(dǎo)致假陰性的原因與檢測方法的靈敏度有關(guān)。盡管流式微球載體技術(shù)依賴流式細(xì)胞儀，但該技術(shù)在試驗(yàn)和臨床研究上具有潛在價值［31-32］。其次，IL-6是Th2型的細(xì)胞因子，能刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，刺激CTL分化，增強(qiáng)GM-CSF活性，促進(jìn)黏附分子生成，在滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、入侵和分化及胎盤血管的形成中起重要作用，可下調(diào)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，抑制母體排斥反應(yīng)，有利于維持妊娠［33］。另一方面，IL-6在自然狀態(tài)下具有抗炎的作用，有利于妊娠，陳廣莉等［34］研究結(jié)果顯示IL-6在URSA患者中顯著高于對照組，認(rèn)為IL-6水平的升高可能導(dǎo)致免疫耐受和抗炎作用的失衡，同樣可以導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)的發(fā)生。與本研究結(jié)果一致。IL-6既然能刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，那么顯著增高的IL-6可能會使機(jī)體產(chǎn)生過多的自身抗體導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)紊亂，過多的自身抗體攻擊胚胎，會導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，這說明IL-6在RSA患者體內(nèi)的免疫作用并不是單方面的，可能同時具有多方面作用，各種作用結(jié)果的一致性和拮抗性不同可能導(dǎo)致不同的妊娠結(jié)局。這可能是本文的研究與大多數(shù)文獻(xiàn)研究IL-6的結(jié)論不一致的原因。介于本研究的實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)目相對較少，所以具體的免疫機(jī)制還有待做更進(jìn)一步的深入研究。

本研究相比國內(nèi)大部分文獻(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)在于：①本研究不僅把URSA病例患者與健康分娩史的正常對照組做比較，同時還隨訪其中40例URSA患者中，將其中正常妊娠的URSA患者妊娠前后對比，以及再次流產(chǎn)URSA患者與正常妊娠URSA患者結(jié)果比較，闡述了同一患者在妊娠階段和流產(chǎn)階段外周血TBNK淋巴亞群與Th1/Th2細(xì)胞因子的變化。進(jìn)一步證實(shí)了體內(nèi)淋巴亞群（CD4+、CD19+和CD16+CD56+）和細(xì)胞因子（INF-α、IFN-γ和IL-6）的異常增高將導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生，不利于妊娠；②本研究淋巴細(xì)胞亞群與URSA患者關(guān)系的優(yōu)點(diǎn)在于同時檢測了淋巴細(xì)胞亞群的比例和絕對值計(jì)數(shù)，且兩者結(jié)果相符合；③相比較大多數(shù)文獻(xiàn)本文不僅研究淋巴細(xì)胞亞群或Th1/Th2細(xì)胞因子與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性，并且研究兩者與URSA的關(guān)系，為臨床的診斷治療提供了可靠的依據(jù)；④本研究與國內(nèi)大部分文獻(xiàn)研究Th1/Th2細(xì)胞因子所用的方法不同，大部分文獻(xiàn)均采用傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)，而本研究運(yùn)用了先進(jìn)的流式CBA技術(shù)定量檢測外周血Th1/Th2細(xì)胞因子。希望還能有更多的學(xué)者來針對這2個因素在RSA患者體內(nèi)具體的免疫作用做更加深入的研究，尤其是IL-6在URSA患者體內(nèi)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制，為臨床提供更加準(zhǔn)確可靠的診斷依據(jù)。