黃芪注射液聯(lián)合阿托伐他汀對急性肺損傷大鼠肺纖維化及細胞黏附功能的影響

周 易, 李火平, 夏光明, 周 帆, 金朝霞, 張 慧

(湖北省黃岡市中心醫(yī)院/長江大學附屬黃岡醫(yī)院，湖北 黃岡 438000)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI )是指由嚴重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性致病因素導致的急性進行性呼吸衰竭，臨床表現(xiàn)為呼吸頻數(shù)和呼吸窘迫。ALI早期即可出現(xiàn)纖維化改變，臨床治療藥物及其效果有限。黃芪味甘性溫，歸肺、脾經(jīng)，是一種重要的補氣藥，對急性肺損傷肺纖維化有明顯的抑制作用[1]。同時有研究表明，阿托伐他汀能通過多種途徑發(fā)揮對急性肺損傷的的保護作用[2]。但兩者合用對急性肺損傷肺纖維化的治療鮮有報道。本課題擬以病理學觀察為依據(jù)，驗證黃芪聯(lián)合阿托伐他汀對肺纖維化的保護作用，同時闡述其對細胞黏附功能可能的影響機制，為臨床治療肺損傷肺纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料:Wistar大鼠60只，雌雄不限，體重200～240g，由武漢大學實驗動物中心提供。黃芪注射液購自成都地奧制藥有限公司、阿托伐他汀鈣片購自輝瑞公司、博來霉素購自日本化藥株式會社。HyP試劑盒購自合肥萊爾。TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及PECAM-1多克隆抗體免疫組化試劑盒由武漢博士德生物提供。其他儀器設備均由長江大學附屬黃岡市中心醫(yī)院醫(yī)學實驗中心和病理科提供。本課題通過了院倫理委員會審查。

1.2動物模型制備與分組給藥:模型制備：大鼠48只隨機分為四組，每組12只，用氯胺酮麻醉后，博萊霉素注入大鼠肺內，制備急性肺損傷肺纖維化模型(經(jīng)預實驗證實模型制備成功)，另外12只大鼠用同樣方法注入同體積生理鹽水，制備假手術模型。分組給藥：黃芪組和聯(lián)合組每天腹腔注射給予1.0mL·kg-1·d-1的黃芪注射液，他汀組和聯(lián)合組給予阿托伐他汀20mg·kg-1·d-1灌胃；同時對照組、模型組和他汀組給予腹腔注射等量生理鹽水；對照組、模型組和黃芪組給予等量生理鹽水灌胃。各組于第14天給藥6h后處死大鼠，并迅速取出肺組織待測。

1.3觀察指標

1.3.1肺組織病理學檢查及評分:將標本常規(guī)處理后，HE染色光鏡下觀察組織病理學改變及肺泡炎程度，Masson染色觀察肺纖維化程度。參照文獻[3]方法確定肺泡炎和肺纖維化的病變程度并進行評分。同時進行免疫組織化學染色，觀察黏附分子陽性表達情況(以光鏡下觀察到的棕黃色顆粒為黏附分子陽性表達)。

1.3.2各組HyP、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達水平測定:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，ELISA法測定HyP、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1水平，按照試劑盒說明書的步驟進行操作。

2 結 果

2.1各組肺組織病理學檢查情況:對照組：肺組織結構清晰，無纖維化病理改變，少許棕黃色表達。模型組：正常肺泡結構破壞，肺泡間隔增厚，見膠原纖維增生及炎癥細胞浸潤，形成廣泛性纖維化，棕黃色顆粒顯著增多。黃芪組或他汀組：與同期模型組相比，肺間質部分有小灶狀，纖維化程度有所減輕，病變范圍較同期的模型組明顯縮小，棕黃色顆粒表達有所減輕。聯(lián)合組：病變范圍及纖維化減輕更為明顯，棕黃色顆粒陽性表達減少明顯。見圖1、圖2及圖3。

圖1 各組肺泡炎染色圖片(HE×200)

圖2 各組肺纖化染色圖片(Masson×200)

圖3 各組肺組織黏附分子表達(免疫組化×200)

2.2各組肺泡炎和肺纖維化分級評分情況:與對照組比較，肺損傷后各組肺泡炎和肺纖維化分級評分顯著升高(P<0.05)，給予黃芪或阿托伐他汀處理后評分均降低(P<0.05)，且聯(lián)合組降低更明顯(P<0.05)，見表1、圖1及圖2。

表1 各組病理學評分及HyP TNF-α ICAM-1 VCAM-1表達比較

2.3各組肺組織HyP、TNF-α和ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1表達測定:肺損傷肺纖維化后各組HyP、TNF-α和ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1表達明顯升高(P<0.05)，但黃芪或阿托伐他汀處理后顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合用藥后效果更為明顯(P<0.05)，見表1。

3 討 論

肺纖維化是許多肺部疾病的結局，是一種高度致命的疾病，可由各種已知的損傷，如感染、過敏原、毒素或輻射等引發(fā)。研究表明ALI早期即可出現(xiàn)纖維化改變，然而導致肺纖維化的細胞機制尚不清楚，但通常認為是肺泡上皮持續(xù)的損傷導致失調修復[4]。從肺組織病理學改變及肺泡炎和肺纖維化分級評分可知，模型組、他汀組、黃芪組及聯(lián)合組肺泡炎和肺纖維化明顯(P<0.05)，但用藥后14d，各治療組肺泡炎及纖維化程度明顯較輕(P<0.05)，其中聯(lián)合組最為顯著(P<0.05)，說明黃芪注射液聯(lián)合阿托伐他汀對肺泡炎及肺纖維化具有明顯的保護作用，且優(yōu)于單獨使用。

肺纖維化是正常的肺組織被異常積累的成纖維細胞和膠原所取代。HyP在膠原中的比例相對恒定(約占13%)，是膠原蛋白的主要成分之一，在其它蛋白中較少或不存在，因此測定羥脯氨酸水平可反映膠原水平，也可間接反應肺纖維化的程度。TNF-α主要是由T細胞和單核巨噬細胞產(chǎn)生和釋放，其在炎癥中的作用機制主要是對細胞炎癥反應的誘導(是一種強有力的誘導劑)、增強氧化應激、促進炎性介質的表達和釋放以及對肺泡活性物質功能的損害等。TNF-α能激活促纖維化細胞因子，促進成纖維細胞增殖、趨化，缺乏TNF受體的小鼠能夠抵抗各種因素引起的肺纖維化[5]。從表1可知，HyP和TNF-α在肺損傷肺纖維化模型中表達明顯，他汀組、黃芪組及聯(lián)合組HyP和TNF-α表達水平均明顯下降，特別是聯(lián)合組下降更為明顯(P<0.05)，說明黃芪聯(lián)合阿托伐他汀對肺纖維化組織HyP和TNF-α具有明顯的調節(jié)作用。

黏附分子是指存在于細胞表面，介導細胞與細胞間或細胞與基質間相互接觸與結合的一類膜表面糖蛋白，與白細胞穿過內皮細胞密切相關，主要包括ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1等。目前認為白細胞與內皮細胞緊密黏附是通過CD11/CD18-ICAM-1和VLA-4-VCAM-1兩條通路實現(xiàn)。中性粒細胞與血管內皮細胞緊密黏附以前者為主。在炎癥介質作用下，中性粒細胞上調表達CD11/CD18，內皮細胞上ICAM-1表達增強，從而使中性粒細胞通過CD11/CD18-ICAM-1通路不可逆的黏附到內皮下。在組織中趨化因子作用下，穿內皮細胞間隙到達炎癥區(qū)域，沿趨化因子梯度移行至細胞外基質，最終白細胞經(jīng)基底膜與假復層柱狀上皮進人氣道腔內。其中在內皮細胞連接處表達的PECAM-1介導這一過程。一旦中性粒細胞與肺泡內皮、上皮或者與間質中的細胞外基質蛋白接觸，細胞內的毒性物質如各種蛋白酶、氧自由基和細胞因子外誘捕網(wǎng)等物質會被釋放出來，損傷肺泡上皮細胞和毛細血管內皮，最終導致ALI。同時單核細胞黏附與移行通過上述兩條通路均可進行，VLA-4-VCAM-1可作為CD11/CD18-ICAM-1的替代途徑。單核吞噬細胞聚集，其細胞毒作用增強，加重肺損傷[6]。隨后肺損傷修復，間質膠原增生，最終導致肺纖維化。同時氧化應激或氧化信號也可能加重肺纖維化[7]。本研究可以看出，急性肺損傷肺纖維化各組ICAM-1、VCAM-1及PECAM-1明顯增強(P<0.05)，細胞黏附功能活躍，而使用阿托伐他汀和黃芪干預后其表達水平明顯下降，特別是聯(lián)合組下降更為明顯(P<0.05)，說明黃芪聯(lián)合阿托伐他汀對肺纖維化組織細胞黏附功能具有明顯的調節(jié)作用。

阿托伐他汀為常用的抗血脂藥物，其抗肺損傷肺纖維化的機制主要有：①通過抗脂質氧化保護作用來抑制炎性介質釋放，降低氧化應激，減輕肺組織炎性反應[8]；②改善內皮功能，抑制血管平滑肌的增殖和遷移，促進炎癥吸收[9]；③抑制黏附分子表達，減少單核-巨噬細胞的黏附和分泌功能，減輕動脈壁巨噬細胞和泡沫細胞的形成等[10]。同時研究證實黃芪具有明顯的抗缺氧、抗炎、鎮(zhèn)痛和調節(jié)免疫的功能，并能通過調節(jié)細胞黏附分子表達、改善血管內皮等作用改善肺纖維化[1]。本研究表明黃芪聯(lián)合阿托伐他汀鈣能協(xié)同減輕肺損傷肺纖維化進程，其機制可能與其能降低HyP和TNF-α含量以及調節(jié)細胞黏附功能，減少白細胞的黏附以及與內皮細胞之間的相互作用，阻斷白細胞穿過血管內皮游出到達炎癥部位，減輕其隨后釋放的一系列細胞物質對肺泡及血管的損傷，從而抑制炎癥反應達到抑制纖維化的效應有關。