5-氮雜-2'-脫氧胞苷對(duì)食管癌放射敏感性的影響及作用機(jī)制

張翠紅，呂 欣，范 才，侯春立，馬博敬，張建軍

放射治療是食管癌一種重要、有效的治療手段，約80%的患者需接受放射治療[1-2]。然而腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線抗拒是抗腫瘤治療失敗的主要原因之一[3]，所以如何提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性，在提高腫瘤局部控制率的同時(shí)降低放射線對(duì)正常組織的毒性作用是食管癌放射治療的重要研究課題。5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-CdR)屬于核苷類似物甲基化抑制劑，不僅可以抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，降低細(xì)胞分裂時(shí)DNA甲基化水平，還可以干擾RNA代謝、DNA和蛋白質(zhì)合成[4-6]。研究表明，5-aza-CdR可通過(guò)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而抑制該酶甲基轉(zhuǎn)移活性，逆轉(zhuǎn)CpG島異常甲基化、恢復(fù)腫瘤抑制因子表達(dá)，起到抑制腫瘤作用[7]。最近研究發(fā)現(xiàn)，5-aza-CdR可能與腫瘤的放射敏感性有密切關(guān)系[8]。但目前有關(guān)5-aza-CdR在食管癌放射敏感性方面的研究甚少。故本研究以5-aza-CdR作用于人食管癌細(xì)胞株EC9706，研究其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料和主要試劑

1.1.1食管癌細(xì)胞株：人食管癌EC9706細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞資源庫(kù)，用含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取第二、三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2藥物及主要試劑、儀器：5-aza-CdR購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK8試劑購(gòu)自武漢默沙克生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；一抗cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-ATM/ATM、β-actin及二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；細(xì)胞裂解及蛋白抽提試劑、蛋白濃度檢測(cè)試劑考馬斯亮藍(lán)、Western blot配膠試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯膜、ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞分組及照射方法：將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為4組：①對(duì)照組(Control組)：不做任何處理；②5-aza-CdR處理組：予不同濃度(0、0.50、1.00、1.50及3.00 μmol/L)5-aza-CdR處理細(xì)胞；③單純照射組(RT組)：僅予射線照射；④照射+5-aza-CdR處理組(RT+5-aza-CdR組)：予5-aza-CdR處理細(xì)胞48 h后行射線照射。5-aza-CdR用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶解，對(duì)照組用等量PBS液處理。培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁后，室溫下采用6 MV-X射線照射。

1.2.2CCK-8法測(cè)定5-aza-CdR對(duì)EC9706細(xì)胞毒性及照射后增殖抑制的影響：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期EC9706細(xì)胞，胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2.0×103/孔)，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度5-aza-CdR，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μl新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基，然后各孔加入CCK-8溶液10 μl，放入37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=[1-(吸光度實(shí)驗(yàn)/吸光度對(duì)照)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用相同方法檢測(cè)5-aza-CdR對(duì)EC9706細(xì)胞放射敏感性，將接種細(xì)胞分為Control組、RT組(射線照射劑量2、4、6、8及10 Gy)和RT+5-aza-CdR組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，RT+5-aza-CdR組細(xì)胞加入1.00 μmol/L 5-aza-CdR；2 h后，RT組和RT+5-aza-CdR組細(xì)胞分別接受不同劑量射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照CCK-8法檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率和放射增敏比(SER)。SER=RT組D0/RT+5-aza-CdR組D0，D0為細(xì)胞增殖活性下降50%時(shí)的放射劑量，即半數(shù)致死劑量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)：收集RT組和RT+5-aza-CdR組細(xì)胞，加入PMSF細(xì)胞裂解液，提取蛋白?？捡R斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度，加熱使蛋白變性，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，血清密閉，分別加入cleaved caspase-3(1︰1000稀釋)、Bax抗體(1︰1000稀釋)、Bcl-2抗體(1︰500稀釋)、ATM/p-ATM抗體(1︰1000稀釋)、β-actin抗體(1︰20 000稀釋)，置于4℃搖床過(guò)夜。次日TBST反復(fù)沖洗，加入二抗(1︰5000稀釋)。ECL試劑顯影，拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：細(xì)胞以每皿3×105個(gè)的密度接種于25 cm2培養(yǎng)皿中，貼壁后分為RT組和RT+5-aza-CdR組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，細(xì)胞周期檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5-aza-CdR對(duì)EC9706細(xì)胞照射后的侵襲能力：用DMEM培養(yǎng)液將Matrigel按1︰6稀釋，取80 μl稀釋液加入到Transwell小室上室，37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜。收集RT組和RT+5-aza-CdR組細(xì)胞，胰蛋白酶消化制備成1×105/ml細(xì)胞懸液，接種于已鋪基質(zhì)膠的Transwell小室上室,鋪勻，下室加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液600 μl，在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel膠，PBS液沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS液沖洗晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.15-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞的毒性作用 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度(0、0.50、1.00、1.50及3.00 μmol/L)5-aza-CdR處理后，細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制，分別為(0.68±0.07)%、(0.80±0.10)%、(1.13±0.32)%、(13.33±4.16)%及(38.33±7.64)%。0、0.50及1.00 μmol/L 5-aza-CdR對(duì)EC9706細(xì)胞增殖抑制作用基本一致，經(jīng)單因素方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；1.00、1.50及3.00 μmol/L 5-aza-CdR對(duì)EC9706細(xì)胞增殖抑制率經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且進(jìn)一步兩兩比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。可見(jiàn)1.00 μmol/L是5-aza-CdR無(wú)毒的最高劑量，故為排除5-aza-CdR本身對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響，本研究選擇1.00 μmol/L為實(shí)驗(yàn)濃度行放射敏感性研究。

圖1 不同濃度5-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞的毒性作用

2.25-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后增殖活性的影響 CCK-8法檢測(cè)顯示，不同放射劑量(2、4、6、8及10 Gy)照射后，細(xì)胞增殖活性受抑制，D0為6.897 Gy。而不同照射組細(xì)胞予5-aza-CdR預(yù)處理后，各組細(xì)胞增殖抑制率經(jīng)析因設(shè)計(jì)的雙因素方差分析，處理因素5-aza-CdR的主效應(yīng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，處理因素放射線的主效應(yīng)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，二者交互作用比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。故無(wú)論是否予5-aza-CdR預(yù)處理，經(jīng)不同放射劑量照射后，細(xì)胞增殖活性均受抑制；而予5-aza-CdR預(yù)處理后，能增強(qiáng)放射線對(duì)EC9706細(xì)胞增殖活性的抑制作用。RT組D0為6.016 Gy，RT+5-aza-CdR組D0為4.506 Gy，SER為1.335±0.04。見(jiàn)表1，圖2。

表1 2組人食管癌EC9706細(xì)胞經(jīng)不同放射劑量照射后細(xì)胞增殖抑制率的變化

圖2 2組人食管癌EC9706細(xì)胞經(jīng)不同放射劑量照射后細(xì)胞增殖抑制率的變化

2.35-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后凋亡的影響 RT+5-aza-CdR組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3和Bax相對(duì)表達(dá)量較RT組明顯升高(P<0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2相對(duì)表達(dá)量較RT組降低(P<0.01)。見(jiàn)表2，圖3。

圖3 5-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表2 2組人食管癌EC9706細(xì)胞cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量變化

2.45-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，RT組(4 Gy)和RT+5-aza-CdR組G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖4。與RT組比較，RT+5-aza-CdR組G0/G1期和S期細(xì)胞減少(P<0.05或P<0.01)，而G2/M期細(xì)胞增多(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 5-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后細(xì)胞周期的影響

圖4 5-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后細(xì)胞周期的影響

2.55-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后DNA損傷修復(fù)的影響 EC9706細(xì)胞在照射后1 h p-ATM蛋白表達(dá)明顯增加，隨著時(shí)間推移，表達(dá)逐漸下降；RT+5-aza-CdR組照射1、24、48 h與RT組EC9706細(xì)胞中p-ATM蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明5-aza-CdR不是通過(guò)抑制DNA損傷修復(fù)來(lái)增加細(xì)胞放射敏感性的。見(jiàn)圖5。

圖5 5-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后DNA損傷修復(fù)的影響

2.65-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞照射后侵襲能力的影響 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RT+5-aza-CdR組細(xì)胞的侵襲能力發(fā)生了改變，與RT組相比，RT+5-aza-CdR組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示5-aza-CdR可明顯增加放射線抑制食管癌細(xì)胞侵襲的能力，提高放射敏感性。見(jiàn)圖6。

圖6 5-aza-CdR對(duì)人食管癌EC9706細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討論

放射治療是食管癌常用、有效的治療手段，治療原理為利用電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞核DNA損傷甚至雙鏈斷裂，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9-11]。多年臨床實(shí)踐證實(shí)，不同患者對(duì)放射線的敏感性和耐受性差異較大，是導(dǎo)致局部治療失敗和影響患者預(yù)后的主要原因[12]。因此，如何改善食管癌細(xì)胞的放射敏感性，是提高食管癌患者放射治療效果、減少局部復(fù)發(fā)及實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療的有效策略[13]。

5-aza-CdR作為胞嘧啶類似物，不僅表現(xiàn)出顯著的去甲基化作用，而且具有直接的抗腫瘤作用[14-17]，雖然其臨床應(yīng)用較為廣泛，但是在食管癌放射敏感性方面的研究卻較少見(jiàn)。蔡銳等[18]研究發(fā)現(xiàn)，5-aza-CdR可增加鼻咽癌細(xì)胞株C666-1的放射敏感性。Hu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，5-aza-CdR可提高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)孕酮治療的敏感性。除此之外，F(xiàn)üller等[20]發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR通過(guò)改變DNA甲基化，在急性白血病和非小細(xì)胞肺癌治療過(guò)程中，可以與多種化療藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)而提高療效。以上研究提示我們，5-aza-CdR在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)行為、功能改變及放化療敏感性方面發(fā)揮重要作用。因此，探究5-aza-CdR在食管癌治療中的作用，有可能為尋求更佳治療手段提供新的思路和方法。

在本研究中，我們首先通過(guò)CCK-8法確定5-aza-CdR最高無(wú)毒劑量為1.00 μmol/L。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中初步選定1.00 μmol/L作為5-aza-CdR的用藥劑量。進(jìn)一步在放射線照射前2 h予1.00 μmol/L 5-aza-CdR預(yù)處理，后采用CCK-8法檢測(cè)證實(shí)1.00 μmol/L 5-aza-CdR可增強(qiáng)不同照射劑量對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的抑制作用，SER為1.335±0.04。

藥物增加腫瘤細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制一般與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期進(jìn)程和DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)[21]。Bcl-2蛋白家族和cleaved caspase-3都屬于重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白。Bcl-2屬于抗凋亡因子，可以抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，而Bax為促凋亡蛋白，可以誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[22]。當(dāng)Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，其與Bax形成異源二聚體，從而抑制細(xì)胞凋亡[23-25]。所以我們進(jìn)一步從凋亡蛋白分子水平分析5-aza-CdR對(duì)EC9706細(xì)胞放射敏感性的影響。結(jié)果顯示：5-aza-CdR聯(lián)合射線照射處理EC9706細(xì)胞后，cleaved caspase-3和Bax表達(dá)較單純照射處理明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低。既往研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤細(xì)胞株SaOS2、HOS和U2OS中，5-aza-CdR通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和增加細(xì)胞凋亡來(lái)增加放射敏感性，提示5-aza-CdR可能是提高骨肉瘤治療效果的潛在放射增敏劑[26]。Qiu等[27]利用5株胃癌細(xì)胞株(OCUM-2M、OCUM-12、KATO-Ⅲ、MKN-45和MKN-74)觀察5-aza-CdR聯(lián)合照射對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)活性、細(xì)胞周期分布及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5-aza-CdR聯(lián)合照射明顯降低了OCUM-2M、OCUM-12和MKN-45細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，而G2/M期細(xì)胞百分率和細(xì)胞凋亡率均升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在5-aza-CdR聯(lián)合射線照射干預(yù)下，G0/G1期和S期細(xì)胞減少，而G2/M期細(xì)胞增多。p-ATM與DNA損傷相關(guān),當(dāng)DNA損傷時(shí)，ATM激酶被激活,使其下游的反應(yīng)元件發(fā)生磷酸化,導(dǎo)致細(xì)胞在細(xì)胞周期關(guān)卡處停滯分裂,使損傷的DNA獲得修復(fù)的時(shí)間,若修復(fù)失敗則細(xì)胞進(jìn)入凋亡過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，p-ATM蛋白表達(dá)隨著時(shí)間的推移無(wú)明顯差異。最后，我們探究了5-aza-CdR聯(lián)合射線照射對(duì)EC9706細(xì)胞侵襲能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-aza-CdR聯(lián)合射線照射使EC9706細(xì)胞的穿膜數(shù)量明顯減少，侵襲能力下降。以上結(jié)果說(shuō)明5-aza-CdR不是通過(guò)抑制DNA損傷修復(fù)來(lái)提高放射敏感性的，而是通過(guò)升高射線照射后細(xì)胞凋亡率、影響細(xì)胞周期和增強(qiáng)放射線抑制細(xì)胞侵襲的能力，從而提高食管癌細(xì)胞放射敏感性。然而5-aza-CdR是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞甲基化狀態(tài)還是通過(guò)其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還需進(jìn)行深入研究。

綜上所述，1.00 μmol/L 5-aza-CdR可增加人食管癌EC9706細(xì)胞放射敏感性，其作用機(jī)制可能與5-aza-CdR能增加放射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞周期及增強(qiáng)放射線抑制細(xì)胞侵襲的能力有關(guān)，為5-aza-CdR用于放射治療增敏提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是其是否可以作為放射治療增敏劑用于臨床，尚需要更全面、更系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究。