頭針對(duì)中風(fēng)后肢體痙攣大鼠腦皮質(zhì)中環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白影響的研究

胡冠宇，楊 康，王宇峰，叢德毓

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

中風(fēng)病嚴(yán)重危害人類的生存健康，是一類致死率高、致殘率高的疾病，由于中風(fēng)后腦功能區(qū)血管神經(jīng)單元損傷，損傷相應(yīng)腦功能區(qū)會(huì)導(dǎo)致多種功能障礙的出現(xiàn)。中風(fēng)后肢體痙攣（post-stroke spasticity，PSS）是中風(fēng)后主要功能障礙之一。研究表明，全球范圍內(nèi)中風(fēng)患者中風(fēng)后肢體痙攣的發(fā)生率為30%～80%[1-4]。中風(fēng)后肢體痙攣的預(yù)后與中風(fēng)病發(fā)病后的及時(shí)治療與康復(fù)有著密切關(guān)聯(lián)，頭針療法能改善腦血流及能量代謝，降低興奮性氨基酸毒性，調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子，減輕腦組織炎性反應(yīng)，減緩神經(jīng)元凋亡[5]。頭針療法在中風(fēng)后肢體痙攣及中風(fēng)后偏癱的康復(fù)應(yīng)用較為廣泛，且頭針配合康復(fù)訓(xùn)練較單純的康復(fù)訓(xùn)練效果更優(yōu)[6]。目前頭針療法在多種神經(jīng)退行性疾病的治療中得到應(yīng)用且效果顯著。本文利用大腦中動(dòng)脈閉阻大鼠動(dòng)物模型，初步探討環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）對(duì)中風(fēng)后肢體痙攣大鼠神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)的作用機(jī)制，及頭針對(duì)中風(fēng)后肢體痙攣大鼠的運(yùn)動(dòng)功能改善效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 45 只SPF 級(jí)8 周齡的雄性Sprague Dawley 大鼠，生產(chǎn)許可證SCXK（吉）-2018-0007，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠在溫度（23±3）℃、濕度（50±5）%、標(biāo)準(zhǔn)光/暗循環(huán)12 h的環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。

1.2 造模方法及模型評(píng)價(jià) 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用數(shù)字隨機(jī)法將45 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組15 只和造模組30 只，對(duì)造模組大鼠進(jìn)行線栓法左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉阻模型建立，具體方法如下：1）采用腹腔注射3%濃度的戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，麻醉后對(duì)大鼠頸部皮膚備皮、碘伏消毒；2）沿前正中線，在頸部進(jìn)行切口，并暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），分離動(dòng)脈周圍的神經(jīng)及肌肉；3）找到頸外動(dòng)脈（ECA），并結(jié)扎ECA，同時(shí)找到頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），在ICA 和CCA 近心端備線，并用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA 遠(yuǎn)心端；4）在動(dòng)脈夾夾閉近心端附近的做CCA 的微小切口，并將制品線栓（型號(hào)：MSRC42B250PK50，瑞沃德/RWD,Shenzhen，China）插入切口，打開動(dòng)脈夾，并繼續(xù)插入線栓約18 mm；5）結(jié)扎ICA 和CCA，縫合肌肉及皮膚切口。術(shù)后對(duì)大鼠腹腔注射4 萬單位的青霉素。假手術(shù)組僅僅做1）2）步后進(jìn)行縫合和青霉素注射。造模后1 d，采用Zealonga 評(píng)分和改良Ashworth評(píng)分的方法進(jìn)行模型篩選，評(píng)分在1～3 分，改良Ashworth 評(píng)分在I 級(jí)以上判定為模型成功。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 采用數(shù)字隨機(jī)法，將造模組大鼠隨機(jī)隨機(jī)平均分配到模型組和頭針組，頭針組采用頭針干預(yù)治療7 d，模型組不做任何干預(yù)僅做同期對(duì)照觀察；假手術(shù)組大鼠不做任何干預(yù)僅做同期對(duì)照觀察。

1.3.2 頭針干預(yù)方法 在造模后對(duì)大鼠進(jìn)行7 d 的頭針干預(yù)，每日1 次。具體針刺方法為：采用異氟醚麻醉大鼠，在對(duì)應(yīng)人體的進(jìn)針區(qū)域，對(duì)大鼠的頂區(qū)和兩側(cè)頂前區(qū)進(jìn)行針刺。采用攆轉(zhuǎn)的方法加強(qiáng)針刺刺激，1 分鐘/只，并用膠帶固定針柄，大鼠清醒后帶針自由活動(dòng)，2 h 后拔針。

1.4 觀察及檢測方法

1.4.1 行為學(xué)檢測 造模后8 d，采用改良Ashworth 評(píng)分[7-8]和平衡木行走實(shí)驗(yàn)[9]對(duì)大鼠的肌張力及運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)估。

1.4.2 組織學(xué)檢測 造模后8 d，對(duì)大鼠腦組織進(jìn)行取材，采用4%多聚甲醛固定組織，并進(jìn)行石蠟包埋切片。并對(duì)大腦皮質(zhì)尼氏染色，觀察視野內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞核及尼氏小體的變化。

1.4.3 Westernblot 造模后8 d，對(duì)大鼠患側(cè)腦皮質(zhì)組織總蛋白進(jìn)行BCA 蛋白定量，并進(jìn)行蛋白變性，經(jīng)SDS-PAGE 電泳凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。一抗孵育，4 ℃冰箱過夜。二抗室溫孵育 1 h 后，對(duì)含有蛋白條帶的 PⅤDF 膜進(jìn)行 ECL 化學(xué)發(fā)光，并對(duì)發(fā)光結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.4 RT-PCR 造模后8 天，取材患側(cè)腦皮質(zhì)組織，按Trizol 試劑盒提供的方法提取RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)腦皮質(zhì)中CREB mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測定，GAPDH 作為內(nèi)參對(duì)照，引物序列見表1。

表1 CREB、GAPDH 引物信息

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計(jì)量資料，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 頭針對(duì)肢體痙攣的治療效應(yīng) 頭針干預(yù)對(duì)肢體痙攣的治療效應(yīng)采用改良Ashworth 評(píng)分和平衡木行走實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。見表2。結(jié)果說明，頭針干預(yù)能有效改善中風(fēng)后出現(xiàn)的肢體痙攣狀態(tài)。

表2 各組大鼠頭針干預(yù)8 d 行為學(xué)指標(biāo)比較（，n =6）

表2 各組大鼠頭針干預(yù)8 d 行為學(xué)指標(biāo)比較（，n =6）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△ P ＜0.05

2.2 頭針對(duì)大鼠皮質(zhì)尼氏體結(jié)構(gòu)及數(shù)量的影響 各組尼氏染色結(jié)果如圖1 所示（圖1A 為假手術(shù)組，圖1B為模型組，圖1C 為頭針組）。假手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列整齊致密，形態(tài)規(guī)則，且神經(jīng)元內(nèi)尼氏體充盈，呈虎斑狀或點(diǎn)狀；模型組大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元排列散亂、間隙較大，尼氏體數(shù)量較少，染色較淺；頭針組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)有所改善，排列較為整齊，尼氏體數(shù)量增多，染色加深。

2.3 頭針干預(yù)對(duì)腦皮質(zhì)中CREB 的影響 如圖2 所示，頭針后第8 天，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮質(zhì)中CREB 蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，模型組大鼠皮質(zhì)中p-CREB 蛋白表達(dá)較之無顯著性差異；頭針組大鼠皮質(zhì)中CREB 及p-CREB 蛋白表達(dá)明顯增加，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CREB、p-CREB 相對(duì)表達(dá)量比較及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果詳見表3。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)組織神經(jīng)細(xì)胞變化（尼氏染色，×400）

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì) CREB、p-CREB 蛋白表達(dá)結(jié)果

應(yīng)用PCR 檢測各組大鼠CREB 對(duì)應(yīng)mRNA 的表達(dá)。如表4 所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠皮質(zhì)中CREB mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；而頭針組大鼠皮質(zhì)中CREB 蛋白表達(dá)明顯增加，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠皮質(zhì)中CREB、p-CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n =3）

表3 各組大鼠皮質(zhì)中CREB、p-CREB 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（，n =3）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△ P ＜0.05

表4 各組大鼠CREB mRNA 相對(duì)表達(dá)比較（，n =6）

表4 各組大鼠CREB mRNA 相對(duì)表達(dá)比較（，n =6）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△ P ＜0.05

3 討論

中風(fēng)后肢體痙攣在中醫(yī)學(xué)范疇內(nèi)歸類于“痙病”[10]。中醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，肢體痙攣的發(fā)病主要責(zé)之于患者氣血瘀滯不通而產(chǎn)生的筋脈失養(yǎng)。采取頭針對(duì)頭部穴位刺激的方式，可調(diào)周身的經(jīng)氣運(yùn)行，根據(jù)中醫(yī)氣行則血行的理論，進(jìn)一步促進(jìn)了肢體氣血津液運(yùn)行的恢復(fù)。中風(fēng)后肢體痙攣的發(fā)生，通常都是其上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元受損，導(dǎo)致患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)應(yīng)激反射神經(jīng)反應(yīng)，進(jìn)而致使患者出現(xiàn)不受意識(shí)控制的高肌張力反應(yīng)。CREB 是真核生物細(xì)胞核內(nèi)的調(diào)控因子，是腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF 的上游信號(hào)，能夠影響B(tài)DNF 的轉(zhuǎn)錄與合成，其相關(guān)的信號(hào)通路是促進(jìn)中風(fēng)后腦組織恢復(fù)的重要途徑[11-13]。大腦中動(dòng)脈閉阻是目前公認(rèn)的腦卒中動(dòng)物模型之一[14-15]，能較為精確的還原缺血性腦卒中或大腦的缺血再灌注損傷的病理過程，且模型的可重復(fù)性強(qiáng)、損傷程度可控，創(chuàng)口在頸部前正中線且范圍較小，適用于頭針的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。據(jù)研究顯示，頭針在改善中風(fēng)后運(yùn)動(dòng)功能障礙方面主要具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)[16]、促進(jìn)腦功能重塑[17]、改善神經(jīng)電生理[18]、改善腦部側(cè)支循環(huán)[19]及促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[20]等多方面的效應(yīng)。本研究通過動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，頭針能夠明顯改善中風(fēng)后肢體痙攣大鼠的肢體痙攣程度和運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)合組織學(xué)和蛋白檢測的結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)，頭針能夠明顯增加大鼠皮質(zhì)內(nèi)CREB、p-CREB 蛋白及mRNA 的表達(dá)，并發(fā)揮了促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞恢復(fù)的作用，這可能與CREB 相關(guān)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，頭針可有效調(diào)節(jié)CREB 的表達(dá)，并對(duì)腦皮質(zhì)中神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)具有促進(jìn)作用，從而起到了對(duì)中風(fēng)后肢體痙攣的治療效應(yīng)。