麥冬有效部位提取及對(duì)支原體感染小鼠肺組織免疫調(diào)節(jié)作用

孫 妍，王 靜，侯 喆，綦 菲，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，哈爾濱 150036）

麥冬為百合科沿階草屬多年生常綠草本植物，麥冬味甘、微苦，性微寒，歸胃、肺、心經(jīng)，有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、益胃生津、清心除煩的功效，用于肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥,是中藥滋陰潤(rùn)肺常用藥。《神農(nóng)本草經(jīng)》將麥冬列為養(yǎng)陰潤(rùn)肺的上品，言其“久服輕身，不老不饑”?，F(xiàn)代研究表明，麥冬塊根中富含有多糖、皂苷、黃酮等有效成分，具有抗心肌缺血、抗心律失常、保護(hù)心肌、抗血栓形成、抗炎、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫、改善肝肺損傷及鎮(zhèn)咳等藥理作用[1-2]。

肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）引起的呼吸道感染性肺炎[3]。兒童肺炎支原體肺炎的主要臨床特征為反復(fù)高熱、頑固性干咳、少痰或痰黏難咯等，從病機(jī)角度為外感風(fēng)熱燥毒所致“肺燥咳嗽”，屬于燥邪犯肺的范疇[4]。臨床上提出了從燥論治小兒支原體肺炎，以“養(yǎng)陰清肺，潤(rùn)肺止咳”為其主要治則，取得了較好療效[5-7]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

98-1-B 型電子調(diào)溫電熱套購(gòu)于天津市泰斯特儀器有限公司；RE52-3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)于上海滬西分析儀器廠有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵購(gòu)于鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DZF-6210 型真空干燥箱購(gòu)于上海雷韻儀器制造有限公司；UⅤ-160A 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)于日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋購(gòu)于上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BSA22AS-CW 電子天平購(gòu)于Sartorim 公司；LGJ-10F 冷凍干燥機(jī)購(gòu)于北京松源華興科技發(fā)展有限公司。95%乙醇（批號(hào)：20130109）、無(wú)水乙醇（批號(hào)：20130422）、乙醚（批號(hào)：20130715）、氯化鈉（批號(hào)：20130319）、正丁醇（批號(hào)：20130522）購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氯仿（批號(hào)：20121013）購(gòu)于天津市博迪化工有限公司；丙酮（批號(hào)：20130325）購(gòu)于天津市化學(xué)試劑六廠分廠；硫酸（批號(hào)：20110107）購(gòu)于西隴化工股份有限公司；葡萄糖（批號(hào)：F20120815）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蒽酮（批號(hào)：20120313）購(gòu)于北京化工廠；麥冬藥材（批號(hào)：130109）購(gòu)于河北安國(guó)振宇藥業(yè)有限公司；魯斯可皂苷元（批號(hào)：L-009-130730）購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；牛血清白蛋白（批號(hào)：F20100405）購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；氫氧化鈉（批號(hào)：20090613）購(gòu)于天津市大陸化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)（進(jìn)口分裝）購(gòu)于美國(guó)sigma 公司；D101 大孔樹(shù)脂（批號(hào)：20130421）購(gòu)于天津市匯達(dá)化工有限公司；磷酸（批號(hào)：20120207）購(gòu)于西隴化工股份有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 麥冬總皂苷的提取工藝麥冬飲片加10 倍量75%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，提取液回收乙醇得到浸膏后，經(jīng)過(guò)D101 大孔樹(shù)脂柱，收集70%乙醇洗脫液，洗脫液回收乙醇后冷凍干燥，得麥冬總皂苷。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定精密稱取魯斯可皂苷元對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液。精密吸取0.5、1、2、3、4、5、6 mL 標(biāo)準(zhǔn)液置于具塞試管中，于水浴中揮干溶劑。精密加入10 mL 高氯酸，搖勻，置熱水中保溫15 min，取出，冰水冷卻，高氯酸為空白，用紫外-可見(jiàn)分光光度法，在397 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.2 正交試驗(yàn)根據(jù)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，以皂苷提取率為考察指標(biāo)，選取乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間作為考察因素，各取3 個(gè)水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定麥冬皂苷提取的最佳工藝。因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.1.3 麥冬皂苷純化動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)的單因素考察取預(yù)處理的3 根D101 大孔吸附樹(shù)脂柱，每根柱裝30 g樹(shù)脂，通過(guò)吸附時(shí)間、上柱體積、洗脫劑濃度及洗脫劑用量考察各因素對(duì)樹(shù)脂吸附效果及麥冬總皂苷含量的影響。單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2 麥冬多糖提取分離麥冬飲片加10 倍量75%乙醇加熱回流提取3 次，每次2 h，提取后揮干乙醇得干燥的麥冬藥渣，經(jīng)水提醇沉、依次用無(wú)水乙醇、乙醚、丙酮洗滌，洗滌后減壓得到粗多糖粉末，用sevage 法脫蛋白，得麥冬多糖。

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制將干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品配成0.2 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶中，以蒸餾水定容搖勻，得系列對(duì)照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取上述系列對(duì)照品溶液1.0 mL，分別置于10 mL 具塞試管中，將試管置于冰水中，在冰水中分別向試管中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4 mL，待各管加完后同時(shí)搖勻，置于沸水浴中加熱10 min，取出，迅速冷卻至室溫，放置10 min，于627 nm 處測(cè)定吸光度。另精密吸取蒸餾水1.0 mL，同法操作，作為空白對(duì)照。以葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。

2.2.3 樣品溶液多糖含量的測(cè)定分別精密吸取3 份濃度為0.1 mg/mL 麥冬粗多糖樣品溶液1.0 mL，于10 mL具塞試管中，按2.2.2 項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度，計(jì)算樣品多糖的百分含量。

2.2.4 Sevag 法脫除麥冬多糖中蛋白質(zhì)[8]Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

2.3 麥冬有效部位對(duì)支原體感染小鼠臟器指數(shù)及肺組織炎癥的影響

2.3.1 實(shí)驗(yàn)材料100 只BALB/c 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，SPF 級(jí)，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。阿奇霉素分散片（批號(hào)：20130502）購(gòu)于哈藥集團(tuán)制藥六廠；養(yǎng)陰清肺糖漿（批號(hào)：3150021）購(gòu)于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠；麥冬飲片（批號(hào)：130109）購(gòu)于河北安國(guó)振宇藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定麥冬為四川麥冬Radix Ophiopogonis（Thunb.）Ker-Gawl.的干燥塊根；PPLO 培養(yǎng)基購(gòu)于Becton，Dickinson and Company，USA；蘇木伊紅染液購(gòu)于南京建成公司；防脫片購(gòu)于哈爾濱博潤(rùn)生物公司；甲醛、甲醇、乙醇、鹽酸、二甲苯等均為分析純。肺炎支原體國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCCFH15531）購(gòu)于美國(guó)菌種保藏中心。DL-CJ-1W 生物凈化工作臺(tái)購(gòu)于北京東連哈爾儀器制造有限公司；Milli-Q Reference system 自動(dòng)雙重純水蒸餾器購(gòu)于MILLI-Q公司；BP211D分析天平購(gòu)于Sartorius公司；2、20、200 μL 微量加樣器購(gòu)于Eppendoff 公司；MDF-382E -80 ℃低溫冰箱購(gòu)于日本三洋公司；KD-TS3A 自動(dòng)組織脫水機(jī)購(gòu)于浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；KD-BM 生物組織包埋機(jī)購(gòu)于浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司；RM2235 組織切片機(jī)購(gòu)于德國(guó)萊卡公司；BX4-1 生物顯微鏡購(gòu)于OLYMPUS 公司；DP-72 組織生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)購(gòu)于OLYMPUS 公司。

2.3.2 動(dòng)物分組100 只BALB/c 小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，隨機(jī)分為10 組，每組10 只。分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿奇霉素組、養(yǎng)陰清肺組、麥冬多糖高劑量組、麥冬多糖中劑量組、麥冬多糖低劑量組、麥冬皂苷高劑量組、麥冬皂苷中劑量組、麥冬皂苷低劑量組。

2.3.3 造模、給藥及標(biāo)本采集先用乙醚麻醉，然后用微量加樣器吸取106 CCU/mL 肺炎支原體培養(yǎng)液緩緩滴入小鼠鼻孔內(nèi)利用其自然吸氣式動(dòng)作，將菌液吸入氣道至肺部。20 μL 感染3 d，3 d 后給藥，采取灌胃的方法給藥，空白組和模型組給等容積的生理鹽水，阿奇霉素組給藥5 d（第1 天給65 mg/kg，第2～5 天給32.5 mg/kg）、養(yǎng)陰清肺組（5 mL/kg）、麥冬多糖高劑量組（81.2 mg/kg）、麥冬多糖中劑量組（40.6 mg/kg）、麥冬多糖低劑量組（20.3 mg/kg）、麥冬皂苷高劑量組（66.8 mg/kg）、麥冬皂苷中劑量組（33.4 mg/kg）、麥冬皂苷低劑量組（16.7 mg/kg），連續(xù)給藥6 d，剝離胸腺和脾臟后立即電子天平稱重；剪取左肺組織，放入4%甲醛中固定。

2.3.4 臟器指數(shù)影響胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)計(jì)算依據(jù)以下公式：胸腺（脾臟）指數(shù)（g/100 g）=100×胸腺（脾臟）質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.3.5 對(duì)肺組織病理變化的影響取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯中透明2 次，放入石蠟內(nèi)進(jìn)行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機(jī)上切片，將完全展開(kāi)的蠟片貼附于清潔載玻片上，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2 組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 麥冬皂苷含量測(cè)定結(jié)果

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線在最大吸收波長(zhǎng)397 nm 處檢測(cè)吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=7.001 4X＋0.033 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。表明麥冬總皂苷在25～300 μg范圍內(nèi)含量與吸光度呈良好線性關(guān)系。

3.1.2 正交試驗(yàn)結(jié)果正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表3，4。通過(guò)比較可以看出，各因素對(duì)麥冬皂苷提取率的影響為A ＞C ＞B，最佳的提取條件為A2B3C2。表4 可以看出A、B 和C 對(duì)麥冬皂苷的提取均有顯著性影響。由表3 可以看出提取次數(shù)的第2 水平和第3 水平的影響基本一樣，從節(jié)約成本的角度考慮，將提取次數(shù)確定為3 次。這樣提取的最佳工藝為用75%乙醇提取，提取時(shí)間2 h，提取3 次。

表3 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 提取工藝方差分析結(jié)果

3.1.3 動(dòng)態(tài)吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖1。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，影響麥冬總皂苷含量的提取工藝條件范圍可以確定為：靜止時(shí)間50 min，吸附液量與樹(shù)脂的最佳比例為6:1，乙醇最佳洗脫濃度為70%，最佳的洗脫劑用量為6 倍樹(shù)脂體積的量。

3.1.4 麥冬皂苷含量測(cè)定分別稱取3 份麥冬藥材，每份10 g，以皂苷提取的最佳工藝條件進(jìn)行提取，麥冬皂苷的得率為2.17%，皂苷的含量為59.21%。

3.2 麥冬多糖含量測(cè)定結(jié)果

3.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線在最大吸收波長(zhǎng)627 nm 處檢測(cè)吸光度，得回歸方程Y=9.905X＋0.007 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。表明在0.020～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)葡萄糖的含量與吸光度呈良好線性關(guān)系。

圖1 動(dòng)態(tài)吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 麥冬多糖含量測(cè)定 見(jiàn)表5。多糖提取率（%）=粗多糖質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%=11.8%

表5 多糖含量測(cè)定結(jié)果

3.2.3 Sevage 法脫除麥冬多糖中蛋白質(zhì)

3.2.4 牛血清蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線 牛血清白蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.006 2X＋0.182 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 5。表明在10～80 μg 范圍內(nèi)，牛血清白蛋白的含量與吸光度呈良好線性關(guān)系。

3.2.5 Sevage 法脫除麥冬多糖中蛋白質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)氯仿正丁醇體積比為5:1，樣品和Sevage 試劑體積比為1:1，脫蛋白2 次后，經(jīng)蒽酮硫酸法測(cè)定除蛋白后的多糖百分含量由62.16%提高到64.38%，證明多糖純化效果較好。

3.3 臟器指數(shù)及病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 小鼠狀態(tài)觀察 空白組小鼠目光有神，反應(yīng)靈敏，活潑好動(dòng)，毛色有光澤，呼吸平穩(wěn)，進(jìn)食正常，體質(zhì)量逐漸增加；模型組小鼠毛色枯槁無(wú)光澤、易脫落，目光呆滯，精神萎靡，呼吸急促不暢，鼻周可見(jiàn)膿性分泌物，偶有血絲，舌質(zhì)暗，肺部出現(xiàn)明顯的肺濕呼吸音，進(jìn)食及活動(dòng)減少；體質(zhì)量雖有增加，但低于空白對(duì)照組；各給藥組癥狀有所減輕，毛色光澤尚可，有脫落，反應(yīng)較迅速，精神及活動(dòng)尚可，食量、飲水較正常，一般狀態(tài)明顯優(yōu)于模型組。

3.3.2 肺組織形態(tài)觀察 空白組小鼠肺外觀無(wú)異常，呈粉紅色，表面光滑，彈性好。模型組小鼠肺部病變明顯，外觀充血、水腫，暗紅色，嚴(yán)重者肺葉分布散在大小不等的壞死灶。各給藥組與模型組相比較，雙肺色澤、硬度、彈性、體積、結(jié)節(jié)樣改變等情況有不同程度的好轉(zhuǎn)，肺臟輕度水腫，但個(gè)別鼠仍可見(jiàn)兩肺的顏色略暗紅，大部分動(dòng)物肺臟彈性尚可，部分肺葉偶見(jiàn)散在的點(diǎn)狀灰白色斑塊。

3.3.3 藥物對(duì)臟器指數(shù)的影響 見(jiàn)表6。

表6 對(duì)小鼠脾和胸腺指數(shù)的影響（，n =10） g/100 g

表6 對(duì)小鼠脾和胸腺指數(shù)的影響（，n =10） g/100 g

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

與空白對(duì)照組比較，模型組的脾臟和胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。脾臟指數(shù)顯示，與模型組相比麥冬皂苷中、低劑量組及麥冬多糖低劑量組具有極顯著差異（P＜0.01），阿奇霉素組、養(yǎng)陰清肺組及麥冬多糖中劑量組具有顯著差異（P＜0.05）；胸腺指數(shù)顯示，與模型組對(duì)比，養(yǎng)陰清肺組，麥冬皂苷中、低劑量組，麥冬多糖中、低劑量組具有極顯著差異（P＜0.01），阿奇霉素組及麥冬皂苷高劑量組具有顯著差異（P＜0.05）。

3.3.4 HE 染色觀察 由肺組織切片可見(jiàn)空白組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰正常，無(wú)間質(zhì)性肺炎改變，僅個(gè)別偶有淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組小鼠肺組織有明顯炎癥，炎癥反應(yīng)包括氣管支氣管周圍的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管支氣管腔內(nèi)的炎性細(xì)胞滲出，偶有充血，血管周圍的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)性肺炎，以上均不同程度的存在，說(shuō)明造模成功。各組病理結(jié)果圖片見(jiàn)圖2。

圖2 麥冬有效部位對(duì)支原體感染小鼠肺組織病變的影響（HE，×20）

4 討論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)麥冬皂苷提取工藝研究，提取皂苷后的殘?jiān)占?，再進(jìn)行多糖提取工藝的研究，達(dá)到對(duì)麥冬飲片的綜合利用。結(jié)果顯示，麥冬皂苷的得率為2.17%，皂苷含量為59.21%；麥冬粗多糖百分含量為62.16%，脫蛋白后含量可以達(dá)到64.38%，多糖提取率為11.8%。

脾臟和胸腺是人體非常重要的免疫器官，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的變化直接反映了機(jī)體的免疫功能狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著低于空白組（P＜0.05），說(shuō)明在小鼠感染肺炎支原體肺炎之后免疫指數(shù)低下，麥冬多糖及麥冬皂苷可明顯增加脾臟、胸腺質(zhì)量，提升臟器指數(shù)，說(shuō)明麥冬有效部位可提高肺炎支原體肺炎免疫功能。

肺炎支原體肺炎感染小鼠肺組織的主要病理表現(xiàn)為間質(zhì)性肺炎和細(xì)支氣管肺炎，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，麥冬多糖及麥冬皂苷能明顯減輕肺炎支原體肺炎感染引起的小鼠肺部炎癥，可調(diào)節(jié)肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)趨向正常。