環(huán)孢素治療兒童腎病綜合征的臨床效果觀察

曲英慧 周海瀾

聊城市第三人民醫(yī)院兒科，山東 252000

原發(fā)性腎病綜合征（primary nephrotic syndrome，PNS）屬于臨床常見(jiàn)的兒科疾病，占到所有腎病綜合征90%以上，患兒出現(xiàn)大量的蛋白尿、水腫和低蛋白血癥等體征，嚴(yán)重地影響了患兒生活質(zhì)量與身心健康，研究發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生同免疫因素、環(huán)境和遺傳等因素均關(guān)系密切［1］。目前臨床治療PNS主要以激素治療為主，但是單一使用效果不好，而且不良反應(yīng)較重，免疫抑制藥物治療也是重要手段，可以緩解蛋白尿體征，但是均由于存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)導(dǎo)致長(zhǎng)期使用受到限制，環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）為鈣調(diào)磷酸酶抑制劑類藥物，在改善腎臟疾病預(yù)后中具有重要意義，而且臨床聯(lián)合激素治療PNS報(bào)道較為少見(jiàn)［2］。Toll樣受體屬于人體重要跨膜蛋白，是天然免疫受體，可以對(duì)病原微生物分子模式識(shí)別，在免疫機(jī)能方面具有重要作用，同時(shí)能夠?qū)Λ@得性免疫提供刺激信號(hào)，引導(dǎo)形成一系列免疫反應(yīng)，但是在腎病綜合征患兒中以往報(bào)道少見(jiàn)［3］。本研究分析了CsA 治療PNS 患兒的療效及對(duì)Toll 樣受體（TLRs）表達(dá)的影響，以期為臨床提供指導(dǎo)和依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2016年1月至2018年12月腎病內(nèi)科收治的100例PNS患兒，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為研究組（潑尼松＋CsA）和對(duì)照組（潑尼松＋霉酚酸酯）各50例。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①PNS患兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎病學(xué)組制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②PNS患兒主要表現(xiàn)為大量蛋白尿：一周內(nèi)3次尿蛋白定性達(dá)到或超過(guò)（+++）（++++），或者24 h尿蛋白定量達(dá)到或超過(guò)50.0 mg/kg；③低蛋白血癥（患兒血漿白蛋白＜25.0 g/L）；④治療前均行腎臟穿刺檢查確診；⑤患兒年齡范圍為3～14 歲；⑥治療前與患兒家屬簽署知情同意書(shū)。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①腎臟腫瘤、結(jié)核；②先天性心臟病；③遺傳或染色體畸變；④患兒血肌酐（Cr）＞3.0 mg/dl；⑤患兒伴有嚴(yán)重的感染、肝功能障礙、血液系統(tǒng)疾病等；⑥對(duì)治療藥物具有嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)；⑦狼瘡性腎炎、IgA腎病、紫癜性腎病等其他原因引起的腎臟疾病。研究組患兒中男32 例，女18 例；年齡范圍為2～14 歲，年齡（6.5±2.3）歲；病程范圍為3～36 個(gè)月，病程（14.2±7.9）個(gè)月；腎臟穿刺病理學(xué)：微小病變型26例、系膜增生性腎小球腎炎8例、局灶節(jié)段性腎小球硬化10例、膜增生性腎小球腎炎6例；治療前患兒尿蛋白排泄量為（93.2±33.1）mg（/kg·d）；中途有2 例患兒轉(zhuǎn)院治療。對(duì)照組患兒中男29 例，女21 例；年齡范圍為2～14 歲，年齡（6.4±3.0）歲；病程范圍為3～36 個(gè)月，病程（13.8±6.2）個(gè)月；腎臟穿刺病理學(xué)：微小病變型29 例、系膜增生性腎小球腎炎7 例、局灶節(jié)段性腎小球硬化7 例、膜增生性腎小球腎炎7例；治療前患兒尿蛋白排泄量為（96.0±35.0）mg（/kg·d）；有3例患兒因各種原因轉(zhuǎn)院或退出本研究。兩組患兒的年齡、性別等上述基線資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 方法 （1）對(duì)照組：采用潑尼松（華中藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H42021394，藥品批號(hào)：20180211）＋霉酚酸酯（上海羅氏制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20052237，藥品批號(hào)：20180305）治療，潑尼松口服，初始服用劑量為2 mg（/kg·d），最大劑量應(yīng)低于60 mg/d，晨起服用，4～8 周后減量 2.5～5.0 mg，直至 0.5～1.0 mg/kg 維持治療3個(gè)月，隨后每周減量2.5～5.0 mg直至停藥。霉酚酸酯劑量20～30 mg（/kg·d），分為2次口服，連續(xù)服用1年。（2）研究組：采用潑尼松＋CsA（辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H20113117，藥品批號(hào)：2018109）治療，潑尼松治療方法同對(duì)照組，CsA在患者開(kāi)展激素治療第4周開(kāi)始使用，劑量2～3 mg（/kg·d），血藥谷濃度維持在80～120 μg/L，連續(xù)服用1年。

1.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 抽取治療前后患兒空腹靜脈血4ml，在外周血單個(gè)核細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）mRNA、白細(xì)胞介素 -18（IL-18）mRNA 提取，提取總RNA 后將反應(yīng)物放置37 ℃水浴箱中孵育60 min，獲取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，采用RT-PCR 法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，反應(yīng)為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造生產(chǎn)的ABI 7500 熒光定量PCR 儀器操作，試劑盒由天根生化科（北京）有限公司生產(chǎn)。經(jīng)抽取空腹靜脈血脫酶后置于無(wú)菌玻璃離心管，使用RNAiso Plus RNA 提取試劑盒提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA，提取總RNA 后將反應(yīng)物放置37 ℃水浴箱中孵育60 min，獲取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，樣本放至熱循環(huán)儀中，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s 4 ℃循環(huán) 1 次。反應(yīng)完成后，再次將樣本放至冰中冷卻，RT-PCR 法測(cè)定Toll 樣受體 3（TLR3）mRNA、Toll 樣受體 9（TLR9）mRNA 水平，確認(rèn)RT-PCR 的擴(kuò)增曲線和融解曲線，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，試劑盒由天根生化科（北京）有限公司生產(chǎn)。

1.4 臨床療效評(píng)價(jià) 分別于治療3個(gè)月、6個(gè)月時(shí)檢測(cè)兩組患兒的臨床緩解率。（1）完全緩解評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：患兒臨床癥狀、體征完全消失，尿蛋白定性檢測(cè)連續(xù)3次轉(zhuǎn)陰（或者患兒24 h尿蛋白定量測(cè)定＜150 mg/d），人血白蛋白水平達(dá)到正常水平。（2）部分緩解判斷標(biāo)準(zhǔn)：治療后患兒的24 h尿蛋白定量較治療前下降＞50%、人血白蛋白水平上升定義為部分緩解；（3）24 h尿蛋白定量下降＜50%定義為未緩解。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0軟件，兩組TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 等計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；性別、療效、不良反應(yīng)發(fā)生率等計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表達(dá)水平比較 治療前，研究組和對(duì)照組患兒TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；治療后，研究組的TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表達(dá)水平均低于對(duì)照組（均P＜0.05），具體見(jiàn)表1。

2.2 兩組患兒TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表達(dá)水平比較 治療前，兩組患兒TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA 水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；治療后，研究組的TGF-β1 mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

2.3 兩組患兒臨床療效比較 在治療3 個(gè)月后，研究組患兒的整體療效分布優(yōu)于對(duì)照組（Z=-2.070，P=0.038）；但是在治療6 個(gè)月后，研究組和對(duì)照組患兒的整體療效分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-0.951，P=0.342），詳見(jiàn)表3。

表1 兩組原發(fā)性腎病綜合征患兒TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表達(dá)水平比較（/βactin，）

表1 兩組原發(fā)性腎病綜合征患兒TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表達(dá)水平比較（/βactin，）

注：對(duì)照組采用潑尼松＋霉酚酸酯治療，研究組采用潑尼松＋環(huán)孢素A治療；TLR3為Toll樣受體3，TLR9為Toll樣受體9

組別研究組對(duì)照組t值P值例數(shù) 4 8 TLR3 mRNA治療前0.967±0.241 1.004±0.275-0.698 0.487 47治療后0.501±0.116 0.648±0.150-5.350＜0.001 TLR9 mRNA治療前1.983±0.447 1.890±0.433 1.030 0.306治療后1.332±0.260 1.476±0.258-2.709 0.008

表2 兩組原發(fā)性腎病綜合征患兒TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表達(dá)水平比較（/βactin，）

表2 兩組原發(fā)性腎病綜合征患兒TGF-β1 mRNA、IL-18 mRNA表達(dá)水平比較（/βactin，）

注：對(duì)照組采用潑尼松＋霉酚酸酯治療，研究組采用潑尼松＋環(huán)孢素 A 治療；TGF-β1 為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1，IL-18 為白細(xì)胞介素-18

治療后0.078±0.024 0.083±0.027-0.954 0.342組別研究組對(duì)照組t值P值例數(shù) 4 8治療后0.153±0.051 0.178±0.048-2.459 0.016 TGF-β1 mRNA治療前0.331±0.084 0.347±0.090-0.896 0.373 47 IL-18 mRNA治療前0.173±0.052 0.168±0.050 0.478 0.634

表3 兩組原發(fā)性腎病綜合征患兒臨床療效比較[例（%）]

2.4 兩組患兒的人血白蛋白、膽固醇水平比較 治療前，兩組患兒的人血白蛋白、膽固醇水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；治療后，研究組的膽固醇水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見(jiàn)表4。

表4 兩組原發(fā)性腎病綜合征患兒的人血白蛋白、膽固醇水平比較（）

表4 兩組原發(fā)性腎病綜合征患兒的人血白蛋白、膽固醇水平比較（）

注：對(duì)照組采用潑尼松＋霉酚酸酯治療，研究組采用潑尼松＋環(huán)孢素A治療

治療后4.20±0.85 4.56±0.78-2.150 0.034組別研究組對(duì)照組t值P值例數(shù)48 47人血白蛋白（g/L）治療前24.11±3.02 25.20±2.96-1.776 0.079治療后39.75±3.30 38.81±3.42 1.363 0.176膽固醇（mmol/L）治療前9.41±1.86 9.20±1.93 0.540 0.590

2.5 兩組患兒不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 治療后，研究組的胃腸道不適、并發(fā)感染、多毛、齒齦增生發(fā)生率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 兩組原發(fā)性腎病綜合征患兒不良反應(yīng)發(fā)生情況比較[例（%）]

3 討 論

腎病綜合征屬于臨床常見(jiàn)的兒科系統(tǒng)疾病，患兒由于腎小球?yàn)V過(guò)膜的通透性增加造成了大量的血漿蛋白從尿液中流失同時(shí)引發(fā)了一系列病理生理變化，PNS 屬于最為常見(jiàn)的類型之一，超過(guò)90%以上，而且病程遷延，極易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重地影響了兒童身心健康與生活質(zhì)量［3］。目前認(rèn)為引發(fā)腎病綜合征發(fā)生的因素較多，一方面和細(xì)胞免疫有關(guān)，T 淋巴細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞免疫中最為主要的細(xì)胞，具有高度異質(zhì)性，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)Th1 細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)主要與伴細(xì)胞增生與新月體形成有關(guān)［4-5］；生理狀態(tài)下人體Th1 產(chǎn)生的細(xì)胞因子 IFN-γ 能夠抑制 Th2 應(yīng)答 ，Th2 細(xì)胞形成細(xì)胞因子IL-10 能夠阻斷Th1 細(xì)胞的活化，兩種細(xì)胞的相互平衡制約共同維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，一旦失去平衡則內(nèi)環(huán)境失去穩(wěn)態(tài)導(dǎo)致疾病發(fā)生［6］。另一方面研究發(fā)現(xiàn)腎臟固有細(xì)胞主要為內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞以及腎小管上皮細(xì)胞，足細(xì)胞可以參與疾病發(fā)生，足細(xì)胞能夠高度分化形成指突狀的足突，鄰近的足突之間由裂孔膜連接并緊貼在毛細(xì)血管基底膜的外側(cè)，可以抵消腎小球基底膜膨出穩(wěn)定腎小球結(jié)果，同時(shí)可以合成血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子維持腎臟血管濾過(guò)屏障功能，一旦足細(xì)胞損傷則血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)升高，腎臟固有細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等，研究認(rèn)為足突回縮導(dǎo)致蛋白尿形成［7-8］。此外原位免疫復(fù)合物也會(huì)介導(dǎo)腎臟受損，一般情況原位免疫復(fù)合物很少進(jìn)入到循環(huán)，在血流緩慢的位置沉積，腎小球系膜細(xì)胞表面存在的抗原同機(jī)體血液循環(huán)中的抗體與腎小球固有抗原相結(jié)合后沉積在腎臟系膜區(qū)后形成了原位免疫復(fù)合物，進(jìn)而激活補(bǔ)體誘導(dǎo)嗜堿粒細(xì)胞釋放血管活性物質(zhì)進(jìn)而增高血管壁的通透性，還可以釋放組胺吸引中性粒細(xì)胞聚集于免疫復(fù)合物周圍，最終沉積于內(nèi)皮細(xì)胞與基底膜，促進(jìn)了腎病綜合征發(fā)生和發(fā)展［9-10］。

目前臨床治療原發(fā)性腎病綜合主要以激素治療為主，但是不良反應(yīng)多，效果不佳，因此主要通過(guò)采取免疫抑制劑開(kāi)展治療，傳統(tǒng)的免疫抑制藥物副反應(yīng)較大，一旦劑量過(guò)大還會(huì)引發(fā)遠(yuǎn)期不良反應(yīng)增加［11］。本研究中治療3 個(gè)月后，研究組患兒的整體療效分布優(yōu)于對(duì)照組，說(shuō)明在短期內(nèi)采用CsA 聯(lián)合激素治療PNS 患兒效果顯著。這主要是和CsA可以參與T 淋巴細(xì)胞活化機(jī)制有關(guān)，該藥物可以通過(guò)與細(xì)胞漿中的CsA 受體結(jié)合抑制鈣調(diào)磷酸酶的磷酸化酶活性，進(jìn)而造成了CD4+T 淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑被抑制，下調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)，同時(shí)可以糾正T 淋巴細(xì)胞比例失衡［12-13］。本研究還發(fā)現(xiàn)治療后，研究組的人血白蛋白高于對(duì)照組，膽固醇水平則低于對(duì)照組，說(shuō)明采用CsA 聯(lián)合激素治療PNS 患兒可以提升白蛋白濃度，降低膽固醇濃度。這主要是由于CsA 可以恢復(fù)足細(xì)胞細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性并減少蛋白尿形成，同時(shí)還可以逆轉(zhuǎn)血小板活化因子對(duì)腎小球上皮細(xì)胞合成蛋白多糖的抑制，因此可以增加腎小球上皮細(xì)胞分泌硫酸類肝素和蛋白多糖形成，提升了腎小球基底膜的孔徑選擇性和電荷選擇性，降低分流濾過(guò)，促進(jìn)足突重建［14-15］。在使用CsA 應(yīng)用過(guò)程中需要關(guān)注腎臟毒性，一般呈現(xiàn)劑量依賴性，在減量后可以恢復(fù)，其余常見(jiàn)的不良反應(yīng)包括面部多毛、輕度高血壓、呼吸道感染，少數(shù)出現(xiàn)肝功能異常、齒齦增生和胃腸道反應(yīng)，通過(guò)開(kāi)展對(duì)癥處理后均無(wú)異常。研究組的胃腸道不適、并發(fā)感染、多毛表現(xiàn)、齒齦增生發(fā)生率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明采用CsA聯(lián)合激素治療PNS患兒不會(huì)增加不良反應(yīng)，應(yīng)用較為安全。目前建議在開(kāi)展CsA 治療中應(yīng)定期檢測(cè)藥物谷濃度，讓血藥谷濃度維持在100～200 μg/L，既可以確保藥物治療效果，同時(shí)也減少了不良反應(yīng)發(fā)生［16］。

本研究分析了TLR3 mRNA、TLR9 mRNA變化，T淋巴細(xì)胞屬于人體細(xì)胞免疫主要細(xì)胞，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與了PNS發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，具有維持自身免疫耐受和避免免疫損傷機(jī)體功能，但是在多種自身免疫性疾病發(fā)展中具有重要作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)治療后，研究組的TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，說(shuō)明采用CsA聯(lián)合激素治療PNS患兒可以降低 TLR3 mRNA、TLR9 mRNA 表達(dá)水平，提示 PNS 發(fā)生同TLR3、TLR9 異常活化有關(guān)，通過(guò)降低 TLR3 mRNA、TLR9 mRNA表達(dá)可以減輕患者臨床體征。TLRs存在于人體的單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞中，可以參與天然免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)，發(fā)揮介導(dǎo)炎癥反應(yīng)作用，對(duì)病原微生物的侵襲發(fā)揮抵御作用，同時(shí)機(jī)體抗原呈遞細(xì)胞如樹(shù)突細(xì)胞借助其表達(dá)TLRs識(shí)別脂多糖，造成樹(shù)突細(xì)胞被活化而成熟，提供獲得性免疫共刺激信號(hào)［18］。TLR3 信號(hào)通路可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；而TLR9則和腎臟損傷有關(guān)，通過(guò)激活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子及黏膜免疫，造成免疫復(fù)合物在腎臟沉積，致使足細(xì)胞損傷及腎小球基質(zhì)擴(kuò)張，形成蛋白尿及血尿，揭示了PNS發(fā)病機(jī)制以及CsA治療的途徑［19］。本研究還發(fā)現(xiàn)治療后，研究組的TGF-β1 mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，說(shuō)明采用CsA聯(lián)合激素治療PNS患兒可以抑制患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)程度。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β則在出現(xiàn)腎小球硬化患者中表達(dá)顯著增加，會(huì)刺激腎臟局部T細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)腎臟微環(huán)境炎癥因子增多，導(dǎo)致腎臟形成慢性炎癥損傷［20］。

本研究?jī)?yōu)勢(shì)在于證實(shí)了CsA 聯(lián)合激素治療PNS 患兒效果較好，同以往研究類似，但是本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)了該方案在改善患兒白蛋白濃度和降低血脂方面效果顯著，而且初步闡述了發(fā)揮治療作用同調(diào)節(jié)TLR3、TLR9 異?；罨P(guān)系密切。但是本研究隨訪時(shí)間短，入組患者數(shù)量較少，而且各指標(biāo)監(jiān)測(cè)過(guò)程中受到的影響因素較多，可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)存在偏倚，因此還需長(zhǎng)期隨訪、擴(kuò)充樣本量深入觀察。

綜上所述，激素＋CsA 較激素＋霉酚酸酯治療PNS 患兒對(duì)TLR3 mRNA、TLR9 mRNA、TGF-β1mRNA 的調(diào)節(jié)作用更顯著，早期臨床效果更好。

利益沖突：作者已申明文章無(wú)相關(guān)利益沖突。