中性脲酶固定化降解黃酒中尿素

李童,錢斌,周建弟,徐巖,王棟*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122)3(古越龍山紹興酒股份有限公司技術(shù)中心,浙江 紹興,312000)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC),是一種具有遺傳毒性及較強(qiáng)致癌性的物質(zhì)[1],天然存在于多種發(fā)酵食品(如醬油、食醋、泡菜)和酒精飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒、日本清酒、白蘭地)中[2-4]。2007年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)將EC歸類為2A類致癌物[5],引起人們對(duì)長(zhǎng)期飲用酒精飲料安全性的擔(dān)憂。

研究發(fā)現(xiàn),黃酒中的尿素是EC的主要前體物質(zhì),90%左右的EC是由尿素和乙醇經(jīng)化學(xué)反應(yīng)生成的[6],因此控制黃酒中的尿素含量對(duì)于控制EC的生成具有重要意義。關(guān)于黃酒中尿素的控制,目前已有許多方法報(bào)道,其中利用脲酶是較為直接、簡(jiǎn)便的方法。由于黃酒的酸性環(huán)境(pH 4.0左右),大部分研究者將酸性脲酶應(yīng)用于黃酒中尿素的減除。早期主要是將游離酸性脲酶直接加入黃酒中進(jìn)行尿素的降解[7-9]；為提高脲酶的重復(fù)使用性,近些年來(lái)不少研究者將酸性脲酶固定化后處理酒樣[10-13]。

雖然酸性脲酶對(duì)黃酒中尿素的降解有一定的效果,但酸性脲酶目前只有在日本和美國(guó)的少數(shù)企業(yè)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn),其進(jìn)口和使用在國(guó)內(nèi)有一定的限制[14]。而國(guó)內(nèi)對(duì)酸性脲酶的研究還停留在實(shí)驗(yàn)階段,尚無(wú)商業(yè)化酸性脲酶供應(yīng),這大大限制了酸性脲酶處理黃酒的工業(yè)化應(yīng)用。我國(guó)目前市售的脲酶基本上是植物來(lái)源的中性脲酶,其價(jià)格便宜、來(lái)源廣泛，但該酶在中性條件下活性高,而在酸性條件下酶活力很低,一般認(rèn)為這種中性脲酶不適合用于黃酒中尿素的降解[15]。近幾年國(guó)內(nèi)外對(duì)脲酶的固定化研究表明,固定化可以提高脲酶的穩(wěn)定性和利用效率[16-18],但關(guān)于中性脲酶的研究很少。有研究利用固定化中性脲酶處理黃酒,需將黃酒pH調(diào)至4.8以降低其中的尿素含量[19]。但中性脲酶固定化后是否可以在不改變黃酒特性的條件下用于黃酒中尿素的降解,目前鮮有相關(guān)研究報(bào)道。

本研究以市售中性脲酶為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,以酸性脲酶作為對(duì)照,對(duì)游離酶部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析,探究中性脲酶應(yīng)用于黃酒中尿素處理的可行性；并將中性脲酶通過(guò)共價(jià)結(jié)合法進(jìn)行固定化,考察其應(yīng)用于黃酒中尿素降解的效果,為中國(guó)黃酒EC的控制提供一種可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

中性脲酶(來(lái)源于Canavaliaensiformis),Sigma公司；酸性脲酶(來(lái)源于Lactobacillusfermentum),武田藥品工業(yè)株式會(huì)社；黃酒,市售。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

尿素、乳酸、乙醇、乙酸鈉、殼聚糖、海藻酸鈉、高碘酸鈉、三氯乙酸,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；甲醇、乙腈,均為色譜級(jí),北京百靈威科技有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

DK-S34型水浴鍋,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Five Easy Plus型pH計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司；SB25-12DT型超聲波清洗儀,寧波新芝生物科技股份有限公司；HYL-C型搖床,太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Agilent 1260 Infinity型高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 游離酶性質(zhì)測(cè)定

1.2.1.1 pH對(duì)脲酶活力和穩(wěn)定性的影響

最適pH：稱取一定量的中性脲酶和酸性脲酶,分別溶于不同pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)的緩沖液中,其中pH為3.0、4.0、5.0、6.0的緩沖液用0.1 mol/L的檸檬酸和檸檬酸三鈉配制,pH為7.0、8.0的緩沖液用0.1 mol/L的K2HPO4和KH2PO4配制。測(cè)定不同pH下的酶活力,以最高酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。

pH穩(wěn)定性：分別將中性脲酶和酸性脲酶置于pH為3.5、4.0、5.0、6.0、7.0的緩沖液中,室溫放置24 h后測(cè)定酶活力,以初始酶活力為100%,計(jì)算殘余酶活力。

1.2.1.2 溫度對(duì)脲酶活力和穩(wěn)定性的影響

最適溫度：稱取一定量的中性脲酶和酸性脲酶,分別溶于pH為4.0和7.0的緩沖液中,在不同溫度(4、14、30、37、50、60、80 ℃)下測(cè)定酶活力,以最高酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。

溫度穩(wěn)定性：將中性脲酶和酸性脲酶分別溶于pH為7.0和4.0的緩沖液中,置于溫度為4、30、50、80 ℃的環(huán)境中保溫24 h后測(cè)定酶活力,以初始酶活力為100%,計(jì)算殘余酶活力。

1.2.1.3 酒精對(duì)脲酶活力和穩(wěn)定性的影響

酒精對(duì)酶活力的影響：稱取一定量中性脲酶溶于酒精體積分?jǐn)?shù)為0%、8%、12%、16%、20%、24%的pH為7.0的緩沖液中；稱取一定量酸性脲酶溶于酒精體積分?jǐn)?shù)為0%、8%、12%、16%、20%、24%的pH為4.0的緩沖液中,測(cè)定不同酒精體積分?jǐn)?shù)下的酶活力,以最高酶活力為100%,計(jì)算相對(duì)酶活力。

酒精耐受性：分別將中性脲酶和酸性脲酶溶于酒精體積分?jǐn)?shù)為0%、8%、14%、20%、30%的緩沖液中,室溫放置24 h后測(cè)定酶活力,以初始酶活力為100%,計(jì)算殘余酶活力。

1.2.2 固定化酶的制備

制備方法參考文獻(xiàn)[20]。其中殼聚糖質(zhì)量濃度為30 g/L,交聯(lián)劑為自制且無(wú)毒性的氧化海藻酸鈉,交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為1 g/L,交聯(lián)時(shí)間4 h,加酶量0.2 mg/mL,固定化時(shí)間6 h。

1.2.3 游離、固定化中性脲酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定比較

固定化中性脲酶的最適pH、最適溫度以及酒精對(duì)其活力的影響,測(cè)定方法同游離酶。對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定時(shí),為了考察酶在不同時(shí)間的酶活力變化情況,在0～24 h之間取樣測(cè)定。

1.2.4 固定化中性脲酶處理黃酒

1.2.4.1 固定化中性脲酶單批次處理黃酒

在pH為7.0,37 ℃的條件下測(cè)定酶活力,稱取一定量的酶活力為20 U的游離脲酶和固定化脲酶裝入50 mL三角瓶,加入20 mL酒樣,在30 ℃下200 r/min振蕩處理,于2、4、8、12、24 h取濾液測(cè)定尿素含量,計(jì)算尿素去除率。空白對(duì)照為不加酶的固定化載體微球。并對(duì)處理后的黃酒進(jìn)行基本理化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.4.2 固定化中性脲酶的重復(fù)利用

為了考察固定化脲酶的重復(fù)使用性,按上述條件處理黃酒4 h,處理3個(gè)批次,分析不同批次的尿素降解效果及黃酒中基本理化指標(biāo)的變化情況。

1.2.5 測(cè)定分析方法

脲酶酶活力通過(guò)靛酚藍(lán)反應(yīng)比色法[21]測(cè)定。1個(gè)酶活力單位即為1 min水解底物尿素產(chǎn)生1 μmol 氨所需的酶量。黃酒中的尿素含量通過(guò)高效液相色譜法[22]測(cè)定,樣品處理方法和色譜條件參照文獻(xiàn)[23]。黃酒總酸、氨基酸態(tài)氮的測(cè)定方法參照GB/T 13662—2018《黃酒》[24]。還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸比色法進(jìn)行測(cè)定[25]。乙醇含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離中性脲酶和酸性脲酶酶學(xué)性質(zhì)比較

為了研究中性脲酶應(yīng)用于黃酒中尿素處理的可行性,首先對(duì)游離中性脲酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析,并與酸性脲酶進(jìn)行比較。

2.1.1 最適pH及其穩(wěn)定性

脲酶在不同pH 緩沖液中的相對(duì)活力測(cè)定結(jié)果如圖1柱狀圖所示。中性脲酶最適pH為7.0,在pH 3.0時(shí)失活,pH 4.0時(shí)表現(xiàn)出微弱活性。酸性脲酶最適pH為4.0,且在酸性條件下均保留較高酶活力。pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖1折線圖所示。中性脲酶在酸性條件下的穩(wěn)定性較差,pH<5.0時(shí)放置24 h后僅有微弱的酶活力保留；而酸性脲酶在酸性條件下的穩(wěn)定性較好。由于黃酒的pH一般為3.5～4.8[26],因此,脲酶的酸性酶活力及酸穩(wěn)定性是影響其在黃酒中應(yīng)用的主要因素之一,這也是中性脲酶難以在黃酒中應(yīng)用的主要原因。

圖1 游離脲酶最適pH及其穩(wěn)定性Fig.1 Optimal pH and the stability pH in free neutral and acid ureases

2.1.2 最適溫度及其穩(wěn)定性

脲酶在不同溫度下的相對(duì)酶活力測(cè)定結(jié)果如圖2柱狀圖所示。中性脲酶和酸性脲酶的最適作用溫度均為37 ℃左右,中性脲酶在中低溫表現(xiàn)出相對(duì)較高的酶活力。溫度穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖2折線圖所示。中性和酸性脲酶對(duì)溫度的穩(wěn)定性類似,均在低溫下穩(wěn)定性好,隨著溫度的升高,穩(wěn)定性逐漸降低。

圖2 游離脲酶最適溫度及其穩(wěn)定性Fig.2 Optimal temperature and temperature stability of free neutral and acid ureases

2.1.3 酒精對(duì)脲酶活力的影響及其耐受性

黃酒屬于酒精性飲料,酒精體積分?jǐn)?shù)在8%～14%左右,發(fā)酵過(guò)程中甚至更高。本文測(cè)定了不同體積分?jǐn)?shù)酒精對(duì)脲酶活性的影響,測(cè)定結(jié)果如圖3柱狀圖所示。中性脲酶在8%～24%酒精體積分?jǐn)?shù)下均有相對(duì)較高的酶活,其中在酒精體積分?jǐn)?shù)為16%時(shí),酶活力可達(dá)最高酶活性的85%左右,酸性脲酶在不同酒精體積分?jǐn)?shù)下的酶活力變化規(guī)律基本和中性脲酶相同,但酶活力受高酒精濃度的影響更為明顯。酒精耐受性測(cè)定結(jié)果如圖3折線圖所示。中性和酸性脲酶對(duì)酒精的耐受性均較強(qiáng),在酒精溶液中放置24 h后均能保留60%以上的初始酶活力。

圖3 酒精對(duì)游離脲酶活力的影響及其耐受性Fig.3 Effect of alcohol on free neutral and acid ureases activity and their tolerance

綜上所述,對(duì)應(yīng)用于黃酒中的兩大限制條件,即酸性條件和一定含量的酒精,中性脲酶表現(xiàn)出較好的酒精耐受性,但對(duì)于酸性條件較為敏感,限制了中性脲酶在黃酒中的應(yīng)用。改變中性脲酶的應(yīng)用pH活性及穩(wěn)定性才有應(yīng)用于黃酒中的可能。

2.2 固定化中性脲酶酶學(xué)性質(zhì)分析

為改善中性脲酶在黃酒中的應(yīng)用效果,采用較為安全的殼聚糖載體和氧化海藻酸鈉交聯(lián)劑,對(duì)其進(jìn)行固定化,并對(duì)固定化中性脲酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析,通過(guò)與游離中性脲酶進(jìn)行比較,考察其在黃酒中的適用性。

2.2.1 最適pH及其穩(wěn)定性

中性脲酶在不同pH 緩沖液中的相對(duì)活力測(cè)定結(jié)果如圖4-a所示。經(jīng)固定化后,中性脲酶的最適pH由7.0變?yōu)?.0,出現(xiàn)明顯的酸性偏移,在pH 4左右也表現(xiàn)出較高的酶活力,有利于對(duì)黃酒的處理。中性脲酶在不同pH下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如圖4-b所示。相對(duì)于游離酶在pH為3.5時(shí)迅速失活,pH 4.0時(shí)放置2 h后基本失活,固定化酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。在pH 3.5時(shí)放置1.5 h后才基本喪失活性,在pH 4.0時(shí)失活時(shí)間也提高到8 h,耐酸性有顯著提高。在其他pH條件下固定化酶穩(wěn)定性均有顯著提高。

a-最適pH；b-pH穩(wěn)定性圖4 游離和固定化中性脲酶最適pH及其穩(wěn)定性比較Fig.4 Comparison of optimum pH and stability of free and immobilized neutral ureases

2.2.2 最適溫度及其穩(wěn)定性

中性脲酶在不同溫度下的相對(duì)活力測(cè)定結(jié)果如圖5-a所示。經(jīng)固定化后,脲酶的最適溫度由37 ℃提高到50 ℃。脲酶在不同溫度下的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)如圖5-b所示。固定化酶與游離酶的溫度穩(wěn)定性基本類似,在不同溫度下,固定化酶穩(wěn)定性略強(qiáng)于游離酶。在高溫條件下(80 ℃),游離酶和固定化酶均在4 h后基本失活。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性圖5 游離和固定化中性脲酶最適溫度及其穩(wěn)定性比較Fig.5 Comparison of optimum temperature and stability of free and immobilized neutral ureases

2.2.3 酒精對(duì)脲酶活力的影響及其耐受性

中性脲酶對(duì)酒精的耐受性測(cè)定結(jié)果如圖6-a所示。游離中性脲酶本身有較好的酒精耐受性,固定化后基本保持了較好的酒精耐受性,其中在酒精體積分?jǐn)?shù)為16%的條件下活性是最高酶活力的80%左右,與游離酶相差不大。脲酶在不同酒精體積分?jǐn)?shù)下的穩(wěn)定性結(jié)果如圖6-b所示。游離酶在較寬的酒精體積分?jǐn)?shù)范圍(0%～30%)內(nèi)的穩(wěn)定性變化基本相同,放置24 h后均可保留69%以上酶活力。固定化酶在酒精體積分?jǐn)?shù)為8%、14%、20%的穩(wěn)定性高,24 h后均能保留80%左右的初始酶活力。在30%的酒精體積分?jǐn)?shù)下穩(wěn)定性要差一些,但24 h后依然能保留60%左右的初始酶活力。相對(duì)而言,固定化酶對(duì)酒精的穩(wěn)定性又有一定的改善。

a-酒精對(duì)酶活力的影響；b-酒精耐受力圖6 不同體積分?jǐn)?shù)酒精對(duì)游離和固定化中性脲酶活力及其耐受性的影響Fig.6 Effect of alcohol on the activity and tolerance of free and immobilized neutral ureases

2.3 固定化中性脲酶處理黃酒

將固定化中性脲酶處理尿素含量較高(24.86 mg/L)的黃酒,其尿素的降解結(jié)果如圖7所示。固定化酶處理黃酒4 h,尿素降解較快,降解率超過(guò)60%；處理24 h后,黃酒中尿素含量低于1 mg/L,降低了98.15%。而在相同加酶量的條件下,游離酶對(duì)黃酒中尿素基本沒(méi)有降解作用。固定化載體(空白微球)在該處理?xiàng)l件下對(duì)黃酒中尿素含量的影響也很小(<10%),因此,固定化中性脲酶降解黃酒中尿素的作用效果比較顯著。

圖7 固定化中性脲酶處理黃酒Fig.7 Treatment of Huangjiu with immobilized neutral urease注：酒樣pH 3.90,尿素初始質(zhì)量濃度24.86 mg/L

同時(shí),對(duì)上述處理過(guò)的黃酒主要理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果如表1所示。固定化中性脲酶處理對(duì)黃酒中還原糖、氨基酸態(tài)氮和酒精含量的影響不大(變化率在10%左右),這些指標(biāo)略有下降主要是因?yàn)楣潭ɑ割w粒有較高含水量(93.08%),對(duì)酒樣有一定的稀釋作用。總酸下降率稍高,除稀釋作用外,微球本身偏中性的pH環(huán)境也對(duì)總酸含量變化有一定影響。但總體來(lái)說(shuō),經(jīng)固定化酶處理后黃酒的各項(xiàng)基本理化指標(biāo)均符合黃酒國(guó)標(biāo)要求。

表1 固定化中性脲酶處理對(duì)黃酒主要理化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of treatment with immobilized neutral urease on the primary parameters of Huangjiu

進(jìn)一步將固定化酶重復(fù)利用多批次處理黃酒,每批處理時(shí)間為4 h,考察其對(duì)黃酒中尿素降解的效果。處理后酒樣中尿素及主要理化指標(biāo)的變化情況如表1所示。重復(fù)利用固定化中性脲酶,第1次處理黃酒,尿素降解率可達(dá)60%左右；第2次處理,尿素降解率降低至不足40%；第3次使用該固定化酶,基本無(wú)尿素降解,這主要是由于固定化中性脲酶長(zhǎng)時(shí)間處于黃酒的酸性環(huán)境中,對(duì)酶活力有嚴(yán)重影響,降低了其催化效率。黃酒主要理化指標(biāo),除第1次處理由于固定化酶中殘留的緩沖體系對(duì)酒樣有一定的影響外,后續(xù)2批酒樣主要理化指標(biāo)沒(méi)有明顯變化(基本在5%以內(nèi))。這些結(jié)果表明,固定化中性脲酶可用于黃酒中尿素的降解,但酶的使用效率受到了其穩(wěn)定性的影響。

通過(guò)進(jìn)一步提高固定化酶的pH穩(wěn)定性,并結(jié)合填充柱連續(xù)處理黃酒,縮短處理時(shí)間,有可能在降低黃酒中尿素的工業(yè)應(yīng)用中得到較好的效果,相關(guān)研究還需進(jìn)一步開(kāi)展。

3 結(jié)論

本研究主要考察了來(lái)源于植物的市售中性脲酶及其固定化酶應(yīng)用于黃酒中降解尿素的可行性。研究結(jié)果表明,與酸性脲酶相比,游離中性脲酶的一些性質(zhì),如溫度和耐酒精特性都較為相似,但耐酸特性相對(duì)較差,限制了其在黃酒中的應(yīng)用。將中性脲酶以殼聚糖為載體進(jìn)行固定化后,脲酶的耐酸特性有了顯著改善,有應(yīng)用于黃酒中的可能性。將此固定化中性脲酶處理黃酒,處理24 h后基本可降解95%以上的尿素。該固定化中性脲酶不僅安全有效,且處理黃酒易于和酒液分離,便于應(yīng)用。重復(fù)利用固定化酶也有一定的效果,但酶的穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步提高。本研究結(jié)果為酶法降解黃酒中的尿素提供了一種現(xiàn)實(shí)可行的方法。