脲酶菌的篩選及其對(duì)垃圾焚燒飛灰的固化

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(浙江理工大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.土木工程與建筑學(xué)院，杭州 310018)

0 引 言

垃圾焚燒是當(dāng)前城市垃圾處置的重要方式。近年來(lái)，我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)興建生活垃圾焚燒廠的量逐年遞增，2015年底全國(guó)生活垃圾焚燒廠多達(dá)267座，日焚燒垃圾21.90萬(wàn)噸以上，且年焚燒垃圾量以10%的速度增長(zhǎng)[1]?；以巧罾贌谋厝划a(chǎn)物，其中包括焚燒爐中產(chǎn)生的底灰和煙氣凈化系統(tǒng)中收集得到的飛灰，底灰的比重約為20.00%～30.00%，飛灰比重約為3.00%～5.00%[2]。大量研究結(jié)果表明，飛灰中易富集Zn、Pb、Hg、Cu、Cr、Cd和Ni等重金屬，飛灰內(nèi)Zn、Pb、Cu、Cr、Cd和Ni含量一般占飛灰干重的0.41%～1.93%、0.14%～0.57%、0.04%～0.11%、0.02%～0.04%、0.01%～0.04%和0.01%～0.02%[3-6]。

本文目的是研究脲酶菌對(duì)焚燒飛灰內(nèi)重金屬的固化效果。從丹參根際土壤中篩選獲得兩株脲酶菌UR-F51和UR-121，對(duì)固化飛灰的無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度和顆粒級(jí)配進(jìn)行測(cè)定，從而評(píng)估脲酶菌UR-F51和UR-121對(duì)飛灰的固化能力；對(duì)固化后飛灰的重金屬浸出濃度進(jìn)行了測(cè)試，從而評(píng)估微生物誘導(dǎo)碳酸鹽沉積處理后飛灰內(nèi)重金屬的穩(wěn)定能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

KH2PO42.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，Na2Ac 2.00 g/L，尿素20.00 g/L，瓊脂20.00 g/L，酚紅(終濃度為0.01 g/L)。

富集培養(yǎng)基：酵母提取物20.00 g/L，(NH4)2SO410.00 g/L。

篩選培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g/L，蛋白胨2.00 g/L，牛肉膏10.00 g/L，酵母膏3.00 g/L，所用試劑純度皆為分析純。城市垃圾焚燒飛灰來(lái)源于杭州市蕭山區(qū)錦江綠色有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脲酶菌的篩選與鑒定

脲酶菌的篩選：稱(chēng)取土壤5.00 g，按10%的接種量與無(wú)菌水混合，制成懸浮液。對(duì)懸浮液進(jìn)行倍比稀釋后，分別吸取100 μL的1×10-5、1×10-6倍和1×10-7倍稀釋液，均勻涂布于固體篩選培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，30 ℃恒溫培養(yǎng)，定期觀察。然后，挑取使固體篩選培養(yǎng)基顏色變紅的不同菌株，在固體篩選培養(yǎng)基上劃線純化培養(yǎng)，30 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h觀察。以尿素為底物，進(jìn)行脲酶活性測(cè)定，具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。挑選脲酶活性較高的菌株進(jìn)行飛灰固化實(shí)驗(yàn)。

脲酶菌分子鑒定：對(duì)篩選獲得的高效脲酶菌進(jìn)行16S rDNA分子鑒定。采用通用引物27 F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492 R(GGTTACCTTGTTACGACTT)對(duì)脲酶菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與Ezbiocloud庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)，利用MEGA 5.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從而分析脲酶菌的進(jìn)化地位。

1.2.2 脲酶菌固化飛灰

1.2.2.1 脲酶菌固化飛灰過(guò)程

將垃圾焚燒飛灰于105 ℃烘箱內(nèi)干燥24 h；脲酶菌UR-F51和UR-121在30 ℃、220 r/min搖床內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)48 h。將垃圾焚燒飛灰與尿素和菌液按1.00 kg：0.027 kg：300.00 mL的比例進(jìn)行充分混合，稱(chēng)取上述混合物120.00 g，分三次均勻填充于內(nèi)徑36 mm、高80 mm的模具內(nèi)，后置于溫度為20 ℃、濕度為95%的養(yǎng)護(hù)箱內(nèi)養(yǎng)護(hù)，24 h后開(kāi)模，并繼續(xù)在養(yǎng)護(hù)箱內(nèi)養(yǎng)護(hù)6 d。以水處理后的飛灰樣品為對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2.2 固化飛灰的檢測(cè)

無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度：利用萬(wàn)能伺服試驗(yàn)機(jī)(CMT4000)對(duì)養(yǎng)護(hù)7 d后的模型進(jìn)行無(wú)側(cè)限抗壓試驗(yàn)。試驗(yàn)機(jī)壓力計(jì)量程為30 kN，精度為1 N，加載速率為2 mm/min。

固化顆粒級(jí)配：取無(wú)側(cè)限抗壓實(shí)驗(yàn)后飛灰樣品，在105 ℃的烘箱內(nèi)烘干24 h，用橡膠槌研碎，按《土工試驗(yàn)規(guī)程》(SL237—1999)，采用篩分法和甲種密度計(jì)法聯(lián)合測(cè)定顆粒級(jí)配，并繪制曲線，顆粒級(jí)配的數(shù)據(jù)處理和分析方法見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

重金屬的固化率：取無(wú)側(cè)限抗壓實(shí)驗(yàn)后樣品，在105 ℃的烘箱內(nèi)烘干24 h，用橡膠槌研碎，按《固體廢物浸出毒性浸出方法-水平振蕩法》(HJ 557—2009)，對(duì)脲酶菌固化后飛灰進(jìn)行重金屬毒性浸出，并利用ICP-MS技術(shù)對(duì)脲酶菌固化后飛灰重金屬浸出濃度進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算固化飛灰的重金屬固化率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 脲酶菌篩選與鑒定

2.1.1 脲酶活性測(cè)定

從土壤內(nèi)篩選獲得2株生長(zhǎng)較快的脲酶菌，分別命名為UR-F51和UR-121。對(duì)2株脲酶菌進(jìn)行脲酶活性定量檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，菌株UR-F51和UR-121的脲酶活性分別為14.91 mmol/L和10.19 mmol/L，且菌株UR-F51脲酶活性是UR-121的1.5倍。

表1 脲酶菌UR-F51和UR-121脲酶活性

2.1.2 脲酶菌16S rDNA分子鑒定

對(duì)篩選獲得的高效脲酶菌進(jìn)行16S rDNA分子鑒定，并將脲酶菌測(cè)序結(jié)果與Ezbiocloud庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，脲酶菌UR-121和UR-F51的分子鑒定與Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，如表2。表2顯示：菌株UR-F51與Bacillusaryabhattai、UR-121與Pseudomonastaiwanensis相似度均為99%以上。利用軟件MEGA 5.0，建立脲酶菌UR-121和UR-F51的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖1。圖1中可見(jiàn)，菌株UR-F51與Bacillusaryabhattai、菌株UR-121與Pseudomonastaiwanensis各自聚為一簇，因此菌株UR-F51為Bacillusaryabhattai，菌株UR-121為Pseudomonastaiwanensis。

表2 脲酶菌UR-121和UR-F51的分子鑒定與Ezbiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建脲酶菌UR-F51和UR-121的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 脲酶菌固化飛灰

利用脲酶菌UR-F51和UR-121分別固化垃圾焚燒飛灰，繼而測(cè)定脲酶菌固化后飛灰的各項(xiàng)指標(biāo)，即無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度、飛灰顆粒級(jí)配、飛灰顆粒SEM檢測(cè)和重金屬固化率。

2.2.1 無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度

脲酶菌固化后飛灰樣品在養(yǎng)護(hù)箱內(nèi)養(yǎng)護(hù)7 d，然后測(cè)定其無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度。脲酶菌UR-F51和UR-121的無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，脲酶活性與抗壓強(qiáng)度呈正相關(guān)，脲酶活性較高的UR-F51，其無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度相對(duì)其他處理組偏高；UR-F51和UR-121處理組的抗壓強(qiáng)度分別為0.42 MPa和0.36 MPa，與對(duì)照組相比，分別提高48.46%和27.39%。以上結(jié)果表明，脲酶菌固化后飛灰的無(wú)側(cè)限抗壓強(qiáng)度明顯得到提高，且與脲酶活性呈一定的正相關(guān)。

圖2 脲酶菌UR-121和UR-F51固化后的飛灰抗壓強(qiáng)度

2.2.2 固化飛灰顆粒級(jí)配

采用篩分法和甲種密度計(jì)法聯(lián)合測(cè)定固化后飛灰的顆粒級(jí)配，并繪制顆粒級(jí)配曲線，脲酶菌UR-121和UR-F51固化后的飛灰顆分級(jí)配曲線，如圖3。結(jié)果顯示：脲酶菌固化飛灰的顆粒直徑在0.00～1.00 mm之間；粒徑小于0.01 mm時(shí)，處理組間無(wú)明顯差異，且所有固化后的飛灰所占的百分含量均約為10%；粒徑在0.03～0.90 mm之間時(shí)，處理組間差異顯著，與對(duì)照相比，菌株UR-F51和UR-121處理組所占百分含量顯著增偏高，且處理組UR-F51所占百分含量顯著高于UR-121。以上結(jié)果表明：脲酶菌固化后飛灰的顆粒粒徑顯著變大，且處理組UR-F51的顆分粒徑最大，與脲酶菌UR-F51和UR-121固化飛灰后的掃描電鏡(圖4)結(jié)果一致。

圖3 脲酶菌UR-121和UR-F51固化后的飛灰顆分級(jí)配曲線

圖4 脲酶菌UR-121和UR-F51固化后飛灰SEM圖

2.3.3 固化飛灰的重金屬固化率

脲酶菌UR-121和UR-F51固化飛灰后的重金屬浸出濃度結(jié)果如表3所示。由表3可知，Cu和Cr的浸出濃度顯著高于Ni、Cd、Hg和Pb。菌株UR-F51和UR-121處理組的Cr、Ni、Cu、Cd和Pb浸出濃度顯著低于對(duì)照，表明2株脲酶菌顯著促進(jìn)飛灰中重金屬的固化作用。菌株UR-F51和UR-121處理組固化后飛灰內(nèi)Cu的浸出濃度分別為0.58 μg/L和132.70 μg/L，固化率分別為99.73%和37.17%；Ni浸出濃度分別為0.09 μg/L和0.55 μg/L，固化率分別為90.43%和41.49%；Cr浸出濃度分別為2.63 μg/L和3.55 μg/L，固化率分別為37.23%和15.27%。以上結(jié)果證實(shí)菌株UR-F51對(duì)飛灰重金屬的固化效果最佳。

3 討 論

本文從土壤中分離出2株脲酶菌BacillusaryabhattaiUR-F51和PseudomonastaiwanensisUR-121，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)2株脲酶菌均能增強(qiáng)飛灰的固化作用，其中菌株BacillusaryabhattaiUR-F51對(duì)飛灰及其重金屬的固化效果最好，在飛灰處理中具有一定的應(yīng)用潛力。影響飛灰及其重金屬的因素有很多，如脲酶菌脲酶活性、環(huán)境pH值、脲酶菌代謝產(chǎn)物和飛灰顆粒大小等[8]。

表3 脲酶菌UR-121和UR-F51固化飛灰后的重金屬浸出濃度

注：利用spss軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，表內(nèi)凡有一個(gè)相同標(biāo)記字母的即為差異不顯著,凡具不同標(biāo)記字母的即為差異顯著。

4 結(jié) 論

飛灰富含重金屬等有毒有害物質(zhì)，對(duì)人類(lèi)的健康造成極大的威脅。許多研究表明，脲酶菌的應(yīng)用可以緩解城市生活垃圾焚燒飛灰污染。本文通過(guò)篩選脲酶菌，并探索脲酶菌生物固化焚燒飛灰的效果，結(jié)論如下：

a) 本文從土壤內(nèi)分離獲得2株高效脲酶菌BacillusaryabhattaiUR-F51和PseudomonastaiwanensisUR-121。

b) 2株脲酶菌均能增強(qiáng)飛灰的固化作用，其中菌株BacillusaryabhattaiUR-F51對(duì)飛灰及其重金屬的固化效果最好，在飛灰處理中具有一定的應(yīng)用潛力。