陽離子交換固相萃取結合LCMS-IT-TOF 的中風回語顆?；瘜W成分分析

張 君，霍志鵬，張依倩，王 玉，4，何 毅*

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617； 2.天士力控股集團有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津 300410； 3.天士力醫(yī)藥集團股份有限公司創(chuàng)新中藥關鍵技術國家重點實驗室，天津 300410； 4.天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072）

中風回語顆粒用于治療缺血性腦中風引起的痰瘀阻絡癥，源自國醫(yī)大師任繼學教授多年臨床經驗，由石菖蒲、酒大黃、膽南星、冰片、黃連、遠志、川芎、郁金、土鱉蟲九味中藥組成［1］，具清熱化痰、活血通絡、開竅之功效，其散劑作為長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院的院內制劑已在臨床應用十余年［2］?，F(xiàn)代藥理學研究表明，中風回語顆粒具有抗氧化、抗炎、減輕腦水腫、抗凝血等作用［2-4］。目前已獲得臨床批件，處于臨床Ⅱ期研究階段，其相關質量標準由方中黃連、遠志、酒大黃、冰片的鑒別及鹽酸小檗堿的含量測定組成，但針對中風回語顆粒的物質基礎尚無全面系統(tǒng)研究。

液質聯(lián)用（LC-MS）技術具有靈敏度高、分辨率高、特異性強等特點，廣泛用于中藥材及中成藥的定性分析。中風回語顆粒由九味中藥組成，基質復雜，含量不均一，黃連藥材的生物堿類成分在該制劑中含量較高，在LC-MS 鑒定中，生物堿類成分峰響應值偏高，導致其他成分響應差，檢出成分數(shù)量偏少。因此，去除或減少樣品中含量多的成分，可減少共出峰物對離子的抑制作用，增加峰容量，以提高色譜分辨率。固相萃取是對樣品成分富集的有效方式，具有較高的選擇性，本研究在中風回語顆粒提取物的基礎上，采用PCX-SPE 分離富集，截留生物堿類成分，結合LCMS-IT-TOF 技術對提取物及分離富集物峰指認及信息歸屬，對比分析固相萃取前后成分變化，以期為含黃連復方中藥的LC-MS 成分鑒定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LCMS-IT-TOF 型液相色譜-離子阱-飛行時間質譜儀（日本島津公司，包括自動進樣器、二元梯度泵、柱溫箱和PDA 檢測器）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；KQ-500DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；XS205DU 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；旋轉蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI有限公司）；PCX-SPE 柱（500 mg/6 ml，Agela 科技）。

1.2 試藥 中風回語顆粒（批號20190301，天士力研究院自制）；石菖蒲（批號20190101）、郁金（批號20190102）、遠志（批號 20190501）、黃連（批號20190103）均購自安徽省永香中藥飲片有限公司；酒大黃（批號20190201）購自河北藺氏盛泰；川芎（批號1810001）天士力現(xiàn)代中藥資源公司提供；土鱉蟲（批號20190402）購自安徽賀林；膽南星（批號20190101）購自四川輔正藥業(yè)股份有限公司，藥材均經過天士力研究院霍志鵬中級工程師鑒定和天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司檢測，均符合2015 年版《中國藥典》一部項下要求。碘化木蘭花堿對照品（批號10112703）購自天津一方科技有限公司；黃連堿對照品（批號MUST-12111602）購自成都曼思特生物技術有限公司；鹽酸藥根堿對照品（批號110733-201007）、鹽酸巴馬汀對照品（批號110732-200506）、鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201814）、大黃酸對照品（批號 110757-201607）、蘆薈大黃素對照品（批號 110795-200806）、大黃素對照品（批號110756-201913）、大黃酚對照品（批號110796-201922）、大黃素甲醚對照品（批號110758-201415）、細葉遠志皂苷對照品（批號111849-201705）、3，6′-二芥子酰基蔗糖對照品（批號 111848-201303）、遠志酮 Ⅲ對照品（批號111850-201705）、歐當歸內酯A 對照品（批號111826-201806）均購自中國食品藥品檢定研究院；β-細辛醚對照品（天士力研究院自制），α-細辛醚對照品（批號L1913066）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙腈（質譜純，德國默克公司）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；冰乙酸（色譜純，天津市風船化學試劑科技有限公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 取中風回語顆粒，研細，稱取約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲提取 30 min（功率 250 W，頻率 40 kHz），冷卻至室溫，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液Ⅰ。依次用5 ml 甲醇和5 ml 水活化PCX-SPE 柱，準確移取10 ml 供試品溶液Ⅰ上柱，收集流出液，依次用水、50%甲醇水、甲醇各5 ml 淋洗PCX-SPE 柱，收集各淋洗液，流出液與各淋洗液合并，濃縮至干，用1 ml 甲醇復溶，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，作為供試品溶液Ⅱ。

2.2 單味藥材溶液的制備 取石菖蒲、郁金、川芎、黃連、酒大黃、遠志、土鱉蟲、膽南星各藥材粉碎，稱取適量，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，冷卻至室溫，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，為各單味藥材溶液。

2.3 對照品溶液的制備 取碘化木蘭花堿、鹽酸藥根堿、黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量，加入10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液Ⅰ。取大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、細葉遠志皂苷、3，6′-二芥子?；崽?、遠志酮 Ⅲ、歐當歸內酯 A、β-細辛醚、α-細辛醚對照品適量，加入10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液Ⅱ。

2.4 色譜條件 Dimonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相 A 為 20.02 mmol/L 乙酸銨-0.5%乙酸水溶液，流動相B 為乙腈，按照表1 中的規(guī)定進行梯度洗脫，柱溫 30 ℃，流速 1 ml/min，進樣量 10 μl。

2.5 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正負離子分別檢測，掃描范圍為m/z 100～1000，采用三氟醋酸鈉作為校正液，檢測電壓1.7 kV，霧化氣體積流量1.5 L/min，曲型脫溶劑裝置（CDL）溫度200 ℃，離子累積時間50 ms，毛細管電壓-3.5 kV（負離子），4.5 kV（正離子），誘導碰撞解離能（CID）50%，柱后分流，分流比 1∶3。

表1 梯度洗脫程序

3 結果與分析

3.1 鑒定結果 根據(jù)化合物準確分子質量及碎片離子信息，對照品比對，并結合國內外相關文獻與數(shù)據(jù)庫比對，對中風回語顆粒供試品溶液Ⅰ與Ⅱ進行分析，分別鑒定出33 和71 個化學成分，其中11 個化學成分包括蔗糖、沒食子酸、阿魏?；鼘幩岙悩嬻w、西伯利亞遠志糖A6、羧基大黃酚-O-葡萄糖苷、遠志酮 Ⅲ、蟲漆酸D、大黃素-8-O-葡萄糖苷/大黃素-1-O-葡萄糖苷、小檗堿、大黃素、Magnosalicin 是兩種提取方式共同鑒定的，如圖1 所示。中風回語顆粒供試品溶液Ⅰ與Ⅱ的正負離子模式下總離子流圖分別見圖2 與圖3。各化合物通過藥材圖譜與文獻及數(shù)據(jù)庫對照進行了歸屬確認。鑒定結果見表2 和表3。

圖1 中風回語顆粒供試品溶液Ⅰ與Ⅱ化學成分分析的韋恩圖

3.2 生物堿類成分 中風回語顆粒中生物堿類成分較多，共鑒定出23 個生物堿成分，主要來自于黃連，其裂解方式主要是母核一般不會裂解，僅有小分子取代基的裂解與丟失。

圖2 中化合物11 保留時間為15.78 min，正離子模式下檢測到分子離子峰為342.168 9［M］+，丟失C2H7N形成 m/z 297［M-C2H7N］+，然后脫去甲基形成 m/z 282［M-C2H7N-CH3］+，脫羥基形成 m/z 265［M-C2H7NCH3-OH］+，進一步脫去羰基形成 m/z 237［M-C2H7NCH3-OH-CO］+，根據(jù)文獻［26］報道鑒定此化合物為木蘭花堿。

圖3 中風回語顆粒供試品溶液Ⅱ正離子模式（C）和負離子模式（D）的總離子流

圖2 中化合物29 保留時間為29.12 min，正離子模式下檢測到分子離子峰為m/z 336.120 9［M］+，脫甲基形成 m/z 321［M-CH3］+、320［M-CH3-H］+碎片離子，側鏈環(huán)合成五元含氧雜環(huán)，進一步脫去CO，形成m/z 293［M-CH3-CO］+、292［M-CH3-H-CO］+碎片，裂解規(guī)律如圖4 所示，根據(jù)對照品比對和文獻［26］報道鑒定此化合物為小檗堿。

3.3 蒽醌類成分 從中風回語顆粒中鑒定了14 個蒽醌類成分，以游離或者苷類形式存在，蒽醌類化合物來自于酒大黃。結合型蒽醌在電噴霧電離下容易失去糖基離子，游離型蒽醌在高能碰撞下易脫去CO、CO2、CH3等碎片離子。

表2 中風回語顆粒供試品溶液Ⅰ化學成分分析

續(xù)表2 中風回語顆粒供試品溶液Ⅰ化學成分分析

圖3 中化合物39 的保留時間為28.51 min，正離子模式下檢測到分子離子峰為m/z 439.098 0［M+Na］+，脫去一分子葡萄糖形成255［M+H-Glc］+的碎片離子，負離子模式下檢測到分子離子峰為415.103 7［M-H］-，脫去一分子葡萄糖，形成253［M-H-Glc］-的碎片離子，參照文獻［7］裂解規(guī)律鑒定此化合物為大黃酚-O-葡萄糖苷。

圖3 中化合物58 為的保留時間為48.41 min，負離子模式下檢測到分子離子峰為m/z 269.046 8［M-H］-，脫去一分子CO，形成241［M-H-CO］-的碎片離子，脫去一分子 CO2形成 225［M-H-CO2］-，相繼脫去一分子甲基形成210［M-H-CO2-CH3］-的碎片離子，裂解規(guī)律如圖5 所示，根據(jù)對照品比對和文獻［7］報道鑒定此化合物為大黃素。

圖4 小檗堿裂解途徑

圖5 大黃素裂解途徑

表3 中風回語顆粒供試品溶液Ⅱ化學成分分析

續(xù)表3 中風回語顆粒供試品溶液Ⅱ化學成分分析

續(xù)表3 中風回語顆粒供試品溶液Ⅱ化學成分分析

3.4 糖酯類成分 中風回語顆粒所含的藥材遠志中含有遠志糖酯類化學成分，從中鑒定了6 個糖酯類化合物，該類成分主要發(fā)生糖苷鍵裂解或芥子?；鶃G失。

圖2 中化合物6 的保留時間為11.68 min，分子離子峰為m/z 571.163 9［M+Na］+，脫去一分子葡萄糖與水形成 m/z 369［M+H-C6H10O5-H2O］+的碎片離子，根據(jù)文獻［8］報道推測出該化合物為西伯利亞遠志糖A6。

圖3 中化合物27 的保留時間為20.81 min，在負離子模式下檢測到分子離子峰m/z 681.201 8［M-H］-，相繼脫去一個芥子?；⒓谆c羥基形成m/z 443［MH-sinapoyl-CH3-OH］-，根據(jù)文獻［8］報道鑒定此化合物為遠志蔗糖酯A。

3.5 酮類成分 從中風回語顆粒中鑒定出8 個酮類成分，其中酮類成分主要來自于遠志，該類成分在正離子模式下二級碎片離子中常出現(xiàn)419、317、287 等碎片離子。

圖3 中化合物15 的保留時間為16.53 min，正離子模式下檢測到m/z 569.151 9［M+H］+，二級質譜中出現(xiàn)m/z 419［M+H-C5H10O5］+、401［M+H-C5H10O5-H2O］+、383［M+H-C5H10O5-H2O-H2O］+、317［M+H-C5H7O4-C7H4O2］+，287［M+H-C5H7O4-C7H4O2-CH2O］+等碎片離子。負離子模式下檢測到m/z 567.135 5［M-H］-，二級碎片含有m/z 345［M-H-Api-C3H4O2］-、315［M-H-Api-C4H6O3］-，裂解規(guī)律如圖6 所示，根據(jù)對照品比對及文獻報道［8］鑒定此化合物為遠志酮Ⅲ。

圖6 遠志口山酮 Ⅲ裂解途徑

3.6 內酯類成分 從中風回語顆粒中鑒定出12 個內酯類成分，主要來自于川芎。此類成分在正離子模式下響應較好。

圖3 中化合物65 的保留時間為53.63 min，正離子模式下檢測到分子離子峰m/z 209.115 6［M+H］+，推測其分子式為C12H16O3，脫去一分子甲基形成m/z 194［M+H-CH3］+，脫去一分子 CO 形成 m/z 181［M+H-CO］+，脫去一分子 C4H8與 H2O 形成 m/z 135［M+H-H2O-C4H8］+的碎片，因此推測此化合物為洋川芎內酯K。

圖3 中化合物64、69 在正離子模式下檢測到分子離子峰 m/z 398.23［M+NH4］+、381.21［M+H］+，二級質譜中均出現(xiàn) m/z 191［C15H12O2］+的碎片離子，根據(jù)文獻［13］報道和對照品比對推測出化合物64 和69 分別為雙藁本內酯和歐當歸內酯A，歐當歸內酯A 的裂解途徑如圖7 所示。

圖7 歐當歸內酯A 裂解途徑

3.7 苯丙素類成分 從中風回語顆粒中共鑒定出20個苯丙素類成分，包括簡單苯丙素類與木脂素類成分。

木脂素類成分：圖3 中化合物12 的保留時間為14.30 min，在正離子模式下檢測到m/z 540.245 3［M+NH4］+、545.191 6［M+Na］+，在電噴霧電離下形成 m/z 219［M+H-Glc-C7H10O3］+的碎片離子，負離子模式下檢測到m/z 521.191 6［M-H］-，脫去一分子的葡萄糖形成 m/z 359［M-H-Glc］-，之后脫去 CH3形成 m/z 344［M-H-Glc-CH3］-的碎片離子。根據(jù)文獻［7］報道鑒定此化合物為Isolarisiresinol-O-glucoside/Lariciresinol-O-glucoside。

圖3 中化合物66 的保留時間為54.59 min，在正離子模式下檢測到 m/z 434.254 8［M+NH4］+、417.238 6［M+H］+，在電噴霧電離下形成 m/z 249［M+H-C9H12O3］+、209［C12H17O3］+、181［C10H13O3］+的碎片離子。裂解規(guī)律如圖8所示，根據(jù)文獻［12］報道鑒定此化合物為Diasarone I，此化合物來自于石菖蒲。

圖8 Diasarone I 裂解途徑

簡單苯丙素類成分：圖2 中的化合物5、7、8 在負離子模式下均檢測到分子離子峰m/z 367.10［M-H］-，推測其結構式為C17H20O9，二級碎片離子中檢測到m/z 193［ferulic acid-H］-、161［ferulic acid-H-OH-CH3］-、133［ferulic acid-H-CH3-COOH-H］-等碎片離子，根據(jù)文獻報道［6，13］鑒定化合物為阿魏酰奎寧酸及其異構體。

此外本研究還鑒定出4 個鞣質類、1 個三萜皂苷類、1 個糖類、1 個膽酸類、3 個其他類成分。

4 討論

本實驗對色譜條件進行了優(yōu)化，首先采用水-乙腈、0.05%甲酸水-乙腈為流動相，梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)黃連生物堿色譜峰分離度較差，改用離子對試劑20.02 mmol/L乙酸銨-0.5%乙酸水溶液作為A 相流動相，乙腈為B相流動相，各色譜峰分離度理想［11］。前期研究發(fā)現(xiàn)中風回語顆粒中所含的部分生物堿類成分濃度過大，殘留于質譜系統(tǒng)，導致部分成分難以檢測。因此中風回語顆粒樣品前處理時采用PCX-SPE 柱對提取液分離富集。

本研究首次采用甲醇提取與PCX-SPE 結合LCMS-IT-TOF 的方法系統(tǒng)地分析了中風回語顆粒所含的化學成分，共鑒定出93 個化學成分，主要有生物堿類、苯丙素類、蒽醌類、酮類、糖酯類等成分，生物堿類成分大多數(shù)來自于黃連；蒽醌類成分來自于酒大黃；酮類、糖酯類成分來自于遠志。據(jù)文獻［5，14，16］報道，這些成分具有抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等藥理作用，對缺血性腦中風具有明顯的改善作用。這為中風回語顆粒化學成分的定性分析提供了一種快速、高效的分析方法，豐富了該復方的化學成分信息，并為中風回語顆粒活性成分篩選、作用機制探討、質量控制研究及安全性評價提供了物質基礎支持。同時，此思路對中藥材及中成藥復雜體系的化學成分解析提供了一種方法參考，多種分離技術和LC-MS 技術的結合將有助于進一步擴展LC-MS 方法的鑒別容量與應用范圍。