響應(yīng)曲面優(yōu)化提取半枝蓮中總黃酮及清除DPPH 自由基作用的研究

李可同，李棣華，呂沅珊，劉俊紅

（1.天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300222； 2.天津市南開醫(yī)院，天津 300100）

中藥半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don）的干燥全草，主要在江蘇、浙江、四川、廣西等地分布，其味辛、苦，有清熱解毒、止血、利尿的作用。半枝蓮中黃酮類化合物［1］為其主要成分，還含有揮發(fā)性成分、多糖類和萜類化合物，黃酮類化合物具有降血壓、調(diào)血脂、抗氧化的作用［2］，其在抗腫瘤方面也有很多報(bào)道［3-5］，臨床上常和其他清熱解毒類藥物配伍來(lái)治療和緩解肝癌［6］、直腸癌［7］等病情，在近年還研究其可抑制人肺腺癌A549 細(xì)胞的遷移［8］，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是腫瘤病人死亡的主要原因，此研究對(duì)半枝蓮總黃酮在癌癥方面的治療提供了更多參考。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)［9-10］，主要采用正交試驗(yàn)的方法來(lái)確定半枝蓮中黃酮類化合物的最佳提取方案，雖然正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)可考慮幾種因素找出最佳水平組合，但其不能在整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，無(wú)法在整個(gè)區(qū)域內(nèi)的找到最佳值，所以本試驗(yàn)通過Box-Behnken 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)的方法［11-12］考查乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、液料比等因素與總黃酮得率的關(guān)系，優(yōu)化篩選半枝蓮中總黃酮的最佳提取工藝，同時(shí)進(jìn)行總黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率的測(cè)定，初步評(píng)估其抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

1.1.1 藥材 半枝蓮生藥，購(gòu)于安國(guó)市弘發(fā)中藥材飲片有限公司，產(chǎn)地：江蘇，生產(chǎn)批號(hào)131201，粉碎后裝密封袋。

1.1.2 主要試劑 乙醇為市售分析純；甲醇為色譜純，天津康科德科技有限公司；野黃芩苷對(duì)照品，批號(hào)110842-201207，中國(guó)食品藥品鑒定研究院；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH 自由基），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；抗壞血酸，批號(hào)（津）XK13-011-00022，天津市化學(xué)試劑供銷公司。

1.1.3 儀器 高速多功能粉碎機(jī)XY-500A 型，浙江省永康市松青五金工具廠；水浴鍋，天津三水科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)型號(hào)為U2800，日本日立高科技公司。

1.2 總黃酮的提取及含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取粉碎后的半枝蓮粉末10 g，加入一定體積的乙醇，回流提取1 h，量取體積，搖勻，備用。用紫外分光光度計(jì)在335 nm 處測(cè)定半枝蓮中總黃酮含量。準(zhǔn)確稱取野黃芩苷對(duì)照品2.4 mg 用甲醇溶解并定容至10 ml，取其中2.5 ml 至量瓶，繼續(xù)加甲醇定容至25 ml，從中分別吸取0.5、1、2、3、4 和 5 ml 至 5 ml 量瓶中，分別加甲醇定容，搖勻，用紫外分光光度計(jì)在335 nm 下測(cè)定試液的吸光度值。測(cè)定野黃芩苷在不同質(zhì)量濃度下溶液的吸光值后，繪制野黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為野黃芩苷質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度。半枝蓮樣品配制成50%甲醇水溶液，稀釋至一定濃度測(cè)量吸光度，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到半枝蓮樣品中總黃酮濃度。得率=（C×V×n/M）×100%，C 為總黃酮濃度，V 為體積，n 為稀釋倍數(shù)，M 為樣品質(zhì)量（10 g）。

1.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取工藝的影響 準(zhǔn)確稱取10 g 半枝蓮粉末，加入乙醇150 ml，在80 ℃水浴上加熱回流1 h，提取次數(shù)為2 次，加入乙醇的濃度分別設(shè)定為20%、40%、60%、80%和純水。

1.3.2 液料比對(duì)總黃酮提取工藝的影響 準(zhǔn)確稱取10 g 半枝蓮粉末，加入40%濃度乙醇，在80 ℃水浴上加熱回流1 h，提取次數(shù)為2 次，乙醇用量分別設(shè)定為1∶8、1∶10、1∶12 和 1∶15。

1.3.3 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取工藝的影響 準(zhǔn)確稱取10 g 半枝蓮粉末，加入40%濃度乙醇150 ml，在80 ℃水浴上加熱回流1 h，提取次數(shù)分別設(shè)定為1、2 和3 次。

1.3.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取工藝的影響 準(zhǔn)確稱取10 g 半枝蓮粉末，加入40%濃度乙醇150 ml，在80 ℃水浴上加熱回流，提取次數(shù)為3 次，回流時(shí)間分別設(shè)定為 1、1.5 和 2 h。

1.4 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素對(duì)半枝蓮中總黃酮得率的影響，借助Design-Expert 8.0.6 軟件，采用Box-Behnken 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)法以乙醇濃度、加熱回流提取時(shí)間、乙醇用量為自變量，以半枝蓮中總黃酮得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)3 水平3 因素的響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)方案，從中篩選最佳提取方案，因素、編碼及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)因素及編碼水平

1.5 DPPH 自由基清除能力試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)除DPPH自由基的試驗(yàn)方法［13-15］，準(zhǔn)確稱取 DPPH 16.7 mg，用甲醇定容至200 ml，所得到濃度為0.083 5 mg/ml,避光放置。將最佳提取條件所得到的濃縮液用50%甲醇溶液稀釋成 10 mg/ml，再稀釋配成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 和 0.8 mg/ml，取 700 μl 加入到量瓶中，在量瓶中各加入2 500 μl 上述配置好的DPPH 溶液，混勻，避光放置30 min，在紫外分光光度儀517 nm 下測(cè)定吸光度值，平行3 次，取其平均值，計(jì)算半枝蓮中總黃酮的清除率。清除率（%）=［1-（A1-A2)/A0］×100，式中 A0為50%甲醇 700 μl+2 500 μl DPPH 的吸光值；A1為樣品溶液 700 μl+2 500 μl DPPH 的吸光值；A2為樣品溶液700 μl+2 500 μl 甲醇的吸光值。同法以相同濃度的抗壞血酸，做對(duì)照試驗(yàn)，計(jì)算抗壞血酸清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 半枝蓮總黃酮含量測(cè)定結(jié)果 以野黃芩苷為對(duì)照品，按“1.2”項(xiàng)下所述方法操作，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程Y=0.026 9 X+0.057 5（r=0.999 5）。野黃芩苷在2.4~19.2 μg/ml 濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.7 設(shè)計(jì)方法：處理和對(duì)照均為綏農(nóng)26號(hào)大豆品種，公頃用48%開磷復(fù)合肥200kg，加入50%硫酸鉀50kg，均為5月11日播種，公頃用大豆種子為55kg。播種后第三天，即5月14日，用99%乙草胺1800mg/公頃+75%噻吩磺隆30g/公頃，兌水500kg/公頃，封閉滅草。田間管理均為趟兩遍地，苗后莖葉處理用25%氟磺胺草醚2000ml/公頃+12%烯草酮1200ml/公頃兌水320kg均勻噴霧，秋后拿一遍大草。田間防治病蟲害時(shí)用藥劑及時(shí)防治，大豆食心蟲防治時(shí)間為8月7日，通過秋季測(cè)產(chǎn)及收獲看，食心蟲防效甚好，蟲食率較低。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取工藝的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示出隨乙醇濃度的不斷增加，半枝蓮中總黃酮得率逐漸增大當(dāng)乙醇濃度到達(dá)40%時(shí)，其得率最高,但隨后隨濃度升高而下降，可能乙醇濃度過大時(shí)半枝蓮其他雜質(zhì)也會(huì)溶出，從而導(dǎo)致總黃酮得率降低。綜合考慮，確定乙醇最佳濃度為40%。

2.2.2 液料比對(duì)總黃酮提取工藝的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示出隨乙醇用量的增加，半枝蓮中總黃酮得率也逐漸增大，還要結(jié)合經(jīng)濟(jì)方面的考慮，液料比在1∶15 左右為宜。

2.2.3 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取工藝的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示出隨提取次數(shù)的增加，半枝蓮中總黃酮得率明顯增加，以3 次提取為最佳，所以固定提取次數(shù)定為3 次。

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取工藝的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示出提取時(shí)間在1~2 h 內(nèi)隨提取時(shí)間的增加，半枝蓮中總黃酮得率逐漸增大，但1.5 和2 h 得率差別不大，因此，提取時(shí)間設(shè)定為1.5 h。

2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 回歸模型方程的建立與分析 利用軟件Design-Expert 8.0.6 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共17 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，響應(yīng)曲面方案及半枝蓮總黃酮得率見表2，并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到半枝蓮總黃酮得率（Y）對(duì)乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、液料比（C）的二元多次回歸模型方程：Y=2.16+0.3 A+0.13 B+0.098 C-0.12 AB-0.032 AC+0.069 BC-0.24 A2-0.036 B2-0.072 C2?；貧w模型顯著性見表3。由表3可知：該模型的F=22.14，P=0.000 2<0.05，表明所得模型極顯著，失擬項(xiàng)為P=0.069 5>0.05，不顯著，表明試驗(yàn)結(jié)果主要受所選因素影響受其他因素影響很小，方程式成立方法可靠。模型的復(fù)合相關(guān)系數(shù)R2=0.966 1，說明了該模型擬合程度良好，可以用該模型優(yōu)化半枝蓮中總黃酮的提取工藝。模型一次項(xiàng)中3個(gè)因素乙醇濃度、提取時(shí)間和液料比對(duì)半枝蓮中總黃酮得率的線性效應(yīng)均有顯著影響，其影響力大小順序?yàn)橐掖紳舛龋ˋ）>提取時(shí)間（B）>液料比（C）。乙醇濃度與提取時(shí)間交互作用對(duì)結(jié)果影響顯著。二次項(xiàng)中乙醇濃度對(duì)結(jié)果影響極顯著。

表2 Box-Behnken 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

2.3.2 各因素之間的交互作用 該模型各模型之間的交互作用的響應(yīng)曲面圖及等高線圖見圖1-3。曲面越彎曲顯著性越高。等高線圖的形狀能兩者間反應(yīng)交互影響的強(qiáng)弱，橢圓形的等高線圖表示兩個(gè)條件交互作用明顯，而圓形相對(duì)較差，所得3 個(gè)圖中都為橢圓形證明交互作用都很明顯。

圖1 乙醇濃度與提取時(shí)間交互作用響應(yīng)曲面

圖2 乙醇濃度與液料比交互作用響應(yīng)曲面

圖3 提取時(shí)間與液料比交互作用響應(yīng)曲面

圖1 為乙醇濃度與提取時(shí)間交互作用對(duì)半枝蓮中黃酮得率的影響。在提取時(shí)間固定不變時(shí)，半枝蓮中黃酮得率隨乙醇濃度升高逐漸升高，濃度在65%以上得率有輕微下降的趨勢(shì)；在乙醇濃度固定不變時(shí)，半枝蓮中黃酮得率隨提取時(shí)間的增加而逐漸增大。在本試驗(yàn)范圍內(nèi)選擇較長(zhǎng)的提取時(shí)間和適宜的乙醇濃度就可得到較高的黃酮得率。

圖2 為乙醇濃度與液料比交互作用對(duì)半枝蓮中黃酮得率的影響。在液料比固定不變的條件下，半枝蓮中黃酮得率隨乙醇濃度升高逐漸升高，到達(dá)頂點(diǎn)時(shí)再升高濃度得率反而會(huì)有下降趨勢(shì)；在乙醇濃度固定不變時(shí)，半枝蓮中黃酮得率隨液料比加大而略有增加。在本試驗(yàn)范圍內(nèi)選擇較高的液料比和適宜的乙醇濃度可得到較高的黃酮得率。

圖3 為提取時(shí)間與液料比交互作用對(duì)半枝蓮中黃酮得率的影響。在液料比固定不變的條件下，隨提取時(shí)間的增加黃酮得率逐漸增加；在提取時(shí)間固定不變時(shí)，隨液料比的加大黃酮得率增加但并不十分顯著。在本試驗(yàn)范圍內(nèi)選擇較高的液料比和較長(zhǎng)的提取時(shí)間可以得到較高的黃酮得率。

2.3.3 模型驗(yàn)證性試驗(yàn) 通過Design-Expert 8.0.6 分析得出半枝蓮中總黃酮的最佳提取工藝為：半枝蓮10 g，乙醇濃度為59.43%，提取時(shí)間為2 h，液料比為1∶15，在最佳工藝條件下預(yù)測(cè)的半枝蓮中總黃酮得率為2.372%。為了提取工藝的可行性，將上述條件修正為：半枝蓮10 g，乙醇濃度為59%，提取時(shí)間為2 h，液料比為1∶15。并以此進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證3 次，得到半枝蓮中總黃酮的平均得率為2.366%，與預(yù)測(cè)值非常接近，故響應(yīng)曲面得到最優(yōu)試驗(yàn)條件可行可靠。

2.4 DPPH 清除能力試驗(yàn) 隨著半枝蓮黃酮提取物的質(zhì)量濃度的增加（0.1~0.8 mg/ml），半枝蓮黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基清除率從21.85%上升到92.06%。雖然與同等質(zhì)量濃度的抗壞血酸相比，半枝蓮黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基清除率整體要低于抗壞血酸對(duì)DPPH 自由基的清除率，但其高濃度下已和抗壞血酸的清除率很接近，表明半枝蓮中黃酮提取物有很好的抗氧化性。見圖4。

圖4 半枝蓮黃酮提取物和抗壞血酸對(duì)DPPH 自由基的清除作用

3 討論

采用加熱回流的方法對(duì)半枝蓮中的總黃酮進(jìn)行提取，通過單因素試驗(yàn)篩選出3 次提取為最佳提取次數(shù)，其他3 項(xiàng)指標(biāo)由Box-Behnken 響應(yīng)曲面分析法結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，得出最佳提取工藝條件：乙醇濃度為59%，提取時(shí)間為2 h，液料比為為1∶15，此條件下提取10 g 半枝蓮粉末所得半枝蓮中總黃酮得率為2.372%，與驗(yàn)證實(shí)際值2.366%，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值接近，證明采用響應(yīng)曲面的試驗(yàn)方法是可靠的，并且相比于傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)，響應(yīng)曲面法能在整個(gè)區(qū)域間找到因素與響應(yīng)值之間明確的回歸方程，使最佳值更精確，所得三維立體圖能更直觀看出因素之間的變化，為合理利用半枝蓮以至于中藥都有很重要的意義。

通過對(duì)DPPH 自由基清除能力試驗(yàn)得知半枝蓮中黃酮提取物對(duì)DPPH 自由基的清除能力有濃度依賴性，在黃酮提取物質(zhì)量濃度為0.8 mg/ml 時(shí)，清除率可達(dá)92.06%，接近于抗壞血酸的抗氧化能力，表明半枝蓮中的總黃酮具有較好的抗氧化能力，為以后半枝蓮在藥品中更好的利用提供依據(jù)。