泌乳素在不明原因復發(fā)性流產(chǎn)和正常妊娠早期中的差異性表達

陳 超，李聰聰，郭 楓，王巧紅，趙愛民

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海市婦科腫瘤重點實驗室，上海200127

復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent pregnancy loss，RPL）是生殖領域的重要疾病，美國生殖醫(yī)學學會將其定義為2 次或2次以上妊娠失?。?］。在我國，RPL一般指與同一配偶發(fā)生連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)［2］。RPL累及2%～5%的育齡期婦女，其中超過半數(shù)患者無法明確病因，被稱之為不明原因的復發(fā)性流產(chǎn)（unexplained RPL，URPL）［1-3］。針對這些患者的治療仍是目前臨床醫(yī)師的難題。胚胎著床和正常的胎盤發(fā)育是妊娠成功的關鍵，這一過程依賴于胚泡中滋養(yǎng)細胞對子宮內(nèi)膜的黏附以及進一步對蛻膜的侵襲浸潤［4］。越來越多的證據(jù)表明，人類子宮內(nèi)膜的蛻膜化在胚胎著床和胎盤發(fā)育過程中起著重要作用［5］，而蛻膜基質(zhì)細胞（decidual stromal cells，DSCs）作為蛻膜的主要細胞成分之一，扮演著重要角色。DSCs 由子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞（endometrial stromal cells，ESCs）經(jīng)蛻膜化轉(zhuǎn)變而來，以分泌泌乳素（prolactin，PRL）為特征，是蛻膜分泌PRL的主體細胞和羊水PRL的主要來源［6-9］。目前PRL被廣泛用以衡量ESCs/DSCs的蛻膜化程度［10］。既往報道［11-12］發(fā)現(xiàn)，在反復流產(chǎn)等患者中，PRL在黃體期子宮內(nèi)膜的表達顯著低于正常婦女。但關于妊娠早期ESCs/DSCs蛻膜化研究、PRL表達及其動態(tài)變化，以及PRL表達與URPL關聯(lián)研究未見報道。為此，本研究通過觀察比較URPL組和正常妊娠組早期DSCs 的PRL 表達情況，以及正常妊娠組、正常妊娠流產(chǎn)組和URPL組的外周血PRL水平及其動態(tài)變化情況，以明確URPL 是否存在ESCs/DSCs 蛻膜化異常，探討URPL的發(fā)生是否與子宮內(nèi)膜蛻膜化異常有關，為進一步闡明URPL的發(fā)病機制提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

本研究為病例對照研究。納入2018年3月—2019年3月于上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的80例URPL 患者，70 例自愿要求行人工流產(chǎn)的正常妊娠婦女及190例有生育要求的正常妊娠婦女。研究經(jīng)上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院倫理委員會批準，所有試驗對象均簽署知情同意書。

1.1.1 URPL組 選取行清宮手術的URPL患者，手術當日空腹采集外周血，收集蛻膜組織，并留取絨毛進行染色體檢測。納入標準：①經(jīng)陰道超聲檢查明確胚胎停止發(fā)育，孕周<10 周。②月經(jīng)周期規(guī)律（26～35 d）。③既往連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)次數(shù)≥2 次。排除標準：①有明確的RPL 病因［1］。②雙胎及多胎。③此次妊娠絨毛染色體異常。④合并高PRL 血癥。⑤合并肝腎功能異常、凝血功能異常及免疫系統(tǒng)疾病。

1.1.2 正常妊娠組 選取同期就診的正常早期妊娠婦女，采集空腹外周血測定。并隨訪其妊娠結(jié)局。納入標準：①經(jīng)陰道超聲檢查明確為宮內(nèi)妊娠，發(fā)育符合孕周，孕周<10 周。②月經(jīng)周期規(guī)律（26～35 d）。排除標準：①有胚胎移植失敗或自然流產(chǎn)史。②此次妊娠發(fā)生胚胎停育或自然流產(chǎn)。其余同URPL組排除標準②～⑤。

1.1.3 人工流產(chǎn)組 選取自愿要求行人工流產(chǎn)術的早期妊娠婦女。手術當日空腹采集外周血，并收集蛻膜組織。納入標準：①經(jīng)陰道超聲檢查明確為宮內(nèi)妊娠，胚胎發(fā)育正常，孕周<10 周。②月經(jīng)周期規(guī)律（26～35 d）。排除標準：①有胚胎移植失敗或自然流產(chǎn)病史。其余同URPL組排除標準②～⑤。

1.2 材料及方法

1.2.1 組織樣本 所有患者采集空腹外周血，同時收集人工流產(chǎn)和URPL 患者的蛻膜組織保存于預冷的DMEM/F-12中，冰上運輸至實驗室。

1.2.2 DSCs 細胞分離與培養(yǎng)如圖1所示，蛻膜標本清洗后，剪碎至1～2 mm2，按體積1∶5加入0.1%g/mL 膠原酶II（Sigma，美國）溶液，于37°C 水浴中輕柔晃動15 min，靜置1 min，吸取上層消化液等待過濾，下層組織碎片繼續(xù)加入新消化液重復消化，如此循環(huán)消化3次。獲得的上層消化液依序于100 目和200 目篩網(wǎng)中過濾，向濾液中加0.5 mL 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）中止消化。300 ×g 離心10 min，棄上清液，加入紅細胞裂解液，室溫孵育15min，離心棄上清液，洗滌一遍后加入含10%FBS 的DMEM/F-12 重懸細胞，鋪板，37°C 5% CO2條件下培養(yǎng)箱孵育6 h，更換新鮮培養(yǎng)基以去除懸浮細胞。

圖1 原代蛻膜基質(zhì)細胞的分離提取Fig 1 Isolation of primary decidual stromal cells

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）方法測定外周血PRL 水平。根據(jù)ELISA 試劑盒（R&D Systems，美國）說明書要求進行，通過酶標儀檢測吸光度值，并根據(jù)標準曲線計算PRL含量。

1.2.4 免疫組織化學方法 采用免疫組織化學方法（immunohistochemistry，IHC）對蛻膜進行角蛋白和波形蛋白染色以鑒定DSCs。同樣采用IHC 方法檢測DSCs 中PRL 的表達水平。蛻膜石蠟切片經(jīng)脫蠟/水合、抗原修復和內(nèi)源性過氧化物酶封閉后，用1×TBST/5%BSA 室溫封閉1 h。吸去封閉液，滴加抗人角蛋白、波形蛋白或PRL一抗（Abcam，美國），4 ℃孵育過夜。滴加辣根過氧化物酶標記試劑，濕盒中室溫孵育30 min。滴加過氧化物酶底物工作液，顯色10 min。蘇木精復染。掃描切片，Image J 軟件對目標蛋白進行平均光密度（average optical density，AOD）測定和分析。

1.2.5 細胞免疫熒光 采用細胞免疫熒光（immuno fluorescence，IF）方法檢測角蛋白和波形蛋白，進一步對DSCs進行鑒定。制備細胞爬片，以4%多聚甲醛室溫固定15 min。滴加封閉緩沖液（1×PBS/5% BSA/0.3% Triton?X-100），室溫封閉破膜60 min。吸去封閉緩沖液，加入抗人角蛋白和波形蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。滴加熒光二抗，室溫下避光孵育60 min。滴加含有染色質(zhì)染料4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片劑。用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 實時定量PCR 采用實時定量PCR（quantitative real time PCR，RT-qPCR）方法檢測DSCs PRL mRNA 表達水平。按照說明書，使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit （Takara， 日 本） 提 取RNA， 使 用PrimeScript?RT Reagent Kit （Takara，日本）將RNA 逆轉(zhuǎn) 錄 合 成cDNA， 使 用PrimeScript ?RT Master Mix（Takara，日本）制備RT-qPCR 反應體系，見表1。使用QuantStudio Test Development 軟件進行RT-qPCR，使用β-actin作為內(nèi)參，2?ΔΔCt方法計算相對表達量。

1.2.7 蛋白質(zhì)免疫印跡 試驗采用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western bloting）方法檢測DSCs 的PRL 蛋白表達水平。向培養(yǎng)皿中加入含有蛋白酶抑制劑（0.1 mg/mL）的細胞裂解液，冰上操作，細胞刮刀收集裂解液，冰上繼續(xù)裂解30 min，13 000×g 4 ℃離心20 min，收集上清，加上樣緩沖液，100 ℃煮10 min，?20 ℃冷藏待用。配制10%的SDS-PAGE膠，上樣量20～30 μg，電泳。電轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫封閉1 h。加入抗PRL 一抗過夜。加入顯色二抗，室溫孵育60 min，掃膜，采用Image J 軟件分析目標蛋白的灰度值。

表1 RT-qPCR引物系列（5′→3′）Tab 1 Primer sequences for RT-qPCR（5′→3′）

1.2.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。定量資料以±s 表示，2 組之間比較采用獨立樣本t 檢驗，多組組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料

URPL 組入組80 例，其中21 例因絨毛染色體異常而排除，最終納入59 例。人工流產(chǎn)組共70 例。190 例有生育要求的妊娠婦女中共計177 例完成隨訪（4 例失訪，9 例因主觀意愿終止妊娠而退出），其中157 例活產(chǎn)，歸入正常妊娠活產(chǎn)組（151 例足月分娩、6 例早產(chǎn)），其余20 例發(fā)生胚胎停育或自然流產(chǎn)（6 例發(fā)生在孕5～5+6周、10 例發(fā)生在孕6～7+6周、3 例發(fā)生在孕8～9+6周、1 例發(fā)生在孕14 周），其中流產(chǎn)發(fā)生于孕10 周以前的19 例歸入正常妊娠流產(chǎn)組。研究將各組按照標本采集當日的孕周分為孕5～5+6周、孕6～7+6周和孕8～9+6周3個亞組。以上各個亞組的一般情況如表2所示，同組內(nèi)各亞組間的年齡差異無統(tǒng)計學意義，相同孕周各組間的年齡差異亦無統(tǒng)計學意義。

2.2 外周血PRL水平

如表3 和圖2 所示，正常妊娠活產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組婦女的外周血PRL 水平類似，都隨著孕周的增加顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（正常妊娠活產(chǎn)組：孕5～5+6周vs孕6～7+6周，P=0.002；孕6～7+6周vs 孕8～9+6周，P= 0.012。人工流產(chǎn)組：孕5～5+6周vs 孕6～7+6周，P = 0.015；孕6～7+6周vs 孕8～9+6周，P=0.023），且相同孕周的2 組婦女之間差異無統(tǒng)計學意義。而URPL 組婦女的外周血PRL 水平隨著孕周增長無明顯上升，差異無統(tǒng)計學意義；孕5～5+6周時，其與正常妊娠活產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組相比，差異無統(tǒng)計學意義；孕6～7+6周和孕8～9+6周時，其顯著低于相同孕周的正常妊娠活產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組婦女，差異有統(tǒng)計學意義（孕6～7+6周：P= 0.018，0.024；孕8～9+6周：P=0.015，0.003）。正常妊娠流產(chǎn)組婦女外周血PRL水平類似于URPL婦女：不隨孕周的增長而上升，差異無統(tǒng)計學意義；相同孕周時，兩組婦女之間差異無統(tǒng)計意義；孕6～7+6周時，其亦顯著低于相同孕周的正常妊娠活產(chǎn)組和人工流產(chǎn)組婦女，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.022，P=0.041）。

表2 各組患者的一般情況比較（±s）Tab 2 Comparison of general conditions of patients in the four groups（±s）

表2 各組患者的一般情況比較（±s）Tab 2 Comparison of general conditions of patients in the four groups（±s）

Note: *: Comparison of subgroups (5-5+6 week, 6-7+6 week and 8-9+6 week)in the same group by One-way ANOVA. #: Comparison of women from different groups (URPL, induced abortion, normal pregnancy with final live birth and normal pregnancy with subsequent pregnancy loss) with the same gestational week by One-way ANOVA. a: Comparison of women from different groups with the same gestation of 5-5+6 week. b:Comparison of women from different groups with the same gestation of 6 - 7+6 week.c: Comparison of women from different groups with the same gestation of 8-9+6 week.

Group Subgroup Gestational age/week Number/n Age/year P value*P value#5-5+6 URPL（n=59）6-7+6 0.708 8-9+6 0.987a 0.741b 0.850c 5-5+6 Induced abortion（n=70）6-7+6 0.913 8-9+6 Normal pregnancy with final live birth（n=157）5-5+6 6-7+6 0.865 8-9+6 Normal pregnancy with subsequent pregnancy loss（n=19）5-5+6 6-7+6 0.695 8-9+6 20 22 17 22 27 21 53 59 45 8 11 0 28.80±4.25 29.87±4.10 29.29±4.31 29.05±3.98 28.85±3.97 29.33±3.62 28.91±3.81 29.20±4.23 28.78±4.53 29.38±4.14 30.18±4.49-

2.3 蛻膜基質(zhì)細胞的鑒定

角蛋白和波形蛋白被廣泛用于對DSCs的鑒定。我們亦采用這2 種骨架蛋白通過IHC 和IF 方法對DSCs 進行鑒定。結(jié)果如圖3所示。對于蛻膜石蠟切片進行角蛋白和波形蛋白的IHC 染色可將DSCs 與腺上皮區(qū)分開：DSCs 表達波形蛋白，不表達角蛋白；而腺上皮表達角蛋白，不表達波形蛋白。在DSCs的分離和體外培養(yǎng)中，對分離得到的貼壁細胞同樣進行角蛋白和波形蛋白的IF 染色，發(fā)現(xiàn)得到的絕大多數(shù)細胞都表現(xiàn)為波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，證實其為DSCs。DSCs 純度按波形蛋白+角蛋白—細胞占所有貼壁細胞的百分比計算，根據(jù)IF染色結(jié)果，DSCs純度>95%。

表3 各組患者的外周血PRL水平（±s）Tab 3 PRL levels in peripheral blood of women in four groups（±s）

表3 各組患者的外周血PRL水平（±s）Tab 3 PRL levels in peripheral blood of women in four groups（±s）

Note: *:Comparison between subgroups in the same group by unpaired t test: a:5-5+6 week vs 6-7+6 week; b:6-7+6 week vs 8-9+6 week; c:8-9+6week vs 5-5+6 week.#:Comparison of women from different groups(normal pregnancy with final live birth,URPL,induced abortion and normal pregnancy with subsequent pregnancy loss)with the same gestational week by unpaired t test.

Group Normal pregnancy with final live birth（n=157）Induced abortion（n=70）0.876 0.018 0.015 0.622 0.024 0.003 Number/n PRL/（ng·mL?1）Subgroup Gestational age/week 5-5+6 6-7+6 8-9+6 5-5+6 6-7+6 8-9+6 5-5+6 6-7+6 8-9+6 5-5+6 6-7+6 P value#P value *URPL URPL（n=59）——-28.88±11.38 35.69±11.30 42.22±14.66 27.59±11.40 37.47±15.11 49.06±18.94 29.34±11.39 28.49±10.79 32.28±11.91 25.63±8.33 27.52±8.77 Normal pregnancy with subsequent pregnancy loss（n=19）53 59 45 22 27 21 20 22 17 8 11 0.002a 0.012b-0.015a 0.023b-0.805a 0.306b 0.450c 0.635a-Induced abortion 0.659 0.547 0.113 Normal pregnancy with subsequent pregnancy loss 0.442 0.021-0.660 0.041-0.412 0.791————---

圖2 正常妊娠活產(chǎn)組、人工流產(chǎn)組、URPL組和正常妊娠流產(chǎn)組婦女的外周血PRL水平Fig 2 PRL levels in peripheral blood of women in normal pregnancy with final live birth group,induced abortion group,URPL group and normal pregnancy with subsequent pregnancy loss group

2.4 PRL在DSCs中的表達

本研究通過qRT-PCR、WB 以及IHC 方法分別在RNA 和蛋白水平檢測PRL 在DSCs 中的表達水平，結(jié)果如表4 和圖4 所示：人工流產(chǎn)組中，DSCs 的PRL 表達在RNA 和蛋白水平上均隨著孕周的增加顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（孕5～5+6周vs 孕6～7+6周：qRT-PCR，P =0.020；WB，P=0.010；IHC，P=0.030。孕6～7+6周vs孕8～9+6周：qRT-PCR，P = 0.011；WB，P = 0.034；IHC，P=0.012）；在URPL組中，孕6～7+6周的PRL表達與孕5～5+6周相比在RNA 水平和蛋白水平上都沒有顯著變化，差異無統(tǒng)計學意義；孕8～9+6周時，DSCs 的PRL 表達才出現(xiàn)顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（qRT-PCR：P=0.016；WB：P=0.016；IHC：P=0.021）。URPL 婦女在孕6～7+6周及孕8～9+6周時，DSCs 的PRL 表達在mRNA 及蛋白水平上都顯著低于相同孕周的人工流產(chǎn)婦女組，差異有統(tǒng)計學意義（孕6～7+6周：qRT-PCR，P = 0.012；WB，P =0.014；IHC，P = 0.028。孕8～9+6周：RT-qPCR，P =0.011；WB，P=0.030；IHC，P=0.026）。

圖3 蛻膜基質(zhì)細胞的鑒定（IHC和IF方法）Fig 3 Identification of decidual stromal cells by immunohistochemistry and immunofluorescence

3 討論

自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科常見的疾病，其中80%以上發(fā)生在妊娠早期，且大多在妊娠10 周以內(nèi)［13］。Goldstein等［14］對232 名孕婦的妊娠結(jié)局進行隨訪，發(fā)現(xiàn)有13.4%的婦女發(fā)生了臨床診斷明確的流產(chǎn)，其中的87.0%發(fā)生在妊娠10 周以前。本研究結(jié)果顯示完成隨訪的177 例有生育要求的早孕婦女中有20 例發(fā)生流產(chǎn)（11.3%），其中19 例都發(fā)生在孕10 周前，僅有1 例發(fā)生在孕14 周。我們的研究結(jié)果和既往報道一致，提示妊娠10 周以前是決定妊娠結(jié)局的重要時期。這一階段正是胎盤形成的關鍵時期，DSCs通過自身蛻膜化所產(chǎn)生的大量細胞因子［15-18］參與其中并發(fā)揮調(diào)控作用。其中，PRL 是DSCs 蛻膜化的標志性產(chǎn)物，已被確認羊水PRL 的主要來源就是DSCs。已有研究報道PRL 具有廣泛的生理調(diào)控作用，如調(diào)節(jié)種植窗的內(nèi)膜容受性，刺激滋養(yǎng)細胞生長和侵襲，促進血管生成，調(diào)節(jié)蛻膜NK 細胞的活性，調(diào)節(jié)羊膜中水分轉(zhuǎn)運等［19-23］。對孕9～12 周的羊水和胚胎外宮腔液的一項研究發(fā)現(xiàn)，胚胎外宮腔液中PRL是羊水含量的近10倍［24］，提示蛻膜在孕早期即有較高水平的PRL 分泌。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)孕6～7 周的DSCsPRL 表達水平顯著高于黃體中期的ESCs［25］。為了進一步研究早孕期DSCs 中PRL 表達及其變化趨勢，以及PRL 在URPL 患者中表達是否存在異常，我們對孕5～9+6周范圍內(nèi)的人工流產(chǎn)組和UPRL 組蛻膜組織進行分析，發(fā)現(xiàn)正常早期妊娠中，DSCs 的PRL表達在mRNA 和蛋白水平上均隨著孕周增加而顯著增加；但在URPL 組，直至8～9+6周時，DSCs的PRL 表達才出現(xiàn)顯著增加，但仍顯著低于相同孕周的人工流產(chǎn)組。這些結(jié)果表明在正常妊娠情況下，DSCs 中的PRL 表達隨著孕周的增長而不斷增加，子宮內(nèi)膜的蛻膜化程度亦不斷進展，這有利于胚胎的植入及其生長發(fā)育。而在URPL患者中，DSCs 中的PRL 表達出現(xiàn)增長滯后，蛻膜化程度不足，提示PRL的表達下降和其代表的蛻膜化不足與URPL的發(fā)生可能有相關。這些研究結(jié)果為蛻膜PRL 表達對于妊娠的建立和維持的重要性提供了更多的臨床證據(jù)，也為URPL的病因研究提供了新思路。

表4 人工流產(chǎn)組和URPL組中PRL在蛻膜基質(zhì)細胞中的表達Tab 4 PRL expression of decidual stromal cells in the UPRL and induced abortion groups

圖4 人工流產(chǎn)組和URPL組中PRL在蛻膜基質(zhì)細胞中的表達Fig.PRL expression of decidual stromal cells in UPRL and induced abortion groups

人類妊娠期間的外周血PRL 主要由垂體分泌，也可能部分來源于子宮局部DSCs 的分泌。從孕7～8 周開始，外周血PRL 水平即隨著孕周增長持續(xù)上升，直至在孕36 周到達峰值，隨后下降［26］。我們的研究結(jié)果提示正常妊娠外周血PRL 的顯著上升始于孕6～7+6周，隨著孕周增加平穩(wěn)升高，而URPL 患者的外周血PRL 并不能隨著孕周增長而發(fā)生顯著上升。此外，對正常妊娠流產(chǎn)組的19 名婦女與他組婦女進行比較，發(fā)現(xiàn)她們的外周血PRL水平和URPL組婦女相類似，提示胚胎停育或自然流產(chǎn)婦女可能普遍存在外周血低水平PRL，與既往研究［27-28］結(jié)果一致。結(jié)合既往報道，我們認為孕6周以后出現(xiàn)的外周血PRL 水平低下或增長滯后可能預示胚胎發(fā)育不良。妊娠早期連續(xù)動態(tài)檢測外周血PRL 水平對判斷妊娠結(jié)局可能有一定的價值。

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