新型冠狀病毒疫苗的研發(fā)現(xiàn)狀及展望

李曉瑞，李興航綜述，嚴(yán)漢池審校

1.天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津310110；2.武漢生物制品研究所，湖北 武漢430207

2020年1月12日，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）正式將引起新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的病原體命名為“2019新型冠狀病毒”（2019 novel corona virus，2019-nCoV），國(guó)際病毒分類學(xué)委員會(huì)命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）。SARS-CoV-2導(dǎo)致的COVID-19大流行給人類健康和全球經(jīng)濟(jì)造成了重大損失且，尚未發(fā)現(xiàn)特效的抗病毒藥物，因此，接種疫苗成為有效防治疾病的策略。鑒于SARSCoV-2與2003年暴發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory symptom coronavirus，SARSCoV）和2012年暴發(fā)的中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle Eastern respiratory syndrome-related coronavirus，MERS-CoV）均屬于冠狀病毒［1］，因此，在新型冠狀病毒疫苗（簡(jiǎn)稱新冠疫苗）的研究中，結(jié)合了研發(fā)SARS-CoV和MERS-CoV疫苗的經(jīng)驗(yàn)，迅速提出了滅活疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗和減毒活疫苗這5大新冠疫苗的主要研究路線，同時(shí)也在嘗試運(yùn)用反向疫苗學(xué)和疫苗組學(xué)等新興概念進(jìn)行疫苗的設(shè)計(jì)［2-3］。本文對(duì)目前正在研發(fā)和臨床試驗(yàn)的各類SARS-CoV-2疫苗以及研發(fā)所面臨的挑戰(zhàn)作一綜述。

1 SARS-CoV-2簡(jiǎn)介

SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒（Betacoronavirus Coronavirdae，β-CoV），是一種有包膜、基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突糖蛋白（spike，S）、包膜蛋白（envelope，E）、膜糖蛋白（membrane glycoprotein，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N），其中S蛋白形成三聚體結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，是一種主要的保護(hù)性抗原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)中和抗體（neutralizing antibody，Nab），在防止病毒感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1］。S蛋白直接與宿主細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）結(jié)合進(jìn)入上皮細(xì)胞引起感染，促進(jìn)病毒增殖［4-6］，目前，大多數(shù)新冠疫苗的設(shè)計(jì)正是針對(duì)S蛋白。

2 新冠疫苗的研究策略

自從SARS-CoV-2的基因序列公布以來(lái)，全世界的科研人員均在加快速度研發(fā)針對(duì)COVID-19的疫苗，這些候選疫苗的類型、研究進(jìn)展、優(yōu)勢(shì)以及存在的問(wèn)題見(jiàn)表1。

2.1 滅活疫苗（inactivated virus vaccine） 滅活疫苗通常是選用免疫原性強(qiáng)的病原體，經(jīng)大量培養(yǎng)后，采用理化方法進(jìn)行滅活而制成的疫苗。最經(jīng)典的滅活疫苗的研究途徑是先對(duì)病毒滅活處理后進(jìn)行多次純化，如脊髓灰質(zhì)炎和流感疫苗，其安全性和有效性已得到廣泛認(rèn)可［7-8］。針對(duì)SARS的滅活疫苗，在恒河猴、雪豹模型中能產(chǎn)生高滴度中和抗體［9-10］，SARS滅活疫苗Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明，其對(duì)人體安全有效，耐受性強(qiáng)［11］。2020年4月13日，國(guó)藥集團(tuán)中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司（簡(jiǎn)稱國(guó)藥中國(guó)生物）武漢生物制品研究所SARS-CoV-2滅活疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)，該疫苗是世界上第一支進(jìn)入臨床的滅活疫苗。2020年6月16日宣布了該疫苗的揭盲結(jié)果，Ⅰ／Ⅱ期臨床研究受試者已全部完成2針次接種，疫苗接種后安全、有效，受試者均產(chǎn)生了高滴度抗體，18～59歲組中按照0，14 d和0，21 d程序接種兩劑后，中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)97.6%；按照0，28 d程序接種兩劑后，中和抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)100%［12］。另一個(gè)值得關(guān)注的是北京科興中維生物技術(shù)有限公司（簡(jiǎn)稱科興中維）研制的新冠滅活疫苗克爾來(lái)福，GAO等［1］發(fā)表了SARS-CoV-2滅活病毒疫苗（PiCo Vacc）臨床前研究的最新成果，PiCoVacc可在小鼠、大鼠和恒河猴動(dòng)物模型中誘導(dǎo)出SARS-CoV-2特異性中和抗體，證明了PiCoVacc在恒河猴中的安全性和有效性。2020年6月14日公布了該疫苗的Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果，初步顯示具有良好的安全性和免疫原性，科興中維與巴西展開合作，雙方將在巴西共同開展Ⅲ期臨床試驗(yàn)［13-14］。此外，國(guó)藥中國(guó)生物北京生物制品研究所、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所研制的SARS-CoV-2滅活疫苗也均在開展Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

2.2 重組蛋白疫苗（recombinant protein vaccine）重組蛋白疫苗是將某種病毒的目的抗原基因構(gòu)建在表達(dá)載體上，將已構(gòu)建的表達(dá)蛋白載體轉(zhuǎn)化到細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中，在一定的誘導(dǎo)條件下，表達(dá)出大量的抗原蛋白，純化后制備的疫苗。該類疫苗目前有兩種研究方案：針對(duì)S蛋白的疫苗和病毒顆粒樣蛋白（virus-like particles，VLPs）［15-16］。S蛋白是SARSCoV-2與人體細(xì)胞上ACE2受體結(jié)合的部位，可在體外表達(dá)出S蛋白，再用于疫苗的制備，如美國(guó)Novavax公司研發(fā)的重組S蛋白納米顆粒疫苗。VLPs是通過(guò)病毒外殼模擬冠狀病毒的結(jié)構(gòu)來(lái)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。美國(guó)GeoVax公司采用改良痘病毒（modified vaccinia virus Ankara，MVA）作為疫苗表達(dá)載體，選擇SARSCoV-2的S蛋白作為核心抗原，共表達(dá)蛋白并協(xié)助VLPs的組裝，利用VLPs激活免疫應(yīng)答，目前正準(zhǔn)備進(jìn)行動(dòng)物模型試驗(yàn)以及Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)［17］。

2.3 病毒載體疫苗（viral vector-based vaccine）病毒載體疫苗是將病毒作為載體，利用基因工程技術(shù)將外源保護(hù)性抗原基因插入病毒的基因組內(nèi)，再轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得重組病毒，它們能在機(jī)體內(nèi)表達(dá)目的蛋白，并誘導(dǎo)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，進(jìn)而獲得免疫力。常用的病毒載體有腺病毒（adenvirus）、痘病毒（proxvirus）、皰疹病毒（herpes simples virus，HSV）等。2017年，康希諾生物股份有限公司（簡(jiǎn)稱康希諾）與軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院陳薇院士團(tuán)隊(duì)以腺病毒為載體研發(fā)了埃博拉病毒疫苗（Ad5-EBOV）［18］。聯(lián)合研發(fā)的以腺病毒為載體的重組SARS-CoV-2疫苗（Ad5-nCoV）于2020年3月17日獲批進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)，108名志愿者已完成接種，2020年4月9日招募Ⅱ期臨床試驗(yàn)志愿者［19-21］。2020年5月22日，該團(tuán)隊(duì)發(fā)布了Ad5-nCoVⅠ期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)，108名接種者全部有顯著的細(xì)胞免疫反應(yīng)，表明Ad5-nCoV安全性和耐受性良好，能在人體內(nèi)產(chǎn)生抗SARS-CoV-2的免疫應(yīng)答。接種單劑量Ad5-nCoV第14天后，中和抗體滴度明顯增長(zhǎng)，第28天后，抗體幾何平均滴度超過(guò)接種前4倍。特異性T細(xì)胞反應(yīng)也達(dá)到峰值，表明Ad5-nCoV能夠誘導(dǎo)高效的體液和細(xì)胞免疫［22］。

2.4 核酸疫苗（nucleic-acid vaccine）核酸疫苗包括DNA和mRNA疫苗。DNA疫苗是直接將編碼病毒抗原基因的DNA序列（常用質(zhì)粒）注入到宿主內(nèi)，使病毒的抗原蛋白在宿主體內(nèi)表達(dá)以誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫。研發(fā)機(jī)構(gòu)可根據(jù)SARS-CoV-2的基因序列直接生產(chǎn)疫苗。mRNA疫苗是將病毒抗原的mRNA制為疫苗，注入宿主內(nèi)的mRNA可表達(dá)病毒的抗原蛋白，從而誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。核酸疫苗由于本身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如在體內(nèi)可持續(xù)性表達(dá)，可誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫，維持時(shí)間長(zhǎng)，是目前熱門的新冠疫苗研發(fā)方向。

2020年3月16日，美國(guó)Moderna公司研發(fā)的COVID-19疫苗（mRNA疫苗，mRNA-1273）進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)的申請(qǐng)［23］。2020年5月18日，Moderna mRNA-1273在Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示出一定的安全性和免疫原性，18～55歲受試者在注射25、100μg mRNA-1273后，體內(nèi)產(chǎn)生了新冠抗體，抗體水平與疫苗劑量相關(guān)，其中2個(gè)劑量水平的8名志愿者達(dá)到或超過(guò)了恢復(fù)期血清中常見(jiàn)的中和抗體滴度。第2針接種14 d后，25μg劑量組志愿者體內(nèi)抗體水平與病毒感染患者康復(fù)后抗體水平相當(dāng)，而100μg劑量組抗體水平顯著高于康復(fù)感染患者。Moderna公司已開始準(zhǔn)備mRNA-1273的Ⅱ／Ⅲ期臨床試驗(yàn)［24-26］。對(duì)美國(guó)INOVIO研發(fā)的DNA疫苗（INO-4800）已進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)。經(jīng)INO-4800免疫后，小鼠和豚鼠可產(chǎn)生能中和S蛋白的中和抗體。INO-4800在臨床前模型中顯示能產(chǎn)生有效的中和抗體和T細(xì)胞免疫應(yīng)答［27］。

2.5 減毒活疫苗（live attenuated vaccine） 該路線是將病毒進(jìn)行減毒后制成疫苗。LAM等［28］發(fā)現(xiàn)，SARSCoV-2與穿山甲體內(nèi)的某個(gè)冠狀病毒RBD氨基酸序列相似性高達(dá)97.4%，研究者希望從動(dòng)物冠狀病毒中找到具有交叉保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)人無(wú)致病性的毒株，作為新冠疫苗候選株進(jìn)行后續(xù)研發(fā)。2020年6月18日，美國(guó)Codagenix宣布與印度血清研究所合作研發(fā)的減毒活疫苗CDX-005目前正進(jìn)行動(dòng)物安全性和有效性試驗(yàn)，與SARS-CoV-2相比，其毒性明顯減弱，預(yù)計(jì)7月初將獲得臨床前數(shù)據(jù)［29］。

此外還有一種基于流感病毒載體的研究策略，香港大學(xué)的研究者基于DelNS1流感疫苗系統(tǒng)，結(jié)合反向遺傳學(xué)技術(shù)，在DelNS1系統(tǒng)表達(dá)外源抗原，并已成功研制出MERS疫苗（DelNS1-MERS-CoV）［30］。這種DelNS1疫苗仍具備完整的流感病毒顆粒，帶有普通流感病毒的表面蛋白，但能同時(shí)在NS1上表達(dá)冠狀病毒S蛋白抗原，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此系統(tǒng)能夠有效表達(dá)MERS-CoV RBD或N蛋白［31］?？紤]到冠狀病毒RBD功能的相似性，研究者提出可利用此平臺(tái)快速研制DelNS1-2019nCoV疫苗［32］。

2.6 利用反向遺傳學(xué)和疫苗組學(xué)的研究策略 反向疫苗學(xué)是從全基因水平來(lái)篩選具有保護(hù)性免疫反應(yīng)的候選抗原的疫苗研發(fā)策略。其以微生物基因組為平臺(tái)，對(duì)毒力因子、外膜抗原、侵襲及毒力相關(guān)抗原等蛋白基因進(jìn)行高通量克隆、表達(dá)，純化出重組蛋白，再對(duì)純化后的抗原進(jìn)行體內(nèi)、體外評(píng)價(jià)，篩選出保護(hù)性抗原，進(jìn)行疫苗研究［33-34］。近日，ONG等［35］使用Vaxign反向疫苗學(xué)工具以及新開發(fā)的Vaxignl-ML機(jī)器學(xué)習(xí)工具用于預(yù)測(cè)COVID-19候選疫苗。除了常用的S蛋白外，非結(jié)構(gòu)蛋白3（non-structural protein 3，Nsp3）目前尚未在任何冠狀病毒疫苗研究中作為候選靶標(biāo)。Nsp3在SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERSCoV中的保守性遠(yuǎn)高于感染人和其他動(dòng)物的15種冠狀病毒。并提出含有結(jié)構(gòu)蛋白（structural protein，Sp）和非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp）的“p-u002FNsp混合疫苗”。

表1 新冠疫苗的類型、研究進(jìn)展、優(yōu)勢(shì)及存在的問(wèn)題Tab.1 Type，progress，advantage and problem in development of 2019-nCoV vaccine

3 新冠疫苗的展望與挑戰(zhàn)

新疫苗的安全和有效仍是研發(fā)的第一位，但同時(shí)存在一些挑戰(zhàn)。首先是常出現(xiàn)在冠狀病毒疫苗的ADE，ADE會(huì)在接種疫苗后加重病毒感染，中和抗體水平越低時(shí)感染越嚴(yán)重［37-39］。有研究表明，SARS、HIV和埃博拉病毒（Ebola virus，EV）會(huì)出現(xiàn)ADE現(xiàn)象［39-41］，COVID-19是否存在ADE效應(yīng)暫時(shí)尚無(wú)明確報(bào)道。

對(duì)于核酸疫苗而言，DNA疫苗的缺點(diǎn)在于需要特殊的接種設(shè)備，且外源性DNA可能會(huì)與自身細(xì)胞的DNA整合，因此，DNA疫苗的安全性值得關(guān)注［42］。mRNA疫苗不穩(wěn)定，易降解，且mRNA能否順利進(jìn)入宿主細(xì)胞，產(chǎn)生具有免疫原性的目的蛋白，也是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題［43］。

SARS-CoV-2的變異情況也備受關(guān)注，KORBER等［44］研究發(fā)現(xiàn)了S蛋白突變，第614位的天冬氨酸（D614）突變成甘氨酸（G614），G614的傳染性更強(qiáng)。自2020年3月以來(lái)，G164已成為全球主要的流行毒株，所占比例持續(xù)增加。突變后其傳播能力增強(qiáng)，感染后機(jī)體內(nèi)病毒載量增加，而毒力并未發(fā)生明顯變化，類似的突變是否會(huì)對(duì)疫苗的有效性產(chǎn)生影響還亟待研究，需密切關(guān)注其突變情況，尤其是RBD序列的變異情況。最后，新冠疫苗的研發(fā)多數(shù)已進(jìn)入Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗(yàn)，證實(shí)了疫苗的安全性，且有一定的免疫原性，在國(guó)內(nèi)疫情大體控制的情況下，如何合理設(shè)計(jì)與開展Ⅲ期臨床試驗(yàn)以及新型疫苗的可獲得性，包括疫苗的成本和獲得途徑，能否迅速規(guī)?；a(chǎn)等，均是所要面臨的挑戰(zhàn)。

SARS-CoV-2全球大暴發(fā)影響了數(shù)十億人的正常生活。帝國(guó)理工學(xué)院的FERGUSON等［45］建模表明，如無(wú)特效疫苗出現(xiàn)，封城、社交隔離與社會(huì)的解封將會(huì)持續(xù)循環(huán)下去。因此，研發(fā)針對(duì)COVID-19的疫苗和特效藥物是唯一有效的方法，對(duì)預(yù)防病毒感染和疫情防控具有重要意義。