人用狂犬病疫苗原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)國(guó)家對(duì)照品的建立

石磊泰，李加，張?jiān)绿m，王輝，雷繼軍，郭中平，李玉華

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京102629；2.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京100176；3.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司，湖北 武漢430070；4.國(guó)家藥典委員會(huì)，北京100061

從1965年武漢生物制品研究所和蘭州生物制品研究所聯(lián)合中國(guó)藥品生物制品檢定所用北京株狂犬病病毒固定毒株，在原代地鼠腎細(xì)胞適應(yīng)傳代，研制成功原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)的人用狂犬病滅活疫苗，至今為止，在我國(guó)已有50多年的使用歷史［1-3］。目前該類(lèi)疫苗仍在市場(chǎng)流通，為我國(guó)狂犬病的預(yù)防做出了卓越的貢獻(xiàn)?？袢∈侵滤佬约膊?，全世界每年因其死亡約59 000人［4］，我國(guó)近年的狂犬病疫情雖有所緩解，但情況仍不容樂(lè)觀(guān)。我國(guó)人用狂犬病疫苗市場(chǎng)需求量較大，2015—2019年連續(xù)5年人用狂犬病疫苗（地鼠腎細(xì)胞）的批簽發(fā)量就分別達(dá)到了80萬(wàn)、80萬(wàn)、100萬(wàn)、120萬(wàn)和63萬(wàn)人份［5］。狂犬病疫苗接種無(wú)禁忌癥，受種群體廣泛，因此其有效性和安全性就顯得尤為重要，而就安全性而言，疫苗中的雜質(zhì)控制值得關(guān)注。

宿主蛋白作為來(lái)源于細(xì)胞基質(zhì)的一類(lèi)異源成分，可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生未知的免疫應(yīng)答而影響疫苗的功效，也可能引起超敏反應(yīng)或其他不良反應(yīng)，有必要進(jìn)行有效控制。雖然WHO的技術(shù)指導(dǎo)原則中未對(duì)宿主蛋白殘留量作出含量限定［6-7］，但我國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)早在《中國(guó)藥典》三部（2010版）中就明確了地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量的限量標(biāo)準(zhǔn)［8］，并建立了有效的檢測(cè)方法［9-10］，在人用狂犬病疫苗（地鼠腎細(xì)胞）的質(zhì)量控制中發(fā)揮了技術(shù)支撐和監(jiān)管的作用。

在不改變現(xiàn)有檢測(cè)方法的前提下，我們優(yōu)化了檢測(cè)體系，研制出原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品［11］，替換試劑盒自帶標(biāo)準(zhǔn)品，確保了檢定結(jié)果的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。為了配合原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的合理、有效使用，有必要建立原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)國(guó)家對(duì)照品，以保證檢驗(yàn)檢測(cè)體系的準(zhǔn)確、可靠。本研究采用ELISA法，用原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（量值為4.0μg／mL）對(duì)原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定賦值，并進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性分析。

1 材料與方法

1.1 協(xié)作標(biāo)定樣品 原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)為：250024-201901，經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)批準(zhǔn)使用，量值為4.0μg／mL，凍干劑型，95%可信限為：（4.0±0.5）μg／mL，6支／實(shí)驗(yàn)室；待標(biāo)定原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品，凍干劑型，6支／實(shí)驗(yàn)室。

1.2 協(xié)作標(biāo)定方案 由中國(guó)食品藥品檢定研究院設(shè)計(jì)協(xié)作標(biāo)定方案并發(fā)放協(xié)作標(biāo)定作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，各實(shí)驗(yàn)室使用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范和統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)記錄，采用原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量ELISA檢測(cè)試劑盒［由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司（原天壇生物）提供，批號(hào)為：20190414和20190415］，用原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（6.25～200 ng／mL），計(jì)算原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品含量。

1.3 數(shù)據(jù)匯總及結(jié)果分析 邀請(qǐng)4家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，各參與單位每次實(shí)驗(yàn)獨(dú)立檢測(cè)6次，涉及2個(gè)批次試劑盒，每批3個(gè)數(shù)據(jù)，中國(guó)食品藥品檢定研究院匯總各協(xié)作單位檢測(cè)結(jié)果，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0分析，計(jì)算原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品的量值。

1.4 對(duì)照品均勻性和穩(wěn)定性分析

1.4.1 均勻性 對(duì)于均勻性好的樣品，當(dāng)總體單元數(shù)大于500時(shí)，抽取單元數(shù)不小于15個(gè)的要求，該標(biāo)準(zhǔn)品物理檢查合格數(shù)為2 000支，均勻性檢驗(yàn)抽取的數(shù)目為16支，采用pH值考察均勻性指標(biāo)。

1.4.2 穩(wěn)定性 將樣品分別在4、25和37℃放置不同時(shí)間（1、2、3和4周），不同時(shí)間點(diǎn)取3支，于-20℃保存。待所有樣本放置結(jié)束后，采用統(tǒng)一的ELISA方法，將樣本用0.5 mL滅菌注射用水復(fù)溶，進(jìn)行抗原含量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品協(xié)作標(biāo)定結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，最終原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品量值為34.7 ng／mL；95%參考范圍按95%可信限公式（x±1.96S）計(jì)算，其中x=34.7 ng／mL，S=5.2，得出95%參考范圍為：（34.7±10.1）ng／mL。見(jiàn)表1。

表1 ELISA法對(duì)原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定的結(jié)果（ng／mL）Tab.1 Collaborative calibration of primary hamster kidney cell protein control by ELISA（ng／mL）

2.2 原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品均勻性 檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)中的方差分析，根據(jù)自由度（15，32）及給定的顯著性水平α=0.05，由F表查得臨界值F0.05=2.02，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得均勻性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量F=0.50，由此得出F

2.3 原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品穩(wěn)定性 檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)中的方差分析，根據(jù)自由度（3，8）及給定的顯著性水平α=0.05，由F表查得臨界值F0.05=4.07，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可得4℃穩(wěn)定性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量F1=0.94，25℃穩(wěn)定性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量F2=0.03，37℃穩(wěn)定性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量F3=0.59，比較得出F1

表2 原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品均勻性考察（pH）Tab.2 Uniformity of primary hamster kidney cell protein control（pH）

表3 原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品穩(wěn)定性考察（ng／mL）Tab.3 Stability of primary hamster kidney cell protein control（ng／mL）

3 討論

我國(guó)人用狂犬病疫苗（地鼠腎細(xì)胞）生產(chǎn)是以原代地鼠腎細(xì)胞為細(xì)胞基質(zhì)，經(jīng)過(guò)研發(fā)之初后不斷的工藝優(yōu)化，現(xiàn)在比較固定的生產(chǎn)流程是細(xì)胞培養(yǎng)、病毒接種、病毒收獲液濃縮、滅活、純化、半成品配制及成品分裝等步驟［8］。疫苗成品中主要成分為病毒抗原，此外還有宿主細(xì)胞殘留蛋白，這些殘留蛋白可對(duì)人體產(chǎn)生致敏反應(yīng)，因此宿主蛋白殘留量的控制顯得尤為重要。

目前我國(guó)人用狂犬病疫苗（地鼠腎細(xì)胞）蛋白質(zhì)殘留量檢測(cè)采用ELISA法，限量標(biāo)準(zhǔn)為不高于24μg／劑［8］，為了定好標(biāo)尺、嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，我們研制了原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品［11］，為檢測(cè)實(shí)驗(yàn)是否成立，保證檢驗(yàn)檢測(cè)體系的準(zhǔn)確、可靠，有必要建立原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品。

采用已有的檢驗(yàn)檢測(cè)體系，引入北京生物制品研究所有限責(zé)任公司（原天壇生物）生產(chǎn)的2個(gè)不同批次的ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，用原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（4.0μg／mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（6.25～200 ng／mL），邀請(qǐng)4個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定，各參與單位每次實(shí)驗(yàn)獨(dú)立檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)品賦值每個(gè)實(shí)驗(yàn)室提供不少于6個(gè)數(shù)據(jù)（2批試劑盒，每批3個(gè)數(shù)據(jù)），對(duì)采集到的24個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，最終原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品量值定為34.7 ng／mL，95%參考范圍為（34.7±10.1）ng／mL。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性應(yīng)該是均勻的，即在規(guī)定的細(xì)分范圍內(nèi)其特性保持不變。為了檢驗(yàn)樣品是否均勻，通常隨機(jī)抽取一定數(shù)量的最小包裝單元，采用精密度高的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)抽出的各樣品在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測(cè)定，從而使各樣品間的差異完全由樣品的不均勻性反映出來(lái)。方差分析是用來(lái)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均勻性的最常用方法，該方法是通過(guò)組間方差和組內(nèi)方差的比較來(lái)判斷各組測(cè)量值之間有無(wú)系統(tǒng)性差異，如果兩者的比小于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的［12］。用pH值來(lái)考察標(biāo)準(zhǔn)品的均勻性，根據(jù)自由度（15，32）及給定的顯著性水平α=0.05，可由F表查得臨界值F0.05=2.02，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可得均勻性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量F=0.50，由此得出F

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性包括短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性，長(zhǎng)期穩(wěn)定性是長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)積累數(shù)據(jù)。短期穩(wěn)定性是指在運(yùn)輸條件下標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在運(yùn)輸過(guò)程中的穩(wěn)定性，根據(jù)制品性質(zhì)放置不同溫度（一般放置4、25、37℃）、不同時(shí)間（1、2、3和4周），進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定，以評(píng)估其穩(wěn)定情況［13-14］。根據(jù)自由度（3，8）及給定的顯著性水平α=0.05，可由F表查得臨界值F0.05=4.07，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可得4℃穩(wěn)定性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量F1=0.94，25℃穩(wěn)定性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量F2=0.03，37℃穩(wěn)定性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量F3=0.59，比較得出F1

本研究成功建立了人用狂犬病疫苗（地鼠腎細(xì)胞）宿主蛋白殘留檢測(cè)（ELISA法）的原代地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)對(duì)照品（批號(hào)為：250025-201901），已經(jīng)賦值并通過(guò)了均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)考察，可用于人用狂犬病疫苗（地鼠腎細(xì)胞）宿主蛋白檢測(cè)體系，判斷實(shí)驗(yàn)是否成立，將對(duì)以地鼠腎細(xì)胞為基質(zhì)的人用狂犬病疫苗的質(zhì)量控制起到重要作用。