流感病毒神經(jīng)氨酸酶活性及型別鑒定酶聯(lián)凝集素法的建立

曹海丹，劉旭光，王平，趙丹紅，孫宇，孫志偉，楊紅育，李帥，張雪梅，吳業(yè)紅

長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長(zhǎng)春130012

流感病毒表面含有兩種糖蛋白，分別為血凝素（hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）［1］。HA能夠與宿主細(xì)胞表面唾液酸受體結(jié)合，隨后感染細(xì)胞?？笻A中和抗體能夠抑制病毒HA活性從而抵抗病毒感染［2］。HA是流感疫苗中的主要成分，其含量和活性已成為疫苗制備中的關(guān)鍵控制指標(biāo)。NA是流感病毒表面上的另一種重要糖蛋白，其在病毒的成熟釋放過程中發(fā)揮重要作用［3］。有研究表明，抗NA抗體能夠阻止病毒通過黏液層滲透，阻止新生病毒顆粒從感染細(xì)胞中脫離，限制游離病毒顆粒感染新細(xì)胞的數(shù)量［4］。針對(duì)NA的免疫力可顯著降低流感發(fā)病率和致死率，限制流感傳染易感個(gè)體的機(jī)會(huì)［5］。據(jù)報(bào)道，人群中抗NA抗體水平與感染后康復(fù)及感染疾病程度相關(guān)［6］。由于人群對(duì)帶有新型HA的流感病毒無免疫力，但人體可能在之前流感病毒流行時(shí)就已經(jīng)對(duì)NA產(chǎn)生免疫力，從而抵抗病毒感染。因此，針對(duì)NA的免疫力在新型HA流感大流行期間可能起到極重要作用［7］。

WHO推薦采用硫代巴比妥酸（thiobarbithuric acid，TBA）檢測(cè)流感病毒NA活性及型別鑒定［8］，該方法是基于檢測(cè)NA從胎球蛋白上裂解后的游離唾液酸數(shù)量，但存在大量使用危險(xiǎn)化學(xué)品和操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其在流感疫苗生產(chǎn)檢定和流感病毒監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用。最近發(fā)展起來的酶聯(lián)凝集素測(cè)定法（enzyme-linked lectin assay，ELLA）也依賴于NA的唾液酸酶活性，但不檢測(cè)游離唾液酸，而是檢測(cè)NA裂解唾液酸后暴露的末端半乳糖［9-10］。已有文獻(xiàn)證明，與TBA法相比，ELLA法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單并利于推廣等優(yōu)點(diǎn)［11］。本研究應(yīng)用ELLA法檢測(cè)流感疫苗單價(jià)原液NA活性，并鑒定流感病毒NA型別，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 毒株H1N1型疫苗毒株［A／California／7／2009（H1N1）（NYMC X-179A）、A／Michigan／45／2015（H1N1）（NYMC X-275）、A／Brisbane／2／2018］、H3N2型疫苗毒株［A／Texas／50／2012（NYMCX-223A）、A／Hongkong／4801／2014（NYMCX-263B）、A／Singapore／INFIMH-16-0019／2016（NIB-104）］、B型疫苗毒株［B／Brisbane／60／2008（NYMC BX-35）、B／Phuket／3073／2013、B／Colorado／6／2017］均購(gòu)自NIBSC。

1.2 主要試劑及儀器 胎球蛋白、BSA、辣根過氧化物酶標(biāo)記的花生凝集素（HRP-PNA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；抗N1、N2和B型流感病毒NA標(biāo)準(zhǔn)血清購(gòu)自NIBSC；H1N1、H3N2和B型流感疫苗單價(jià)原液、PBS、甲醛、TritonX-100、未接種病毒雞胚尿囊液為長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗六室制備；TMB購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Thermal Fisher公司。

1.3 流感疫苗單價(jià)原液中NA活性檢測(cè)ELLA法的建立 將胎球蛋白用PBS溶解后，用0.05 mol／L CB（pH 9.6）稀釋至25μg／mL，加至酶標(biāo)板中，100μL／孔，密封膜包裹，4℃過夜；棄上清，用洗液洗滌3次，拍干，加入倍比稀釋的單價(jià)原液，100μL／孔，每個(gè)樣品作復(fù)孔，設(shè)加入0.01 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）的陰性對(duì)照孔，37℃孵育16～18 h；棄孔中液體，用洗滌液洗滌3次，拍干，加入HRP-PNA（酶稀釋液1∶500稀釋），100μL／孔，室溫作用2 h；棄孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌5次，拍干，加入TMB底物液，100μL／孔，室溫作用15 min；加入終止液，100μL／孔，10 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。以待測(cè)樣品A值大于等于2.1倍陰性對(duì)照A值作為Cutoff值，確定單價(jià)原液的酶活。

1.4 流感疫苗毒株NA型別鑒定ELLA法的建立

1.4.1 流感病毒毒株最佳工作濃度確定 取3個(gè)型別的樣品各30μL分別加入120μL病毒稀釋液中，混勻，取120μL，加至病毒稀釋板，進(jìn)行2倍倍比稀釋，設(shè)陰性對(duì)照孔（病毒稀釋液），每個(gè)型別病毒均作復(fù)孔。將不同比例稀釋的病毒液轉(zhuǎn)移至包被胎球蛋白的酶標(biāo)孔中，100μL／孔，（37±1）℃孵育16～18 h；棄液體，洗滌液洗滌3次，拍干，加入HRPPNA，100μL／孔，室溫作用2 h；棄液體，洗滌液洗滌5次，拍干，加入TMB底物液，100μL／孔，室溫作用15 min；加入終止液，100μL／孔，10 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。以病毒稀釋度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制病毒酶活性曲線。以病毒稀釋度A值約為起始病毒稀釋度的90%且在線性范圍內(nèi)，且至少比陰性對(duì)照大10倍為最佳病毒稀釋度。

1.4.2 流感病毒毒株型別鑒定 將3個(gè)型別的抗流感病毒NA標(biāo)準(zhǔn)血清56℃滅活1 h，取20μL分別加至80μL血清稀釋液中，混勻，取60μL，加至血清稀釋板中，進(jìn)行2倍倍比稀釋。將3個(gè)型別的樣品用病毒稀釋液稀釋至最佳工作濃度，加至血清稀釋板中，60μL／孔，每個(gè)樣品作復(fù)孔，設(shè)陽性對(duì)照孔（120μL最佳稀釋度病毒）和陰性對(duì)照孔（120μL病毒稀釋液），振蕩混勻，取100μL轉(zhuǎn)移至包被胎球蛋白的酶標(biāo)板中，（37±1）℃孵育16～18 h；棄孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，加入HRP-PNA，100μL／孔，室溫作用2 h；棄孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌5次，拍干，加入TMB底物液，100μL／孔，室溫作用15 min；加入終止液，100μL／孔，10 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，并按照下式計(jì)算NA抑制率。選取抑制率≥50%的最高血清稀釋度作為NI50。

1.5 方法的驗(yàn)證

1.5.1 耐用性 將HRP-PNA孵育不同時(shí)間（1.5、2、2.5 h），用上述建立的方法檢測(cè)NI50。

1.5.2 專屬性 用上述建立的方法檢測(cè)PBS（陰性對(duì)照）、甲醛、TritonX-100、未接種病毒雞胚尿囊液等單價(jià)原液中的原輔料的A450。

1.5.3 適用性 用上述建立的方法進(jìn)行H1N1、H3N2和B型不同疫苗毒株的型別鑒定。

2 結(jié)果

2.1 流感疫苗單價(jià)原液NA活性 結(jié)果顯示，陰性對(duì)照A450均值為0.041，不同型別連續(xù)3批單價(jià)原液的A450均值分別為H1N1：1.919～1.930；H3N2：1.909～1.952；B：1.805～1.871。所有型別單價(jià)原液的NA活性均為陽性，且不同型別批間一致性較好。見表1。

表1 不同型別流感病毒單價(jià)原液NA活性檢測(cè)結(jié)果（A450）Tab.1 Determination result of NA activity in monovalent bulk of influenza virus of various subtypes（A450）

2.2 流感病毒最佳工作濃度 結(jié)果顯示，隨著病毒稀釋度的增加，不同型別毒株的NA活性逐漸降低，直至為0。在1∶10、1∶20稀釋的H1N1中，A值比較接近，在1∶40稀釋時(shí)，A值約為最大值的90%。對(duì)于H3N2和B型毒株，均是在1∶20稀釋時(shí)，A值約為最大值的90%。因此，確定H1N1、H3N2和B型毒株最佳稀釋度分別為1∶40、1∶20和1∶20。見圖1。

2.3 流感病毒型別 結(jié)果顯示，對(duì)于H1N1型毒株，抗N1型血清能夠明顯抑制H1N1的NA活性，NI50對(duì)應(yīng)的血清稀釋度為1∶2 560，而抗N2和B型血清不能有效抑制H1N1的NA活性，NI50對(duì)應(yīng)的血清稀釋度分別為1∶80和1∶10。對(duì)于H3N2型毒株，抗N1、N2和B型標(biāo)準(zhǔn)血清的NI50分別為1∶160、1∶2 560和1∶10。對(duì)于B型毒株，抗N1、N2和B型標(biāo)準(zhǔn)血清的NI50分別為1∶40、1∶40和1∶320。見圖2～4。

圖1 不同型別毒株NA活性Fig.1 NA activity of influenza virus of various subtypes

圖2 H1N1型毒株NA活性抑制結(jié)果Fig.2 Inhibition of NA activity of influenza virus of subtype H1N1

圖3 H3N2型毒株NA活性抑制結(jié)果Fig.3 Inhibition of NA activity of influenza virus of subtype H3N2

圖4 B型毒株NA活性抑制結(jié)果Fig.4 Inhibition of NA activity of influenza virus of subtype B

2.4 方法的驗(yàn)證

2.4.1 耐用性 結(jié)果顯示，HRP-PNA不同孵育時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果均無影響，見表2。

表2 HRP-PNA不同孵育時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響（NI50）Tab.2 Effect of incubation time of HRP-PNA on test result（NI50）

2.4.2 專屬性 結(jié)果顯示，PBS、甲醛、Triton X-100和未接種雞胚尿囊液的A450值均為陰性，見表3。

表3 輔料對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響（A450）Tab.3 Effect of additives on test result（A450）

2.4.3 適用性 結(jié)果顯示，H1N1型別不同毒株［A／California／7／2009（H1N1）（NYMC X-179A）、A／Michigan／45／2015（H1N1）（NYMC X-275）、A／Brisbane／2／2018）］分別與倍比稀釋的抗N1、N2和B型血清混合后，NI50分別為1∶2 560、1∶80、1∶10；1∶1 280、1∶80、1∶10；1∶1 280、1∶160、1∶10。H3N2型別不同毒株［（A／Texas／50／2012（NYMCX-223A）、A／Hongkong／4801／2014（NYMCX-263B）、A／Singapore／INFIMH-16-0019／2016（NIB-104）］分 別 與倍比稀釋的抗N1、N2和B型血清混合后，NI50分別為1∶80、1∶2 560、1∶10；1∶80、1∶1 280、1∶10；1∶80、1∶1 280、1∶10。B型別不同毒株［B／Brisbane／60／2008（NYMC BX-35）、B／Phuket／3073／2013、B／Colorado／6／2017）］分別與倍比稀釋的抗N1、N2和B型血清混合后，NI50分別為1∶40、1∶40、1∶320；1∶20、1∶40、1∶320；1∶20、1∶40、1∶320。見圖5～7。

圖5 H1N1型別不同疫苗毒株NI50檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Determination result of NI50 of vaccine strains of subtype H1N1

圖6 H3N2型別不同疫苗毒株NI50檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Determination result of NI50 of vaccine strains of subtype H3N2

圖7 B型別不同疫苗毒株NI50檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Determination result of NI50 vaccine strains of subtype B

3 討論

目前，歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）和WHO均要求對(duì)流感疫苗單價(jià)原液進(jìn)行NA活性檢測(cè)，流感疫苗毒種需進(jìn)行NA型別鑒定［12-14］。流感病毒NA活性可通過NA水解胎球蛋白來確定，型別鑒定可通過NA抑制（NI）試驗(yàn)及抗體介導(dǎo)對(duì)酶活性的干擾程度來確定。這些檢測(cè)均依賴于NA水解唾液酸的活性，即通過測(cè)量唾液酸從高糖基化蛋白如胎球蛋白的釋放程度。

本研究成功建立了一種用于流感病毒NA活性及型別鑒定的檢測(cè)方法。應(yīng)用該方法檢測(cè)了流感病毒裂解疫苗單價(jià)病毒原液，結(jié)果顯示，3個(gè)型別單價(jià)原液的NA活性均為陽性，且不同型別批間一致性較好。該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［15］，即同一廠家各批次疫苗間NA活性比較為穩(wěn)定。流感病毒型別鑒定結(jié)果顯示，相應(yīng)的NA血清能夠明顯抑制相應(yīng)型別的流感病毒NA活性，而非對(duì)應(yīng)的NA血清不能有效抑制其他型別流感病毒NA活性。綜上所述，該方法能夠區(qū)分流感病毒不同亞型的NA，且同一型別不同流感疫苗株結(jié)果基本一致。因此，可用于國(guó)內(nèi)流感病毒裂解疫苗質(zhì)量評(píng)估。