橘紅茶香氣特征及風(fēng)味成分分析

劉盼盼，鄭鵬程，龔自明,*，常澤睿,3，蘇方俊，黃 波，馮 琳，高士偉，鄭 琳

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)茶葉研究所，湖北省茶葉工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430064；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070；4.湖北金果茶業(yè)股份有限公司，湖北 恩施 444333）

橘紅茶是由柑橘皮與紅茶經(jīng)過(guò)采摘、洗果、切帽、取肉、干燥、入茶、烘焙等一系列特殊工藝加工而成，成品呈圓形、橘黃鮮亮、香氣馥郁，融合了柑橘殼的果香味和紅茶甜香味，故其滋味獨(dú)特，茶性溫和甘醇，老少皆宜，具有疏肝潤(rùn)肺、止咳降糖[1-2]、抑菌、抗氧化和抗腫瘤[3-4]、減肥降脂[5-6]等功效，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。

香氣是茶葉重要品質(zhì)因子，同時(shí)也是消費(fèi)者追求茶葉消費(fèi)的重要導(dǎo)向之一。目前，關(guān)于柑普茶特征及化學(xué)成分的研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，多種特征性風(fēng)味物質(zhì)及功能成分被認(rèn)知，如柑普茶揮發(fā)性成分以烯烴類(lèi)成分為主，非揮發(fā)性成分主要有橙皮苷、兒茶素等[7-8]，這對(duì)客觀評(píng)價(jià)柑普茶的品質(zhì)、指導(dǎo)其加工過(guò)程調(diào)控有著積極意義。而對(duì)于柑橘與紅茶結(jié)合后形成的橘紅茶風(fēng)味變化的研究較少，有待深入。不同柑橘原料制作的橘紅茶風(fēng)味特征不同，只有明確橘紅茶產(chǎn)品的風(fēng)味特征，才能更好地完善產(chǎn)品質(zhì)量，從而獲得消費(fèi)者的認(rèn)可和喜愛(ài)。據(jù)此，本研究擬選取宜紅茶、南豐蜜橘、砂糖橘為研究對(duì)象，采用定量描述分析，頂空固相微萃取技術(shù)并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GCMS-O）等現(xiàn)代技術(shù)分析不同橘紅茶的香氣特征及揮發(fā)性風(fēng)味成分，結(jié)合相關(guān)性分析、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析手段，明確其特征香氣成分，比較分析橘紅茶與其原料間的成分差異，旨在為橘紅茶的品質(zhì)判定及加工過(guò)程品質(zhì)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品信息見(jiàn)表1，宜紅茶、南豐蜜橘殼、砂糖橘殼、橘紅茶A和橘紅茶B等一系列樣品均按照表1中的工藝方法加工而成，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，原料由湖北金果茶業(yè)股份有限公司提供，供試樣于4 ℃冷藏保存。

癸酸乙酯、正構(gòu)烷烴（C6～C30）等（均為色譜純，純度＞98.0%） Sigma-Aldrich（上海）公司。

表1 樣品信息Table 1 Information about tea samples tested in this study

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；ODP3聞香儀 德國(guó)Gerstel公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭美國(guó)Supeclo公司；HHS型恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 感官評(píng)價(jià)方法

樣品按照1∶50茶水比沖泡，評(píng)價(jià)小組由5 位經(jīng)過(guò)感官培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)人員組成，對(duì)橘紅茶及其原料的香氣屬性以及香氣強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分（表2），采用10分制[9]（0～2 分微強(qiáng)，2～4 分較強(qiáng)，4～6 分強(qiáng)，6～8 分很強(qiáng)，8～10 分極強(qiáng)）。具體感官術(shù)語(yǔ)及標(biāo)準(zhǔn)品參照見(jiàn)表2。

表2 橘紅茶感官術(shù)語(yǔ)及其定義Table 2 Sensory terms of Juhong tea and their definitions

1.3.2 頂空固相微萃取法[10]

根據(jù)GB/T 8303—2013《茶 磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測(cè)定》中的試樣制備法，取出茶樣混勻，磨碎，作為待測(cè)試樣。橘殼的磨碎方法參照茶樣，先混勻后，用磨碎機(jī)磨碎，作為待測(cè)試樣。稱取1 g樣品放入萃取瓶中，加入30 mL沸水，然后將裝有50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（實(shí)驗(yàn)前在250 ℃老化15 min）的固相微萃取手持器通過(guò)瓶蓋的橡皮墊插入到萃取瓶中，在60 ℃水浴中平衡10 min，推出纖維頭，吸附50 min后，取出并立即插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口中，解吸附3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器收集數(shù)據(jù)。

1.3.3 橘紅茶及其原料揮發(fā)性成分的GC-MS分析

GC條件：安捷倫HB-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱。進(jìn)樣口溫度240 ℃，電子捕獲檢測(cè)器溫度250 ℃；載氣為高純氦氣；流速1.8 mL/min。柱溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min；實(shí)驗(yàn)中盡量將峰分開(kāi)，保證峰形的對(duì)稱完整，然后通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行定性分析。

MS條件：電子電離能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍為50～600 u；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；質(zhì)譜傳輸線溫度為280 ℃。

物質(zhì)鑒定：利用NIST11.L譜庫(kù)對(duì)得到的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索和人工解析。査對(duì)有關(guān)質(zhì)譜資料，對(duì)基峰、質(zhì)荷比和相對(duì)峰度等方面進(jìn)行分析，結(jié)合保留時(shí)間和質(zhì)譜分別對(duì)各峰加以確認(rèn)。采用內(nèi)標(biāo)癸酸乙酯定量香氣成分，計(jì)算如式（1）所示：

1.3.4 橘紅茶及其原料揮發(fā)性成分的GC-MS-O分析

氣相色譜-質(zhì)譜條件同1.3.3節(jié)。

嗅聞條件：嗅聞系統(tǒng)傳輸線溫度220 ℃，嗅聞口溫度200 ℃，加濕器流速12 mL/min。流出成分在毛細(xì)管末端以1∶1的分流比流入聞香器。載氣為氮?dú)?，流速? mL/min。

挑選3 名經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)聞香培訓(xùn)的品評(píng)人員進(jìn)行聞香分析。應(yīng)用時(shí)間強(qiáng)度法，記錄香氣出現(xiàn)時(shí)間、香氣特征和香氣強(qiáng)度（aroma intensity，AI），AI以0～5六個(gè)級(jí)別表述，“0”表示未聞到，“3”表示AI中等，“5”表示AI非常強(qiáng)。每人對(duì)每個(gè)組分聞香2 次，每個(gè)化合物的AI為6 次聞香結(jié)果的平均值。

1.3.5 橘紅茶揮發(fā)性成分的OAV計(jì)算

OAV為某化合物質(zhì)量濃度與該物質(zhì)嗅覺(jué)閾值的比值，按式（2）計(jì)算：

式中：Ci為某個(gè)化合物的質(zhì)量濃度/（μg/L）；Ti為該物質(zhì)的氣味閾值/（μg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件、Simca-P 13.0進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析及OPLS-DA。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅茶及其原料香氣風(fēng)味輪廓分析

由圖1可以看出，宜紅茶、南豐蜜橘殼、砂糖橘殼和兩個(gè)橘紅茶樣品在各個(gè)感官屬性上的強(qiáng)度值及其風(fēng)味存在差異。宜紅茶的甜香顯著高于南豐蜜橘殼和砂糖橘殼，而果香與青香則顯著低于2 個(gè)柑橘殼。橘紅茶的果香最突出，強(qiáng)度接近其柑橘殼，其次為甜香，而青香強(qiáng)度最弱。宜紅茶與柑橘殼經(jīng)過(guò)加工后的橘紅茶風(fēng)味強(qiáng)度介于兩者之間，融合了柑橘殼的果香味和紅茶甜香味，香氣更加馥郁。

圖1 橘紅茶香氣感官雷達(dá)圖Fig. 1 Aroma profiles of of Juhong tea

2.2 橘紅茶及其原料主要揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

圖2 宜紅茶（a）、南豐蜜橘殼（b）、砂糖橘殼（c）、橘紅茶A（d）與橘紅茶B（e）揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of volatile components in Yihong black tea (a), Nanfeng mandarin peel (b), Shatangju mandarin peel (c), Juhong tea A (d) and Juhong tea B (e)

GC-MS分析橘紅茶及其原料樣品揮發(fā)性成分的總離子色譜圖見(jiàn)圖2，宜紅茶、柑橘殼及橘紅茶的揮發(fā)性組分見(jiàn)表3。5 個(gè)樣品中共檢測(cè)到92 個(gè)揮發(fā)性化合物，香氣總量為343.48～10 175.40 μg/L，其中質(zhì)量濃度較高的成分有檸檬烯（30.45～4 248.52 μg/L）、芳樟醇（14.30～1 409.96 μg/L）、百里香酚（0～782.22 μg/L）和α-法尼烯（4.11～339.68 μg/L）。這些化合物主要是萜烯類(lèi)物質(zhì)，研究表明，萜烯類(lèi)化合物是由前體物質(zhì)異戊二烯基焦磷酸和3,3-二甲基烯丙基焦磷酸在相關(guān)酶的作用下合成的[11]，且大都帶有濃郁的甜香、花香和木香，是各類(lèi)茶的主要揮發(fā)性成分[12]，也是構(gòu)成橘紅茶甜香與果香重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。紅茶與柑橘皮共有成分有8 個(gè)，包括檸檬烯、α-法尼烯、芳樟醇等，可見(jiàn)香氣物質(zhì)基礎(chǔ)的差異形成了不同的風(fēng)味特征。

表3 橘紅茶及其原料揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS-O分析Table 3 Analysis of volatile components of Juhong tea and its raw materials by GC-MS-O

續(xù)表3

圖3 橘紅茶及其原料揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)及相對(duì)含量Fig. 3 Types and contents of volatile components in Juhong tea samples

橘紅茶樣品揮發(fā)性化合物包括醛類(lèi)23 種，醇類(lèi)23 種，烯類(lèi)20 種，酮類(lèi)9 種，酯類(lèi)9 種和其他類(lèi)8 種（圖3）。其中烯類(lèi)物質(zhì)含量最高，平均含量為70.67%，烯類(lèi)化合物中含量較多檸檬烯、γ-萜品烯、α-法尼烯、月桂烯和β-蒎烯等，與很多研究結(jié)果相似，柑橘屬的橙子、檸檬、柚子等的揮發(fā)性成分也以萜烯類(lèi)為主[13-14]，另外檸檬烯組分占砂糖橘殼香氣總量的87.60%，遠(yuǎn)高于在南豐蜜橘殼中的比例（53.05%），這是砂糖橘殼果香風(fēng)味高于南豐蜜橘殼的重要因素；其次為醇類(lèi)化合物，平均含量為16.39%，醇類(lèi)化合物中含量較多有芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇和萜烯醇等，與其他研究相近，醇類(lèi)是紅茶香氣中的主要物質(zhì)[15-16]；再次為醛類(lèi)物質(zhì)，平均含量為4.72%，醛類(lèi)化合物中含量較多有辛醛、癸醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛等；接著為酯類(lèi)物質(zhì)，平均含量為3.58%，酯類(lèi)化合物中含量較多有水楊酸甲酯、乙酸香葉醇酯和乙酸橙花醇酯等；而酮類(lèi)及其他類(lèi)物質(zhì)含量較低。

由表3可知，橘紅茶及其原料樣品經(jīng)過(guò)GC-MS-O分析，共檢測(cè)到20 種香氣活性物質(zhì)，其中4 種香氣成分（AI≥2.0）對(duì)橘紅茶的風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)，分別為檸檬烯（柑橘香）、β-紫羅酮（花香）、月桂烯（檸檬、木香、花香）和芳樟醇（花香）。檸檬烯具有檸檬、柑橘的味道，賦予橘紅茶清新的果香和誘人的柑橘香[17]；β-紫羅酮具有紫羅蘭香氣，花香濃郁，對(duì)橘紅茶香氣影響較大[18]；月桂烯具有檸檬、木香等風(fēng)味；芳樟醇具有溫和、甜的花香。這些香氣活性成分為橘紅茶果香和花香悠長(zhǎng)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 橘紅茶及其原料主要揮發(fā)性物質(zhì)的OAV分析

OAV能確切地評(píng)價(jià)單一香氣組分對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)度。一般認(rèn)為OAV≥1的化合物為呈香的關(guān)鍵化合物[23]。本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)中部分化合物在水中的閾值計(jì)算出各化合物的OAV，從表4可以看出，以O(shè)AV≥1為標(biāo)準(zhǔn)從橘紅茶及其原料中篩選出了11 種關(guān)鍵香氣物質(zhì)，其中β-紫羅酮、檸檬烯、β-大馬烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、芳樟醇和癸醛在橘紅茶及其原料中的OAV均值達(dá)到10以上，對(duì)花香、果香及甜香等風(fēng)味特征的構(gòu)成有重要貢獻(xiàn)。

表4 橘紅茶主要揮發(fā)性成分的閾值及OAV分析Table 4 Odor thresholds and OAV of important volatile compounds in Juhong tea samples

由表4可知，香氣活性成分以醛類(lèi)物質(zhì)最為主要，占其中55%?，F(xiàn)有研究表明，脂肪族醛類(lèi)（(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、癸醛、月桂醛、(E)-2-癸烯醛和(E)-2-壬烯醛）的沸點(diǎn)低、閾值較小，具有脂肪味、果香、皂香等風(fēng)味，對(duì)橘紅茶果香的貢獻(xiàn)較大。β-紫羅蘭酮閾值極低，可能是橘紅茶中花香馥郁的特征物質(zhì)。β-大馬烯酮僅存在于紅茶原料中，在柑橘皮中未檢出，其閾值與β-紫羅蘭酮相近[24]，呈現(xiàn)甜香，可能是橘紅茶中甜香的特征物質(zhì)。這些酮類(lèi)化合物可能來(lái)源于類(lèi)胡蘿卜素的氧化和縮合反應(yīng)及β-胡蘿卜素的氧化分解反應(yīng)[25]。檸檬烯在柑橘皮中含量非常高，閾值相對(duì)較低，是橘紅茶果香風(fēng)味的重要組成物質(zhì)。芳樟醇在南豐蜜橘皮中含量遠(yuǎn)高于砂糖橘和宜紅茶，可能是橘紅茶A與橘紅茶B花香強(qiáng)度的主要差異物質(zhì)。

2.4 影響橘紅茶及其原料香氣品質(zhì)的關(guān)鍵揮發(fā)性成分分析

基于橘紅茶香氣分屬性的感官評(píng)分（圖1）與揮發(fā)性成分含量水平（表3），采用SPSS軟件進(jìn)行了相關(guān)性分析，進(jìn)一步得到了影響橘紅茶香氣品質(zhì)的關(guān)鍵香氣成分（表5）。其中月桂烯和香茅醛與果香呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），苯乙醛和苯乙醇與甜香呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），芳樟醇、百里香酚、乙酸香葉醇酯、β-欖香烯、β-紫羅酮和α-法尼烯與花香呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），香茅醛與青香呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），月桂烯、香茅醛和月桂醛與木香呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。月桂烯、香茅醛和月桂醛都與果香、木香相關(guān)性較高，研究發(fā)現(xiàn)這些成分均呈現(xiàn)出果香（檸檬）、松木香等風(fēng)味。苯乙醛和苯乙醇屬于芳香族物質(zhì)，均具有明顯甜香、花香特征[26]。百里香酚呈現(xiàn)百里香味[27]，乙酸香葉醇酯具有玫瑰花香[28]，β-欖香烯具藥草香[29]，β-紫羅酮具有紫羅蘭花香[20]，這些成分所呈現(xiàn)的特殊花香共同形成了橘紅茶濃郁的花香風(fēng)味。

表5 橘紅茶及其原料香氣得分與關(guān)鍵成分含量相關(guān)性分析Table 5 Analysis of correlation between aroma score and concentrations of key components

2.5 橘紅茶與柑橘殼及宜紅茶原料揮發(fā)性成分的差異分析

為比較橘紅茶與柑橘殼及宜紅茶原料揮發(fā)性成分的差異，對(duì)所有樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，基于各樣品間揮發(fā)性成分的檢測(cè)結(jié)果建立了OPLS-DA模型，對(duì)于潛在的差異揮發(fā)性成分，使用變量投影重要性因子（variable importance in projection，VIP）值大于1的進(jìn)行不同樣品差異揮發(fā)性成分篩選。由圖4可知，宜紅茶與柑橘殼、橘紅茶與宜紅茶、橘紅茶與柑橘殼的差異分析表明VIP高于1且標(biāo)準(zhǔn)誤差低于0.5的化合物分別有18、20 種和9 種。宜紅茶與柑橘殼的標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分為橙花醇、(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醇等，其中橙花醇、(E)-氧化芳樟醇等10 種成分為宜紅茶特有，香茅醛、β-香茅醇等5 個(gè)成分為柑橘殼特有，而月桂烯、檸檬烯和(E)-β-羅勒烯為共有成分；橘紅茶與宜紅茶的標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分為(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、香芹酮、水楊酸甲酯等，其中(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醛和(Z)-氧化芳樟醇僅存在于宜紅茶中，可能是在加工過(guò)程中損失而在橘紅茶中未檢出，香芹酮、乙酸香茅酯等10 個(gè)成分為橘紅茶特有，水楊酸甲酯、香葉醇等6 個(gè)為共性成分；橘紅茶與柑橘殼的標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分為壬醇、α-古巴烯、β-蒎烯等，其中α-古巴烯、β-蒎烯和α-摩勒烯是柑橘殼中特有，可能是在加工過(guò)程中損失而在橘紅茶中未檢出，其他6 個(gè)均為共性成分。從差異成分可以看出，柑橘殼中特有的成分主要是萜烯類(lèi)，包括萜烯醛和萜烯酯類(lèi)，研究表明萜烯醛類(lèi)是相應(yīng)的醇在乙醇脫氫酶作用下產(chǎn)生，而萜烯酯類(lèi)在乙酰輔酶A、乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下產(chǎn)生[30-31]。

圖4 橘紅茶與宜紅茶及柑橘殼的香氣差異成分的VIP值Fig. 4 VIP values of volatile components differed between Juhong tea,Yihong black tea and citrus peel samples

3 結(jié) 論

橘紅茶與宜紅茶及柑橘殼樣品共定性出92 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，其中萜烯類(lèi)物質(zhì)的含量較高。烯類(lèi)和醇類(lèi)是橘紅茶中主要的揮發(fā)性化合物，可能對(duì)橘紅茶的香氣品質(zhì)形成起著關(guān)鍵的作用。通過(guò)GC-MS-O共嗅聞出氣味活性化合物20 種，其中4 種揮發(fā)性成分（AI≥2.0）對(duì)橘紅茶的風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)，分別為檸檬烯（柑橘香）、β-紫羅酮（花香）、月桂烯（檸檬、木香、花香）和芳樟醇（花香）。從OAV結(jié)果看，橘紅茶系列樣品中有11 種化合物OAV不低于1，其中β-紫羅酮、檸檬烯、β-大馬烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、芳樟醇和癸醛在橘紅茶及其原料中的OAV均值達(dá)到10以上，對(duì)花香、果香及甜香等風(fēng)味特征的構(gòu)成有重要貢獻(xiàn)。綜合OAV及AI值，檸檬烯、β-紫羅酮、芳樟醇、癸醛、β-大馬烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛和辛醛可能是橘紅茶中重要的揮發(fā)性化合物。相關(guān)性分析結(jié)果表明，月桂烯、苯乙醛、芳樟醇等11 個(gè)揮發(fā)性成分對(duì)果香、花香、甜香、青香和木香風(fēng)味屬性的表征有較大貢獻(xiàn)。OPLS分析表明，宜紅茶與柑橘殼的標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分為橙花醇、(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醇等18 種，橘紅茶與宜紅茶的標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分為(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、香芹酮、水楊酸甲酯等20 種，橘紅茶與柑橘殼的標(biāo)志差異性揮發(fā)性成分為壬醇、α-古巴烯、β-蒎烯等9 種。本研究對(duì)湖北省橘紅茶及其原料的香氣特征及關(guān)鍵呈香成分進(jìn)行分析，后續(xù)研究中針對(duì)鑒定出的關(guān)鍵呈香成分，需進(jìn)行系統(tǒng)的香氣重組、缺失實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵呈香成分的致香效果。同時(shí)橘紅茶關(guān)鍵呈香成分在加工過(guò)程中的變化也尚不明晰，有必要進(jìn)一步明確橘紅茶特征香氣的形成機(jī)制，為提高橘紅茶產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。