基于牛乳非蛋白生物標(biāo)志物定量檢測山羊乳中摻加的牛乳

孫金芝，付路靜，岳田利，李婧妍，郭春鋒

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

乳是人類所需蛋白質(zhì)和脂肪的重要來源之一，由于其營養(yǎng)特性，乳及乳制品在食品工業(yè)中扮演著重要角色[1]。由于山羊乳富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素和小脂肪分子，與牛乳相比具有易消化性和低致敏性等優(yōu)勢，因此山羊乳可以作為牛乳蛋白質(zhì)過敏者的更佳選擇[2-5]。此外，山羊乳特有的上皮細(xì)胞生長因子和豐富的超氧化物歧化酶還可以提高人體免疫力，延緩機體衰老[6-7]。目前山羊乳的收購價格幾乎是牛乳的2 倍，受經(jīng)濟利益驅(qū)使，山羊乳摻假制假現(xiàn)象較為嚴(yán)重[8]，如為了提高山羊乳原乳中脂肪和蛋白質(zhì)的含量向其中添加植脂末、銨鹽、水解蛋白粉和尿素等。隨著檢測儀器的更新和檢測技術(shù)的進步，這些摻假現(xiàn)象已能被有效識別，但最新的摻假手段是向山羊乳中摻加牛乳[9]，由于牛乳在外觀和化學(xué)組成上與山羊乳非常相似，這使鑒別該摻假現(xiàn)象具有一定難度[10]。

目前文獻中已報道了多種技術(shù)手段用于鑒別山羊乳中摻加的牛乳。以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的鑒別手段有高效液相色譜法[11]、質(zhì)譜法[12-13]、電泳法[14-15]和酶聯(lián)免疫法[16-18]等，其中酶聯(lián)免疫法應(yīng)用最廣泛，該方法的典型特征是特異性強、操作簡單，德國拜發(fā)公司的試劑盒便是基于該技術(shù)開發(fā)，但該試劑盒僅能檢測山羊乳中摻加的未經(jīng)熱處理過的牛乳，無法檢測經(jīng)過熱處理的牛乳摻加物[19]。以脂肪酸為靶標(biāo)的鑒別手段有氣相色譜法[20-21]和質(zhì)譜法[22-23]等。盡管山羊乳和牛乳在脂肪酸組成，特別是短鏈脂肪酸組成上存在一定差異，但山羊乳和牛乳的脂肪酸組成和含量會受季節(jié)和飼料等因素的影響，這限制了該方法的可推廣性。另外，以牛體細(xì)胞為靶標(biāo)的鑒別手段也有報道。該方法通常是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增牛線粒體DNA的保守序列以確定樣品中是否含有牛乳成分[2,23-28]，但牛乳中體細(xì)胞的數(shù)量并非恒定，它會隨著奶牛的健康狀況以及環(huán)境因素等發(fā)生較大變化，這使該方法只能進行定性檢測，難以用于定量分析。

盡管上述方法在某些情況下是有效的，但都存在一定的局限性。本研究前期選擇丹?；苌吞请嬉宜狨セ苌Y(jié)合色譜技術(shù)對牛乳和山羊乳的非蛋白成分進行分析，但均未發(fā)現(xiàn)牛乳中區(qū)別于山羊乳的標(biāo)志物。隨后選擇了硅烷化衍生的方法，原因在于硅烷化試劑中的三甲基硅烷基會取代化合物中羥基、羧基、巰基、氨基及亞氨基的活潑氫，從而降低化合物極性，提高其揮發(fā)性，將不易揮發(fā)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)的衍生物，從而擴大了氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測定范圍。通過硅烷化衍生結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法成功挖掘到了牛乳區(qū)別于山羊乳的非蛋白生物標(biāo)志物，然后以此為靶標(biāo)采用高效液相色譜技術(shù)對山羊乳中摻加的牛乳進行定性和定量檢測。本研究開發(fā)的方法可提升羊乳企業(yè)和質(zhì)檢機構(gòu)檢測和監(jiān)測山羊乳原乳質(zhì)量的能力，進而促進山羊乳產(chǎn)業(yè)健康、持續(xù)和快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的牛乳（荷斯坦奶牛）和山羊乳（薩能奶山羊）均采集自西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧教學(xué)試驗基地，采集后迅速貯存于-86 ℃冰箱，備用。

N-乙酰氨基葡萄糖、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-menthy-5-pyrazolone，PMP）、磷酸氫二鉀（均為分析純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸、硅烷化衍生試劑Sylon HTP（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）國藥集團化學(xué)試劑有限公司；丙酮、乙腈、吡啶、正己烷、三氯甲烷（均為色譜純） 美國Tedia有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Prominence-i LC-2030型高效液相色譜儀、GCMSQP2010 Ultra型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；64R型高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；DK-98IIA型電熱恒溫水浴鍋 上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；VORTEX-GENIE2型可調(diào)速旋渦混合器 美國Scientific Industries公司；MD200-1型氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛乳非蛋白生物標(biāo)志物挖掘

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品前處理

標(biāo)準(zhǔn)品：吸取1 mL質(zhì)量濃度為250 mg/L的N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，與等體積的冷丙酮（置于-20 ℃冰箱過夜）混合，旋渦混勻，用于衍生。

樣品：吸取1 mL牛乳或山羊乳，加入10 mL離心管中，再加入等體積冷丙酮，旋渦混勻，于4 ℃冰箱內(nèi)靜置10 min，然后于8 000×g離心10 min，以沉淀蛋白，吸取上清液，用0.22 μm尼龍濾膜過濾，用于衍生。

1.3.1.2 硅烷化衍生

參照J(rèn)ordan等[29]方法進行硅烷化衍生。吸取50 μL上述標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，加入玻璃具塞試管中，于室溫下氮氣吹干，加入100 μL衍生試劑Sylon HTP，旋渦混勻，密封后于70 ℃反應(yīng)60 min，冷卻至室溫后，加入1 mL正己烷和1 mL吡啶，旋渦混勻，以溶解殘渣，然后吸取1 mL溶液，進行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.3.1.3 氣相色譜-質(zhì)譜測定

色譜條件：DB-1非極性毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度100 ℃，維持1 min，以4 ℃/min上升至260 ℃，維持34 min，總運行時間75 min；載氣為高純氦氣，流量1.8 mL/min；不分流進樣，進樣體積1.0 μL；進樣口溫度260 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度200 ℃；電離能量70 eV；溶劑延遲時間10 min；全掃描模式；質(zhì)量掃描范圍m/z50～800。

1.3.2 山羊乳中摻加牛乳的檢測

1.3.2.1 目標(biāo)物的衍生

采用PMP對目標(biāo)物進行衍生[28-30]。按照1.3.1.1節(jié)方法對樣品進行前處理后，吸取100 μL濾液，加入至具塞玻璃試管中，加入100 μL 0.6 mol/L氫氧化鈉溶液，旋渦混勻，再加入200 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，再次旋渦混勻，于70 ℃反應(yīng)60 min，冷卻至室溫后，加入100 μL 0.6 mol/L鹽酸，旋渦混勻，氮氣吹干，加入2 mL水和2 mL三氯甲烷，旋渦混勻，靜置5 min，移除氯仿層，再重復(fù)萃取2 次，以除去多余的衍生試劑，吸取1 mL上層水相，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，進行高效液相色譜分析。

1.3.2.2 高效液相色譜分析條件

TC-C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；柱流速0.75 mL/min；紫外檢測器，檢測波長245 nm；進樣體積20 μL；流動相A：0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.8）；流動相B：含20%乙腈的0.05 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 6.8）；梯度洗脫條件：0～10 min，80%～60% A，20%～40% B；10～30 min，60% A，40% B；30.1 min，80% A，20% B，維持15 min。

1.3.2.3 衍生時間的確定

以N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）為研究對象，衍生溫度70 ℃，衍生時間分別設(shè)定為15、30、45、60、75 min和90 min，然后進行高效液相色譜分析，記錄N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的峰面積。

1.3.2.4 衍生物穩(wěn)定性分析

采用1.3.2.1節(jié)方法分別對N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）和牛乳樣品進行衍生，衍生后將樣品于室溫下分別靜置0、3、6、9、12 h和24 h，然后采用1.3.2.2節(jié)方法對其中的N-乙酰氨基葡萄糖衍生物進行分析。

1.3.2.5 牛乳中N-乙酰氨基葡萄糖含量測定

取8 份牛乳樣品，按照確定的衍生條件和色譜程序?qū)ζ渲械腘-乙酰氨基葡萄糖含量進行分析。

1.3.2.6 熱處理對牛乳中N-乙酰氨基葡萄糖含量的影響

將牛乳樣品于沸水浴中分別加熱0、20、40 min和60 min，然后按照上述衍生條件和色譜程序?qū)ζ銷-乙酰氨基葡萄糖含量進行分析。

1.3.3 方法學(xué)評價

1.3.3.1 檢出限、定量限和線性范圍

向山羊乳中添加2%的牛乳，利用已經(jīng)建立的衍生條件和色譜程序進行分析，重復(fù)測定10 次，計算標(biāo)準(zhǔn)差S0，檢出限和定量限分別用進行計算[31-32]。另外，向山羊乳中分別添加1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%的牛乳，按照上述衍生條件和色譜程序進行分析，每個樣品重復(fù)測定3 次，通過線性回歸分析，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。本實驗選擇荷斯坦奶牛所產(chǎn)牛乳進行研究的原因在于該品種奶牛在我國養(yǎng)殖量最大，占總飼養(yǎng)量的95%以上[33]，因此該研究對象更具代表性。

1.3.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

基于回收率評估方法的準(zhǔn)確度，向山羊乳樣品中分別摻加10、50 mg/L和100 mg/L的N-乙酰氨基葡萄糖，用已建立的方法進行分析，每個添加質(zhì)量濃度重復(fù)測定3 次，計算回收率。根據(jù)加標(biāo)樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）評估方法的精密度，包括日內(nèi)精密度和日間精密度。前者在同一天內(nèi)不同時間分別對加標(biāo)樣品測定3 次，然后計算RSD，后者是在3 d內(nèi)同一時間分別對加標(biāo)樣品進行測定，然后計算RSD[34]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳關(guān)鍵非蛋白生物標(biāo)志物檢測

圖1 山羊乳和牛乳硅烷化衍生產(chǎn)物的氣相色譜-質(zhì)譜全掃描色譜圖Fig. 1 Full-scan chromatograms of silylated derivatives of goat and cow milks

圖2 N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基半乳糖質(zhì)譜圖Fig. 2 Mass spectra of cow milk, N-acetylglucosamine and N-acetylglactosamine

對山羊乳和牛乳的三甲基硅烷化衍生物進行質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖1所示。牛乳（圖1b）中36.99 min的峰1和37.08 min峰2未在山羊乳（圖1a）中出現(xiàn)，通過在NIST譜庫進行檢索，發(fā)現(xiàn)這2 個峰與N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基半乳糖的相似度最高，均為91%。通過與上述兩種化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖進行比對，峰1和峰2均被鑒定為N-乙酰氨基葡萄糖（圖1c），牛乳樣品色譜圖峰1和峰2中N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品和N-乙酰氨基半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜圖分別顯示在圖2A、B、C中。因此，牛乳區(qū)別于山羊乳的關(guān)鍵非蛋白生物標(biāo)志物可準(zhǔn)確判定為N-乙酰氨基葡萄糖。由于糖的硅烷化衍生物穩(wěn)定性差，且存在雙峰，因此導(dǎo)致難以準(zhǔn)確定量。有文獻報道N-乙酰氨基葡萄糖PMP柱前衍生結(jié)合高效液相色譜進行定量分析，衍生物穩(wěn)定，且呈現(xiàn)單峰[35-38]。

2.2 山羊乳中摻加的牛乳測定

2.2.1 衍生物的色譜分離

如圖3所示，在所建立的色譜條件下，目標(biāo)物實現(xiàn)了基線分離，峰形尖銳對稱，無明顯前沿和拖尾現(xiàn)象。將山羊乳和牛乳PMP衍生物色譜圖與N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生物色譜圖（圖3c）進行對比，發(fā)現(xiàn)N-乙酰氨基葡萄糖僅存在于牛乳（圖3b）中，保留時間為23.90 min，而在山羊乳（圖3a）中未發(fā)現(xiàn)該色譜峰，因此再次證實N-乙酰氨基葡萄糖為牛乳區(qū)別于山羊乳的關(guān)鍵非蛋白生物標(biāo)志物。據(jù)此，按照建立的色譜條件進行后續(xù)分析。

圖3 不同樣品PMP衍生產(chǎn)物的高效液相色譜圖Fig. 3 High performance liquid chromatograms of PMP derivatives of goat milk, cow milk and N-acetylglucosamine

2.2.2 衍生時間的確定

圖4 最佳衍生時間的確定Fig. 4 Determination of optimal derivatization duration

如圖4所示，當(dāng)衍生時間達到60 min后，N-乙酰氨基葡萄糖衍生物的響應(yīng)值達到最高水平，進一步延長衍生時間未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)值有顯著提高（P＜0.05），表明衍生反應(yīng)在60 min內(nèi)已經(jīng)進行得很充分，因此60 min應(yīng)為最佳衍生時間。

2.2.3 衍生物的穩(wěn)定性

與初始濃度相比，N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP衍生物在24 h內(nèi)一直穩(wěn)定（圖5A），在不同時間點檢測到的濃度無顯著差異（P＞0.05）。與此不同，在牛乳基質(zhì)中，N-乙酰氨基葡萄糖衍生物在衍生后的12 h內(nèi)穩(wěn)定，響應(yīng)值無顯著衰減（P＞0.05）（圖5B），但在24 h后其相對濃度顯著降低（P＜0.05），為初始濃度的94%。這是由于牛乳基質(zhì)成分復(fù)雜，所含其他成分可能影響了目標(biāo)物的穩(wěn)定性。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)溶液和牛乳樣品中N-乙酰氨基葡萄糖的PMP衍生物在室溫下的穩(wěn)定性Fig. 5 Stability of PMP derivatives of N-acetylglucosamine in standard solution and in cow milk at room temperature

2.2.4 牛乳中N-乙酰氨基葡萄糖含量測定

使用確定的PMP衍生條件和高效液相色譜程序?qū)εＨ闃悠分蠳-乙酰氨基葡萄糖含量進行分析，結(jié)果顯示其質(zhì)量濃度為（148.2±4.8）mg/L。

2.2.5 熱處理對牛乳中N-乙酰氨基葡萄糖含量的影響

圖6 加熱時間對牛乳中N-乙酰氨基葡萄糖含量的影響Fig. 6 Effect of heating time on the content of N-acetylglucosamine in cow milk

如圖6所示，經(jīng)沸水浴加熱60 min后，牛乳中N-乙酰氨基葡萄糖含量與加熱前相比無統(tǒng)計學(xué)顯著差異（P＞0.05），說明熱處理對牛乳中N-乙酰氨基葡萄糖含量無顯著影響。

2.2.6 方法學(xué)評價結(jié)果

2.2.6.1 檢出限、定量限和線性范圍結(jié)果

表1 方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Calibration equation, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantification for the method

如表1所示，該方法檢出限和定量限分別為0.3%和1.0%的牛乳添加量。以N-乙酰氨基葡萄糖的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，牛乳添加量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)高于0.999 0。山羊乳中摻加的牛乳在定量限至100%的范圍內(nèi)顯示了良好的線性關(guān)系，方法最低可準(zhǔn)確檢測羊乳中摻加的1%牛乳。Iverson等[22]開發(fā)了以牛DNA為目標(biāo)物的檢測羊乳中摻加的牛乳的方法，其可以檢測到山羊乳中摻加的0.01%的牛乳；Ma Yongjie等[14]報道一種基于毛細(xì)管電泳法識別羊乳中摻加的牛乳的技術(shù)，最低可檢測5%的牛乳摻加量；Ke Xing等[11]基于牛乳和羊乳在β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)上的差異使用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法對羊乳摻假進行了檢測，檢出限為5%的牛乳添加量。在文獻報道的檢測方法中，牛乳添加量的最低檢出水平在0.01%～5%之間，但由于過低的牛乳摻加量并不會帶來實際經(jīng)濟利益，因此能夠檢測到1%的摻加水平已經(jīng)能夠滿足實際應(yīng)用。

2.2.6.2 準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果

表2 方法的準(zhǔn)確度和精密度Table 2 Accuracy and precision for the method

向山羊乳中分別加入3 種不同質(zhì)量濃度的N-乙酰氨基葡萄糖，按照所建立的衍生方法和色譜程序?qū)δ繕?biāo)物進行檢測。如表2所示，N-乙酰氨基葡萄糖的加標(biāo)回收率在100.4%～105.1%之間，日內(nèi)精密度介于1.7%～2.6%之間，日間精密度在2.0%～3.7%范圍內(nèi)，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度均較高。

3 結(jié) 論

本研究成功挖掘到牛乳區(qū)別于山羊乳的關(guān)鍵非蛋白生物標(biāo)志物——N-乙酰氨基葡萄糖，并建立了一種以該標(biāo)志物為靶標(biāo)的基于高效液相色譜手段定量檢測山羊乳中摻加的牛乳的方法。該方法具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度，為山羊乳中摻加牛乳的定性識別及定量檢測提供了有效技術(shù)手段，將為我國山羊乳產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。