肉眼讀取-熒光微球競爭免疫層析法半定量快速檢測保健食品中的西布曲明

譚貴良，潘子強(qiáng)，張世偉，胡 敏，馮榮虎，楊懋勛

（1.電子科技大學(xué)中山學(xué)院，廣東 中山 528402；2.深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東 深圳 518102；3.廣東省生態(tài)環(huán)境技術(shù)研究所，廣東 廣州 510650；4.廣東江門中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，廣東 江門 529030）

西布曲明作為一種合成類減肥藥，化學(xué)式為C17H26ClN，在臨床醫(yī)學(xué)上主要用于肥胖癥的治療，通過控制神經(jīng)中樞抑制食欲。主要作用機(jī)制是抑制去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺的再攝取，增加突觸間隙去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺的濃度，進(jìn)而使下丘腦飽食中樞興奮，抑制食欲，降低碳水化合物的吸收，減輕體質(zhì)量[1-2]。長期服用西布曲明可導(dǎo)致眩暈、抑郁、焦慮和協(xié)調(diào)功能下降等嚴(yán)重精神癥狀，甚至具有非致死性心臟病發(fā)作、非致死性中風(fēng)等嚴(yán)重心血管疾病風(fēng)險[3-4]?！吨腥A人民共和國食品安全法》第三十八條明確規(guī)定，生產(chǎn)經(jīng)營的食品中不得添加藥品，即不得在保健食品中添加藥物成分。然而由于西布曲明良好的減肥效果，導(dǎo)致減肥類保健食品特別是網(wǎng)絡(luò)出售的減肥類食品中非法添加西布曲明的案例屢見不鮮。

目前國內(nèi)外檢測西布曲明及其類似物的方法主要有液相色譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-8]、離子遷移譜法[9-10]、離子遷移譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]、流動注射電化學(xué)發(fā)光法[12]、毛細(xì)管電泳法[13]、紅外光譜法[14-15]等。盡管這些方法能夠檢測西布曲明及其類似物，但所用儀器大多昂貴，樣品需前處理，耗時長，對環(huán)境有污染。基于抗原、抗體特異性反應(yīng)的免疫層析方法以其低成本、便捷等優(yōu)點，成為當(dāng)前食品安全快速檢測領(lǐng)域中常用的分析方法，廣泛應(yīng)用于毒素、獸藥等的快速檢測[16-18]?；诿庖邔游龇椒z測西布曲明鮮見報道，Suryoprabowo等[19]建立基于膠體金的西布曲明免疫層析檢測方法，用于減肥茶和咖啡中西布曲明的定性快速檢測。

近年來隨著標(biāo)記材料的發(fā)展，免疫層析法邁入定量檢測階段[20-22]。然而這些量化數(shù)據(jù)仍然需要專門的掃描儀進(jìn)行讀取，儀器不便攜帶且增加了檢測成本。不借助儀器對目標(biāo)物進(jìn)行量化分析正成為當(dāng)前一個新的研究熱點。近期有研究通過設(shè)置多條包被有捕捉抗體的T線，實現(xiàn)了與待測物正相關(guān)的梯度顯色，從而分別建立降鈣素原和馬鈴薯病毒X的免疫層析半定量檢測方法[23-24]。然而該方法必須使用2 個抗體識別一個待測物，不適合于西布曲明等小分子檢測。Fu Xiaoxiang等[25]認(rèn)為通過不斷稀釋，實驗得出達(dá)到方法檢出限所需的稀釋倍數(shù)，也可估算出待測物濃度，缺點是過于耗時。競爭免疫層析方法作為包被抗原、抗體和待測物共同組成的三元體系，通過梯度減少抗體濃度，可改變方法的靈敏度。基于此原理，本研究提出一種新的西布曲明免疫層析檢測模式，通過設(shè)置4 條包被有抗原的檢測線，梯度降低抗體的反應(yīng)濃度，在單一試紙條構(gòu)建多級靈敏度的免疫反應(yīng)，結(jié)合熒光納米顆粒（熒光微球）[26-27]的高靈敏特性，構(gòu)建基于普通熒光手電照射肉眼直接讀取的西布曲明免疫層析半定量檢測方法，檢測模式及原理見圖1。本方法是熒光微球競爭免疫層析技術(shù)在西布曲明檢測中的首次應(yīng)用。

圖1 西布曲明目視讀取-免疫層析檢測法及試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the fluorescent immunochromatography combined with naked eye reading for semi-quantitative assay of sibutramine

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝酸纖維（nitrocellulose，NC）膜、熒光硅球墊、樣品墊、吸水紙、PVC底板 美國Millipore公司；氨基修飾的熒光微球（材質(zhì)為聚苯乙烯）（直徑0.2 μm、激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm） 上海輝質(zhì)生物科技有限公司；西布曲明類標(biāo)準(zhǔn)品（西布曲明、N-單去甲基西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明、芐基西布曲明、豪莫西布曲明） 加拿大TRC公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；西布曲明單克隆抗體和西布曲明抗原 深圳市三方圓生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

圖片拍攝使用智能手機(jī)，攝像頭覆蓋（540±25）nm濾光片（美國BioTek公司）；（470±30）nm 100 mW LED熒光手電筒 浙江隆業(yè)電器科技有限公司；XYZ3100點膜儀 美國Bio-Dot公司；Milli-Q水處理系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 西布曲明抗體-熒光微球偶聯(lián)物制備

將熒光微球、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺按1∶1∶1的比例投料，并加入1 000 倍質(zhì)量的去離子水。活化過夜后，離心去除上清液加入pH 7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）重懸。以保護(hù)標(biāo)記法[28]將熒光微球偶聯(lián)至西布曲明抗體。標(biāo)記完成后，西布曲明抗體-熒光微球偶聯(lián)物離心去除上清液，加入復(fù)溶液（含1% BSA、2%蔗糖、0.05% PEG 20000、0.5% Tween-20、0.1% proclin 300的0.01 mol/L pH 7.4 PBS）重懸抗體-熒光微球偶聯(lián)物。在聚苯乙烯微孔中加入2 μg西布曲明抗體-熒光微球偶聯(lián)物（以熒光微球質(zhì)量計），凍干后作為反應(yīng)杯。

1.3.2 熒光試紙條的制備

熒光試紙條如圖1所示。將西布曲明包被抗原（0.2 mg/mL）按圖1所示劃4 條平行線于NC膜上，從上到下分別記為檢測1～4線。于37 ℃真空干燥12 h，室溫真空干燥12 h。最后將吸水紙和NC膜貼在PVC底板上，用自動切條機(jī)切成4 mm寬的試紙條，室溫條件下真空干燥，備用。

1.3.3 試紙使用方法及檢出限

在反應(yīng)杯中加入100 μL樣品液體，攪拌均勻，在不小于15 ℃的室溫環(huán)境中反應(yīng)5 min。將微孔中的液體轉(zhuǎn)移至檢測卡的加樣孔中，層析10 min，熒光手電照射后觀察結(jié)果。4 條檢測線同時顯色結(jié)果為陰性，檢測1線消失時結(jié)果為陽性。用不同質(zhì)量濃度的西布曲明標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到檢測卡上，分別記錄檢測1～4線消失的質(zhì)量濃度為標(biāo)志參考，其中僅檢測1線剛好消失的質(zhì)量濃度為該試紙檢測方法的檢出限。

1.3.4 前處理及上樣

取樣品1.00 g，加入9 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS中，沉淀5 min（或2 000×g離心1 min），取上清液100 μL為待測液，加入到反應(yīng)杯中，反應(yīng)后上樣，進(jìn)行免疫層析分析。

1.3.5 真實樣品的方法比對

使用本研究建立的方法和BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的測定》[29]規(guī)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）法，對網(wǎng)絡(luò)采購聲稱有減肥功效的50 份食品、保健食品進(jìn)行對照檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，Origin 8.0軟件（Origin Lab公司）作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑對顯色效果的影響

圖2 吐溫-20對試紙條顯色效果的影響Fig. 2 Effect of Tween-20 concentration on the strip test’s sensitivity

本研究所建立的目視讀取熒光半定量免疫層析檢測法是以標(biāo)記抗體依次結(jié)合4 條檢測線為原理，判斷藥物對標(biāo)記抗體的抑制程度，從而估算樣品中的藥物含量。由于需要盡可能使標(biāo)記抗體和依次經(jīng)過的檢測線充分反應(yīng)，所以層析速度比單檢測線層析慢。表面活性劑可以增加標(biāo)記抗體在層析體系中的分散性，從而增加層析速度。本研究首先選用單檢測線免疫層析中常用的含0.5%吐溫-20的復(fù)溶液，上樣后8 min即可達(dá)到顯色穩(wěn)定。如圖2所示，0.5%吐溫-20的反應(yīng)體系使層析速度過快，標(biāo)記抗體不能和檢測線上的包被抗原充分反應(yīng)，導(dǎo)致多條檢測線弱顯色。而吐溫-20含量過低（0.02%），標(biāo)記抗體分散性較差，無法順利層析。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.1%吐溫-20的反應(yīng)體系下，可獲得最佳的顯色效果，即該處理下條帶顯示清晰且條帶數(shù)較少。

2.2 NC膜對顯色效果的影響

圖3 NC膜對試紙條顯色效果的影響Fig. 3 Effect of NC membrane type on the strip test’s sensitivity

NC膜是影響免疫層析速度的另外一個因素，其孔徑越大層析速度越快。本研究選用了3 種常用于免疫層析的膜，按孔徑由大到小分別為Sartorius CN95、Sartorius CN140、Pall vivid 170。經(jīng)測試，由于Pall vivid 170膜孔徑過小，導(dǎo)致本研究所用的熒光納米顆粒在該膜上發(fā)生層析阻滯。但Sartorius CN95由于流速過快，待測物顯色效果不及在Sartorius CN140膜（圖3）。本研究也通過調(diào)節(jié)表面活性劑吐溫-20含量，以降低Sartorius CN95的流速，但是表面活性劑調(diào)節(jié)至0.02%時，在Sartorius CN95上同樣出現(xiàn)了層析阻滯（結(jié)果未顯示）。因此本研究采用Sartorius CN140作為試紙條NC膜。

2.3 抗體和抗原質(zhì)量濃度對靈敏度的影響

研究發(fā)現(xiàn)上樣的抗體（西布曲明抗體-熒光微球偶聯(lián)物）質(zhì)量濃度以及試紙條包埋的抗原質(zhì)量濃度對檢測靈敏度具有重要影響，優(yōu)化免疫層析體系中抗體、抗原質(zhì)量濃度是目視讀取熒光半定量免疫層析檢測法成功與否的關(guān)鍵。結(jié)果表明，檢測線抗原質(zhì)量濃度或熒光標(biāo)記抗體量過低，將會導(dǎo)致無法獲得清晰的檢測線，而且還會導(dǎo)致定量試紙條穩(wěn)定性差且保質(zhì)期較短；相反它們質(zhì)量濃度過高，雖然能獲得清晰的檢測線（強(qiáng)顯色），但因為抗原或抗體的過量，也會影響競爭免疫檢測方法的靈敏度。如表1所示，當(dāng)熒光標(biāo)記抗體量為2 μg和檢測線抗原質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL時，能獲得清晰的檢測線，此時靈敏度最高，檢出限低至0.05 μg/mL；而熒光標(biāo)記抗體量和檢測線抗原質(zhì)量濃度均翻倍時（即抗體4 μg、抗原為0.4 μg/mL），盡管檢測線上具有較強(qiáng)的顯色，但是試紙條能達(dá)到的最低檢測質(zhì)量濃度卻差了40 倍，只能達(dá)到2.0 μg/mL。本研究最終選取熒光標(biāo)記抗體量為2 μg，檢測線抗原質(zhì)量濃度為0.2 μg/mL。

表1 抗體量和抗原質(zhì)量濃度的正交分析Table 1 Orthogonal array design for the optimization of antibody and antigen concentration

2.4 層析時間的確定

圖4 西布曲明熒光免疫層析動態(tài)熒光曲線Fig. 4 Dynamic fluorescent curves of sibutramine in fluorescent immunochromatography

免疫層析是一個動態(tài)反應(yīng)的過程，因此確定合適的層析時間既關(guān)系到結(jié)果的準(zhǔn)確也影響到檢測時效。本研究使用純水和0.05 μg/mL西布曲明溶液作為待測液，使用熒光掃描儀分別掃描檢測1線和檢測2線。如圖4所示，免疫層析在10 min時達(dá)到平衡，因此10 min作為本方法的最佳層析時間。

2.5 檢測方法評估

目視讀取熒光免疫層析半定量檢測方法的優(yōu)點在于不需要使用復(fù)雜的分析儀器。本研究在方法評估時采用價格便宜且便攜的LED熒光手電作為激發(fā)光源，在濾光片的輔助下目視讀取熒光信號。濾光片的作用是濾除雜光，以得到清晰的條帶。圖5顯示在暗室下采用手機(jī)（攝像頭覆蓋（540±25）nm濾光片）對熒光微球免疫層析試紙條進(jìn)行拍照的結(jié)果。0.05 μg/mL西布曲明可將檢測1線完全抑制消帶，為試紙條西布曲明的最低檢測限；在9.00 μg/mL時4 條檢測線均不可見，為該方法檢測西布曲明的最大質(zhì)量濃度值。如果樣品中西布曲明質(zhì)量濃度過高（大于9.00 μg/mL），將會導(dǎo)致4 條檢測線均不可見，需要再次稀釋100 倍，使待測液中西布曲明的質(zhì)量濃度在試紙條的檢測范圍內(nèi)（0～9.00 μg/mL）?；谏鲜鰲l件，計算得到實際樣品的檢出限為0.5 mg/kg，這與目前報道的西布曲明膠體金免疫層析方法的檢出限相當(dāng)[19,30]。

圖5 西布曲明檢出限和最大可檢出質(zhì)量濃度Fig. 5 Limit of detection and maximum detectable concentration of sibutramine

表2 與各減肥類藥物的交叉反應(yīng)率Table 2 Cross-reactivity of the method with various weight-reducing drugs

西布曲明屬于一類結(jié)構(gòu)相似功能相近的藥物家族，常見的還包括N-單去甲基西布曲明、N,N-雙去甲基西布曲明、芐基西布曲明和豪莫西布曲明。本研究依據(jù)BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的測定》[29]，測試其中列出的違法添加減肥降脂類化合物的交叉反應(yīng)。該方法對西布曲明家族藥物均有交叉反應(yīng)，和其他常見違法添加在保健食品中的減肥降脂類化合物無交叉反應(yīng)（表2）。說明該方法對西布曲明類藥物具有良好的廣譜特異性。

2.6 實際樣品檢測結(jié)果

分別采用本研究新建立的目視讀取熒光免疫層析法和BJS 201701《食品中西布曲明等化合物的測定》[29]LCMS/MS法對網(wǎng)絡(luò)購買的50 份聲稱有減肥功效的食品、保健食品樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，目視讀取熒光半定量免疫層析法檢測到西布曲明類藥物的樣品有10 份（檢出率為20%），未檢出的有40 份，而且其中有一個樣品（樣品6）非法添加的單去甲基西布曲明也能被檢出，未觀察到假陽性，該目視讀取熒光免疫層析法與LC-MS/MS法的檢測結(jié)果完全一致。表3顯示，在被檢出的10 個陽性樣品中，所有的LC-MS/MS確證結(jié)果均能落在目視讀取免疫層析法的半定量區(qū)間內(nèi)，表明這2 種方法具有良好的正相關(guān)性。由此可見，目視讀取免疫層析法能夠滿足西布曲明快速定性、半定量檢測的需求，可為后續(xù)LC-MS/MS的確證工作提供參考依據(jù)。

表3 2 種方法檢測食品中西布曲明含量（n=6）Table 3 Sibutramine contents in actual samples detected by the developed method and LC-MS/MS (n= 6)

3 結(jié) 論

本研究建立可基于肉眼直接讀取結(jié)果的西布曲明半定量熒光微球競爭免疫層析檢測方法。研究通過梯度降低競爭免疫層析反應(yīng)體系中抗體的質(zhì)量濃度，在單一試紙條中完成多個靈敏度不同的免疫反應(yīng)，檢測條帶的顯示數(shù)目隨著目標(biāo)待測物質(zhì)量濃度的增加而逐漸減少，實現(xiàn)依靠普通熒光手電照射、肉眼直接讀取結(jié)果的定性、半定量西布曲明檢測方法。該方法通過試紙條上顯色條帶的數(shù)量即可對西布曲明進(jìn)行半定量分析，方法簡單、方便、成本低、靈敏度高，方法靈敏度與現(xiàn)有的西布曲明膠體金免疫層析方法相當(dāng)，定性上未發(fā)現(xiàn)假陽性或假陰性，同時在定量結(jié)果具有一定的參考意義，能滿足西布曲明快速篩查的需要。本研究提出的免疫層析半定量檢測模式具有通用性，不僅適用于西布曲明檢測，也能為其他藥物的半定量檢測提供新的研究思路。