定點突變提高β-木糖苷酶Xln-DT 的酶活

李 琦， 童欣怡， 姜云鵬， 蔣玉潔， 李冬冬， 趙林果

（1. 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210037；2. 南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京210037）

β-木糖苷酶（1，4-β-D-xylan xylohydrolase，EC 3.2.1.37）常與內(nèi)切木聚糖酶聯(lián)用，降解富含木聚糖的農(nóng)林植物纖維原料，繼而將木糖開發(fā)成可用于燃料、食品等行業(yè)中的系列化學(xué)品[1-2]。 此外，β-木糖苷酶也被越來越多地應(yīng)用于植物資源中帶有木糖基的天然活性物質(zhì)（如萜類、黃酮類、甾體類化合物）的生物轉(zhuǎn)化，進而獲得更強藥理活性的天然產(chǎn)物衍生物[3-5]。 無論是木聚糖的降解還是天然活性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，獲得活性高、專一性強、酶學(xué)性質(zhì)優(yōu)異的β-木糖苷酶是關(guān)鍵的技術(shù)。

近年來，學(xué)者們已就β-木糖苷酶的來源、優(yōu)良菌種的篩選、基因克隆和表達等方面進行了大量的深入研究[6-7]。 然而，現(xiàn)有的β-木糖苷酶仍存在著含量少、酶活低、穩(wěn)定性差、底物特異性不佳等缺點，遠不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷革新，酶分子的體外定向進化技術(shù)已成為蛋白酶分子改造的有力工具[8]。 周海巖等[9]利用定點飽和突變技術(shù)將L-脯氨酸-4-羥化酶（P4H）的酶活提高了58%。 秦海彬等[10]在α-酮戊二酸半醛脫氫酶E120 位點處引入了天冬氨酸后， 酶活提高了322%。 蔡劉滕子等[11]利用定點突變技術(shù)對黑曲霉來源的木聚糖酶進行熱穩(wěn)定性改造，突變酶的最適溫度提高了5 ℃，45 ℃下的半衰期由7 min 提高到15 min。李琦等[12]通過定點突變技術(shù)在木聚糖酶MxynB的相應(yīng)位置引入二硫鍵， 并通過基因融合技術(shù)在N端融合了來源于嗜熱菌的纖維素結(jié)合域CBD，使原酶的溫度穩(wěn)定性顯著提高。

由于嗜熱菌D. thermophilum 來源的β-木糖苷酶Xln-DT[13]在大腸桿菌中的表達量較低，筆者通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬和分子對接等手段確定了β-木糖苷酶Xln-DT 可突變的位點。 利用反向PCR 技術(shù)擴增突變基因、 構(gòu)建重組表達載體并獲得突變酶，并對比分析了突變前后的酶學(xué)性質(zhì)， 旨在獲得酶活高、耐熱性能強的優(yōu)勢突變酶，為后續(xù)的實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

大 腸 桿 菌Escherichia coli Top10F′ 、 E.coli BL21（DE3）和重組質(zhì)粒pET28a-xln-DT：均由南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院微生物技術(shù)研究室保藏；表達質(zhì)粒pET28a（卡那霉素（kana）抗性）：購自美國Novagen 公司。

1.2 培養(yǎng)基

Lysogeny broth（ LB）培養(yǎng)基：蛋白胨1 g、酵母提取物0.5 g、NaCl 1 g，溶于100 mL 蒸餾水中，121℃滅菌20 min 后備用，主要用于大腸桿菌菌種的活化及重組基因工程菌株的誘導(dǎo)表達。LB 固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分數(shù)2%的瓊脂。

1.3 酶和化學(xué)試劑

Prime STAR HS DNA 聚 合 酶、T4 DNA 磷 酸 化激酶、T4 DNA 連接酶、dNTP、DL 5 000 DNA Marker等：購自日本TaKaRa 公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準Marker： 購自美國Promega 公司； 質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、卡那霉素等：購自美國Axygen公司；胰蛋白胨、酵母提取物：購自英國Oxoid 公司；對硝基苯基-β-L-木糖苷（p NPX）：購自美國Sigma公司；其它常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。 引物合成及測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 主要儀器

PCR 儀：德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；5415R 臺式高速冷凍離心機、SX-500 全自動高溫高壓蒸汽滅菌鍋：日本Tomy 產(chǎn)品；凝膠成像儀：美國Bio-rad 公司產(chǎn)品；ZHWY-2102C 搖床： 上海智誠產(chǎn)品；SpectraMax190 全波長酶標儀： 美國Molecular Devices 公司產(chǎn)品。

1.5 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測和相關(guān)軟件

利用分子生物學(xué)軟件DNAMAN 6.0 進行氨基酸序列分析并進行Blast 比對。 利用PyMOL、Swiss Model 和I-TASSER Server 軟件進行Xln-DT 蛋白結(jié)構(gòu)模擬和活性催化中心預(yù)測。

基于I-TASSER Server 對Xln-DT 蛋白結(jié)構(gòu)進行 預(yù)測[14]，在I-TASSER Server 在線網(wǎng)站（https：//zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）上輸入β-木糖苷酶Xln-DT 的氨基酸序列， 得到蛋白質(zhì)的三維預(yù)測結(jié)果及配體結(jié)合位點的具體信息。

1.6 酶與底物的分子對接

從Pubchem 下載p NPX 分子2D 結(jié)構(gòu)[15]，并以Sdf 格式保存，使用Schrodinger 2015 對p NPX 和β-木糖苷酶Xln-DT 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行預(yù)處理， 并使用Glide 6.6[16]在該蛋白質(zhì)的配體結(jié)合位點處準備晶格文件，根據(jù)1.5 中獲得的配體結(jié)合位點，將晶格中心坐標設(shè)置為x：80.92，y：91.18，z：82.72， 配體對接框長度2.0 nm，蛋白質(zhì)的范德華半徑比例因子設(shè)為0.8，絕對部分電荷的截斷值設(shè)為0.15。 最后將預(yù)處理好的小分子p NPX 在晶格文件中進行對接， 軟件運行后獲得優(yōu)化的預(yù)測對接構(gòu)象。

1.7 氨基酸親和性提高突變位點預(yù)測

基于分子對接的結(jié)果， 使用BioLuminate 1.8[17]對p NPX 周圍的氨基酸（活性口袋處的氨基酸）進行飽和突變，計算突變前后的親和力變化，具體原理見圖1。根據(jù)突變能由高到低排序，挑選出突變能排序靠前的突變位點進行后續(xù)突變實驗。 計算時，將突變的氨基酸看作配體，余下的所有氨基酸看作受體。 在此情況下，親和力的改變可以用突變能ΔΔG（bind）來表征，該數(shù)值的負值代表著突變體比母體對小分子結(jié)合的更緊密。 具體計算公式為：

式（1）中，ΔG1為非突變體自由能變化，kJ/mol；ΔG2為 突 變 體 自 由 能 變 化，kJ/mol；ΔG3為BioLuminate 1.8 軟件計算得出的非突變體和突變體之間的自由能變化，kJ/mol；ΔG4為BioLuminate 1.8 軟件計算得出的結(jié)合配體后非突變和突變體之間的自由能變化，kJ/mol。

圖1 蛋白質(zhì)親和力改變的突變能計算原理圖Fig. 1 Schematic diagram of mutation energy calculation for protein affinity change

1.8 實驗方法

1.8.1 定點突變引物設(shè)計 利用同源建模、生物信息學(xué)分析、分子對接等手段，改變β-木糖苷酶Xln-DT 的部分氨基酸， 設(shè)計突變位點， 以嗜熱菌D. thermophilum DSM 3960 的GH39 家族的β-木糖苷酶基因序列xln-DT 為模板， 設(shè)計帶有酶切位點的引物，每個突變位點設(shè)計正反向兩條寡核苷酸序列，見表1。 利用反向PCR 技術(shù)獲得突變序列。

表1 定點突變引物表Table 1 Nucleotide sequences of used primers

1.8.2 定點突變實驗方案 將上、 下游引物用TE緩沖溶液稀釋成10 μmol/L 工作液，以pET28a-xln-DT 為模板， 利用反向PCR 技術(shù)獲得重組突變表達質(zhì)粒。

PCR 反應(yīng)體系如下：0.5 μL pET28a-xln-DT，各1.0 μL 的引物F 和引物R，4.0 μL dNTP Mixture，10.0 μL 5×PS 緩沖液，0.5 μL Prime STAR HS DNA聚合酶，44 μL 蒸餾水。

PCR 反應(yīng)條件如下：98 ℃保溫5 min，98 ℃變性0.5 min，60 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸4.5 min，18個循環(huán)，72 ℃延伸10 min 后于4 ℃保持。 將擴增后PCR 片段于37 ℃下磷酸化反應(yīng)1 h， 加入1 μL T4 ligase 連接酶，于16 ℃下連接3 h 后在42 ℃水浴鍋中熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli Top 10F′感受態(tài)細胞中，挑取單菌落接入到含有Kana 抗性的LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行測序鑒定。

1.9 突變酶的酶活測定、純化及SDS-PAGE 分析

將測序正確的重組表達質(zhì)粒pET-28a-xln-DT-161、pET-28a-xln-DT-167、pET-28a-xln-DT-202 和pET-28a-xln-DT-231 熱擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中。 挑取單菌落至5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中， 加入0.01 mmol/L 的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）過夜誘導(dǎo)表達后離心，沉淀加入檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）重懸，經(jīng)超聲破碎后離心10 min，上清液即為粗酶液。將收集的粗酶液進行酶活測定，以pNPX 為底物，根據(jù)文獻[18]進行酶活測定。酶活定義如下：75 ℃、pH 6.0 時每分鐘產(chǎn)生摩爾質(zhì)量為1 mmol 對硝基苯酚所需的酶量為1 個酶活單位。

酶的純化方式如下：Ni2+親核層析柱平衡后，將粗酶液以1 mL/min 上樣，將25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液以同流速洗去未吸附的酶蛋白及雜質(zhì)； 隨后用200 mmol/L 的咪唑緩沖液進行洗脫， 并收集蛋白質(zhì)；純化后的酶液經(jīng)透析除鹽后進行SDS-PAGE 分析。 目的蛋白質(zhì)采用Bradford 法進行蛋白質(zhì)濃度的測定。 酶活（A）以及比酶活（B）的計算公式如下：

式中：c 為由對硝基苯酚標準方程計算出的酶反應(yīng)后的對硝基苯酚的量，μmol；t 為酶與底物反應(yīng)時間，min；V1為反應(yīng)體系總體積，mL；V2為酶液體積，mL；N 為酶液稀釋倍數(shù)；C 為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.10 突變酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

最適溫度： 在pH 6.0 的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中，分別測定突變酶和Xln-DT 在65、70、75、80、85℃下的酶活， 以測定的最高酶活為100%計算相對酶活，最高酶活對應(yīng)的溫度即為最適溫度。

最適pH：在各自的最適溫度下，分別測定突變酶和Xln-DT 在pH 值為4.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 下的酶活，以測定的最高酶活為100%計算相對酶活，最高酶活對應(yīng)的pH 即為最適pH。

溫度穩(wěn)定性： 將酶質(zhì)量濃度分別為1.10、1.25、1.29、1.09 mg/mL 的野生型酶Xln-DT、突變酶Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU、Xln-DT-167ALA 在75、85 ℃下分別保溫30、60、90、120、180、240 min，以未育溫的酶液所測定的酶活為100%計算剩余酶活力，即為溫度穩(wěn)定性。

pH 穩(wěn)定性：在4 ℃下，分別將突變酶和Xln-DT置于不同pH 值（4.0～7.0）的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中保存24 h， 在最適溫度及最適pH 下測定其殘余酶活力， 以未經(jīng)pH 緩沖液處理的酶液所測定的酶活為相對100%，即為pH 穩(wěn)定性。

耐木糖系數(shù)Ki：在添加不同濃度木糖的反應(yīng)體系中，在最適溫度和pH 下測定突變酶和Xln-DT 的酶活力值，以不加糖所測的酶活力值為100%，計算并獲得不同木糖濃度下重組酶的相對酶活力值，以相對酶活力值為50%時所對應(yīng)的木糖濃度即為Ki。

動力學(xué)常數(shù)：以p NPX 為底物，底物濃度范圍為0.01～3.00 mmol/L， 分別測定純化后的突變酶和Xln-DT 的酶活。采用雙倒數(shù)作圖法[19]計算突變酶和Xln-DT 的動力學(xué)參數(shù)（Vmax，Km，Vmax/ Km）。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變位點的選擇

由于嗜熱菌D. thermophilum 來源的Xln-DT蛋白結(jié)構(gòu)尚未解析，基于PDB 在線數(shù)據(jù)庫中來源于Thermoanaerobacterium saccharolyticum 的GH 39 家族的β-木糖苷酶XynB （1UHV）[20]與Xln-DT 具有70.18%的同源性。 利用Swiss-Model 在線軟件對Xln-DT 進行同源建模，使用可視化工具PyMOL 對Xln-DT 進行結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果見圖2。 利用Glide 6.6軟件對人工底物p NPX 與β-木糖苷酶Xln-DT 進行分子對接，計算篩選出3 個正相關(guān)的關(guān)鍵突變位點（GLU161、CYS202 和TYR231） 和1 個陰性對照位點（PHE167），見表2。

圖2 β-木糖苷酶Xln-DT 的分子模型Fig. 2 Molecular model of Xln-DT

表2 Xln-DT 突變能計算Table 2 Calculation of Xln-DT mutation energy (binding)

2.2 突變體重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建和表達

以重組表達質(zhì)粒pET-28a-Xln-DT 為模板，通過反向PCR 引入6 個位點的氨基酸基因，經(jīng)測序驗證所有點突變編碼正確。 將突變正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，隨機挑取轉(zhuǎn)化子進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)表達結(jié)果見圖3。 當GLU161 突變成HIS 和LEU、TYR231 突變成TRP 之后， 酶活喪失， 而CYS202 突變成PHE 和LEU 后酶活分別提高了3.28 和2.97 倍， 而PHE167 突變成ALA 之后酶活降低了50%。 結(jié)合表2 中突變能的預(yù)測數(shù)值可知， 除去經(jīng)試驗驗證的酶活喪失的陰性突變體GLU161HIS、TYR231TRP、GLU161LEU 外， 突變體CYS202PHE、CYS202LEU、PHE167ALA 的ΔΔG 逐次升高，分別為-1.22、-1.15、1.33，而實驗結(jié)果顯示這3 個突變體表達的酶活則依次降低，由此可見ΔΔG 的數(shù)值為負值且數(shù)值越小，突變體比野生型原酶對小分子的結(jié)合越緊密，理論上較野生型原酶的親和力就越強，從而可通過提高突變體的比酶活來提高表達的酶活力。 因此，為了驗證此猜想，作者對各突變體及野生型原酶進行了純化，以比較其比酶活、動力學(xué)參數(shù)等。

圖3 酶活提高關(guān)鍵位點突變后的酶活Fig. 3 Enzyme activity after mutation of key site for enzyme activity improvement

收集發(fā)酵后的Xln-DT 及突變體經(jīng)鎳柱純化后， 獲得電泳純的Xln-DT、Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU 和Xln-DT-167ALA 多位點突變體，見圖4。 將純化后的Xln-DT 和突變體分別測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度和比酶活，其中，CYS202 突變成PHE 和LEU 后，比酶活分別提高了2.86 和2.54 倍，由此可知，202 位點為酶活提高的關(guān)鍵氨基酸位點。

圖4 重組酶Xln-DT 及突變體的蛋白質(zhì)電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE of recombinant protein Xln-DT and 202/167 mutants

2.3 突變體的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 突變體的最適溫度和最適pH 突變體酶和Xln-DT 的最適溫度見圖5（a）。 Xln-DT 的最適溫度為75 ℃， 突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-167ALA 的最適溫度維持不變，而Xln-DT-202LEU則升高至80 ℃。

突變體酶和Xln-DT 的最適pH 見圖5（b）。Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的最適pH 由原酶的6.0 分別下降至4.5 和5.0， 而Xln-DT-167ALA 則降為5.0。

圖5 202/167 突變體的最適溫度和最適pHFig. 5 Optimal temperature and p H values of 202/167 mutants

2.3.2 突變體的溫度穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性 對突變體酶和Xln-DT 在75、85 ℃下的熱穩(wěn)定性進行研究，結(jié)果見圖6。突變體Xln-DT-202PHE 在75 ℃下的溫度穩(wěn)定性有顯著提高，保溫2 h 后，剩余酶活力仍能保持100%。 而突變體Xln-DT-167ALA 在75、85 ℃下的溫度穩(wěn)定性均有明顯下降。 由圖1 可知，配體的自由能不變， 所以當突變體的△△G 為負值時，可理解為突變酶蛋白質(zhì)的自由能均小于野生型酶蛋白的自由能，而自由能越小酶越穩(wěn)定，因此表現(xiàn)為突變酶的熱穩(wěn)定性提高。

圖6 202/167 突變體的溫度穩(wěn)定性Fig. 6 Temperature stability of mutants 202/167

突變體酶和Xln-DT 的pH 穩(wěn)定性結(jié)果見圖7。突變體Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU 和Xln-DT-167ALA 在pH 值為4.0～7.0 的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較原酶略有下降，但仍能保持80%以上的相對酶活力。

圖7 202/167 突變體的p H 穩(wěn)定性Fig. 7 pH stability of 202/167 mutants

2.3.3 突變體的耐糖系數(shù)Ki和動力學(xué)參數(shù) 將純化后的Xln-DT 和突變體Xln-DT-202PHE、Xln-DT-202LEU、Xln-DT-167ALA 分別測定耐糖系數(shù)Ki和動力學(xué)常數(shù)，結(jié)果見表3。 其中，突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的Km值較原酶Xln-DT 相比下降明顯，說明其對p NPX 的親和力提高了，這與預(yù)測的△△G 結(jié)果一致，見表2。 突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 突變后△△G為負值，對配體的親和力更強；突變后的Ki系數(shù)顯著降低，由原酶的3 394 mmol/L 降低到249 mmol/L和592 mmol/L， 但仍要高于已報道的β-木糖苷酶，尤其是GH 3 家族來源的β-木糖苷酶[18]。 而突變體Xln-DT-167ALA 動力學(xué)常數(shù)Km、Vmax變化不大，耐糖系數(shù)Ki則下降至1 023 mmol/L。

表3 202/167 突變體耐糖系數(shù)和動力學(xué)參數(shù)Table 3 Xylose tolerance coefficient and kinetic parameters of 202/167 mutants

3 結(jié) 語

以來源于D. thermophilum 的β-木糖苷酶Xln-DT 為研究對象，通過分子對接、定點突變和酶學(xué)性質(zhì)分析等手段， 對Xln-DT 的酶活提高關(guān)鍵位點進行研究，主要結(jié)論如下：

1） 利用I-TASSER Server 在線軟件對Xln-DT進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測， 利用p NPX 與Xln-DT 分子對接計算篩選出基于酶活提高的關(guān)鍵氨基酸位點202， 并獲得突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU。

2）與Xln-DT 相比，突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的酶活分別提高了3.28 和2.97倍，比酶活分別提高了2.86 和2.54 倍。Km值也較原酶小， 說明突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 對p NPX 的親和力提高， 但突變后的Ki系數(shù)顯著降低。

3）與Xln-DT 相比，突變體Xln-DT-202PHE 和Xln-DT-202LEU 的最適溫度維持不變；最適pH 則下降明顯。 突變體Xln-DT-202LEU 的溫度穩(wěn)定性有顯著提高； 而所有突變體的pH 穩(wěn)定性均有不同程度下降，但仍能保持80%以上的相對酶活力。

研究結(jié)果不但顯著提高了酶的活力，而且熱穩(wěn)定性也得到顯著改善，從而為該酶的進一步改造和實際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。