添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪生產(chǎn)工藝

李 瑩， 劉 念， 沈曉藝， 馬挺軍， 孫愛東， 王 芳*，2，3

（1． 北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京102206；2． 北京農(nóng)學(xué)院 食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京102206；3． 北京農(nóng)學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室， 北京102206；4． 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

干酪是以新鮮牛乳為原料，殺菌后添加發(fā)酵劑和凝乳酶使其凝固，再經(jīng)排乳清、腌漬、壓榨、成熟等工藝制成的發(fā)酵乳制品。 目前，我國年人均干酪消費量僅為0.1 kg， 與歐盟國家年人均干酪消費量18.7 kg 相比存在較大差距。 在乳品行業(yè)中，產(chǎn)品的感官特征是決定其市場和銷售量的關(guān)鍵，其中風(fēng)味是影響消費者對干酪產(chǎn)品接受度和喜好程度的最重要的屬性之一[1]。 特色風(fēng)味干酪的開發(fā)是近幾年的研究熱點[2-4]，例如研究學(xué)者利用紅曲霉、酵母菌等作為輔助發(fā)酵劑提高干酪的風(fēng)味[2-3]，將豆乳與牛乳混合后制作豆味濃郁的混合乳干酪[4]。

奶酒是我國北方游牧民族的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品[5]，是一種以新鮮馬奶（羊奶或牛奶）、蔗糖等為原料，分批或同時接入酵母菌和乳酸菌發(fā)酵而成的一種低醇度酒精乳飲料[6]。 Cheddar 干酪是我國最主要的天然干酪消費品類之一，是制作再制干酪的主要原料。將傳統(tǒng)奶酒與Cheddar 干酪相結(jié)合，利用釀酒酵母制作牛奶酒，在此基礎(chǔ)上進行發(fā)酵、凝乳、脫乳清和壓榨處理等工藝加工類Cheddar 干酪產(chǎn)品， 有利于奶酒產(chǎn)品的推廣，同時可以開發(fā)具有特色風(fēng)味的干酪產(chǎn)品。 然而，目前關(guān)于此方面的研究尚屬空白。

作者選取蔗糖添加量、 干酪發(fā)酵劑添加量、凝乳酶添加量為因素，以干酪產(chǎn)率和感官評定為主要檢測指標，通過單因素實驗和正交實驗對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪的加工工藝進行優(yōu)化， 為具有特色風(fēng)味的干酪的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛乳： 蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為2.97%～3.05%，脂肪質(zhì)量分數(shù)為3.71%～3.94%， 抗生素檢測為陰性，蒙牛乳業(yè)（北京）有限責(zé)任公司產(chǎn)品；蔗糖：廣州福正東海食品有限公司產(chǎn)品； 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：活性干釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司產(chǎn)品；凝乳酶：Stamix 1150，活力為2 235 IMCU/g，科漢森（中國）有限公司產(chǎn)品；干酪發(fā)酵劑：R-704 直投式發(fā)酵劑，科漢森（中國）有限公司產(chǎn)品。

無水乙醇、無水乙醚、石油醚等：均為分析純，北京化工廠產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8B 水浴鍋：中國精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品； 干酪槽和干酪壓榨器： 作者所在實驗室自制；DH-101-2 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱： 中國中環(huán)有限公司產(chǎn)品；DSHZ-300A 水浴恒溫振蕩器： 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；TMS-Pro 質(zhì)構(gòu)儀： 美國FTC公司產(chǎn)品；ME204 分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司產(chǎn)品；CJ78-1 磁力攪拌器：常州市金壇大地自動化儀器廠產(chǎn)品；pHB-4 精密酸度計：上海儀電科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；KDY-9830 全自動凱氏定氮儀：上海洪紀儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 工藝路線 原料乳→標準化→添加蔗糖→滅菌 （90 ℃，15 min）→冷卻至23 ℃→接種釀酒酵母（0.2 g/L）→酒精發(fā)酵（23 ℃，72 h）→接種干酪發(fā)酵劑→乳酸發(fā)酵（32 ℃，30 min）→添加氯化鈣（0.2 g/L）→添加凝乳酶→凝乳 （32 ℃）→切割→勻速升溫至39 ℃（5 ℃/min）→恒溫蒸煮→排乳清→堆疊至pH 5.5→鹽漬（3 g/L）→壓榨（120 kg，12 h）→真空包裝→成熟（4 ℃）。

取成熟1 d 的類Cheddar 干酪樣品進行相關(guān)指標測定。

1.3.2 單因素實驗

1） 蔗糖添加量的單因素實驗 干酪發(fā)酵劑添加量為0.04 g/L，凝乳酶添加量為447 IMCU/L，其他條件不變，將蔗糖添加量分別設(shè)為40、50、60、70 g/L，測定蔗糖添加量對干酪產(chǎn)率、硬度以及感官評定的影響。

2） 干酪發(fā)酵劑添加量的單因素實驗 蔗糖添加量為60 g/L，凝乳酶添加量為447 IMCU/L，其他條件不變， 將干酪發(fā)酵劑添加量分別設(shè)為0.02、0.04、0.06、0.08 g/L， 測定干酪發(fā)酵劑添加量對干酪產(chǎn)率、硬度以及感官評定的影響。

3） 凝乳酶添加量的單因素實驗 蔗糖添加量為60 g/L，干酪發(fā)酵劑添加量為0.04 g/L，其他條件不變， 將凝乳酶添加量分別設(shè)為223.5、447、670.5、894 IMCU/L，測定凝乳酶添加量對干酪產(chǎn)率、硬度以及感官評定的影響。

1.3.3 正交實驗 根據(jù)單因素實驗選擇出最優(yōu)水平區(qū)間，進行三因素三水平正交實驗，對類Cheddar干酪進行感官評定、干酪產(chǎn)率、pH 值、蛋白質(zhì)回收率和脂肪回收率的測定。

1.3.4 最優(yōu)工藝的驗證實驗 以感官評定為評價指標，對通過正交實驗優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝與正交實驗表中感官得分最高的工藝進行驗證實驗。

1.3.5 干酪產(chǎn)率、蛋白質(zhì)回收率及脂肪回收率測定干酪產(chǎn)率、蛋白質(zhì)回收率及脂肪回收率測定參照文獻[7]。

1.3.6 pH 值測定 取20 g 干酪溶于12 g 去離子水，研磨至無顆粒，使用酸度計測定[8]。

1.3.7 質(zhì)構(gòu)特性測定 采用TPA 測試對樣品執(zhí)行兩次壓縮循環(huán)，模擬口腔咀嚼過程。 將干酪樣品切割成邊長為15 mm 的立方體， 在4 ℃下貯藏過夜。測定參數(shù)：探頭直徑30 mm，測量過程中探頭速度1 mm/s，壓縮形變量75%，觸發(fā)力5 g。

1.3.8 感官評定 感官評定見表1， 參考美國農(nóng)業(yè)部不同等級Cheddar 干酪評價指標[9]，稍作修改。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣品均重復(fù)測定3 次。 方差分析借助SPSS 17.0 完成；圖表借助Origin 8.0 完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 蔗糖添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪產(chǎn)率、硬度和感官評定的影響 干酪的產(chǎn)率是評價生產(chǎn)效益、考察生產(chǎn)參數(shù)合理性的重要指標[10]。奶酒發(fā)酵過程中， 釀酒酵母因為缺乏β-半乳糖苷酶，不能利用牛奶中的乳糖，因此本研究中添加蔗糖作為釀酒酵母的碳源。 由表2 可知，隨著蔗糖添加量的增加，類Cheddar 干酪的產(chǎn)率顯著降低（P＜0.05）。Hong 等人（2017）[11]研究不同乙醇體積分數(shù)對Camembert 干酪理化組分的影響， 認為添加不同體積分數(shù)乙醇的干酪間組分存在差異可能與加工工藝、發(fā)酵劑活性的改變有關(guān)。 同時，乙醇會導(dǎo)致牛乳中的酪蛋白膠束失去穩(wěn)定性，發(fā)生聚集、形成沉淀[12]。 本研究中，隨著蔗糖添加量的增加，釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生更多的乙醇，干酪加工過程中凝乳時間和恒溫蒸煮時間顯著縮短，說明蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可能是在凝乳酶誘導(dǎo)的酶凝作用和乙醇誘導(dǎo)的失穩(wěn)作用下形成，后者形成的結(jié)構(gòu)水分包裹能力差，造成干酪產(chǎn)率隨蔗糖添加量增加而降低。

表1 添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪的感官評定細則Table 1 Detailed sensory evaluation of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

表2 蔗糖添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of sucrose addition amount on yield of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

質(zhì)構(gòu)特性是評價干酪品質(zhì)和消費者接受程度的重要指標[13]，其中硬度是主要的評價指標。 由圖1可知，隨著蔗糖添加量的增加，類Cheddar 干酪的硬度顯著增加（P < 0.05）。 研究表明，干酪中水分質(zhì)量分數(shù)降低，蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得更加致密，導(dǎo)致硬度增加[14-15]。 與前人的報道一致，本研究中隨著蔗糖添加量的增加，乳清排出量增加、干酪產(chǎn)量降低，進而引起蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得致密、硬度增加。

圖1 蔗糖添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪硬度的影響Fig. 1 Effect of sucrose addition amount on hardness of Cheddar-like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由圖2 可知， 蔗糖添加量對類Cheddar 干酪的氣味、口感和滋味影響顯著，對外觀影響不顯著。 氣味方面， 添加40 g/L 蔗糖加工的干酪奶味更加濃郁； 添加70 g/L 蔗糖加工的干酪酒味更加濃郁；添加50 g/L 蔗糖加工的干酪酒香味和奶香味比例適中，得分最高。 口感方面，添加40 g/L 蔗糖加工的干酪質(zhì)地較為綿軟，缺少彈性；添加70 g/L 蔗糖加工的干酪口感粗糙；添加50 g/L 蔗糖加工的干酪質(zhì)地軟硬適中，口感細膩，得分最高。 滋味方面，添加40 g/L 蔗糖加工的干酪滋味過于平淡； 添加70 g/L 蔗糖加工的干酪產(chǎn)生過濃的發(fā)酵味、 酒精味以及苦味，隨著蔗糖添加量的增加，釀酒酵母代謝產(chǎn)生的乙醇體積分數(shù)增加。 已有研究表明，乙醇是Cheddar干酪中酯類合成的限制性因素，乙醇體積分數(shù)與乙酯的形成密切相關(guān)，Cheddar 干酪中過多的乙酯會導(dǎo)致“果味”缺陷[6，16]；添加50 g/L 蔗糖加工的干酪乳酸味濃郁，配比適宜，得分最高。綜合評定添加50 g/L蔗糖加工的干酪感官評分最高。

由以上實驗可知， 添加50 g/L 蔗糖加工的類Cheddar 干酪產(chǎn)率較高，質(zhì)地軟硬適中，奶香味與酒香味比例適中，滋味醇厚。

圖2 蔗糖添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪感官評定的影響Fig. 2 Effect of sucrose addition amount on sensory evaluation of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

2.1.2 干酪發(fā)酵劑添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪產(chǎn)率、硬度和感官評定的影響 由表3可知， 干酪發(fā)酵劑添加量對類Cheddar 干酪產(chǎn)率無顯著影響（P > 0.05）。 Cheddar 干酪加工過程中，發(fā)酵劑主要通過促進凝乳酶作用和凝塊中乳清排出影響干酪品質(zhì)[17]。本研究中，隨著干酪發(fā)酵劑添加量的增加，干酪加工過程中凝乳時間和恒溫蒸煮時間顯著縮短， 說明干酪發(fā)酵劑的增加促進了凝乳作用，同時加快了pH 值的降低，這與Khosrowshahi 等人（2006）[18]的報道是一致的。但是，干酪發(fā)酵劑添加量引起的加工工藝的改變對干酪產(chǎn)率沒有顯著影響。

表3 干酪發(fā)酵劑添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪產(chǎn)率的影響Table 3 Effect of cheese starter addition amount on yield of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由圖3 可知， 隨著干酪發(fā)酵劑添加量的增加，類Cheddar 干酪的硬度呈現(xiàn)先不變（P > 0.05）后顯著降低（P < 0.05）的趨勢。 研究表明，干酪中蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)特性、脂肪和水分的質(zhì)量分數(shù)及分布狀態(tài)是影響硬度的主要因素[19-20]。 本研究中，干酪發(fā)酵劑對干酪產(chǎn)率沒有顯著影響，但是對干酪硬度的影響顯著，說明干酪發(fā)酵劑可能通過影響干酪中某些物質(zhì)的含量及分布狀態(tài)影響硬度， 這與Khosrowshahi等人（2006）[18]的研究中干酪發(fā)酵劑的增加造成了更小的斷裂應(yīng)力和應(yīng)變的情況是一致的。

圖3 干酪發(fā)酵劑添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪硬度的影響Fig. 3 Effect of cheese starter addition amount on hardness of Cheddar-like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由圖4 可知， 干酪發(fā)酵劑添加量對類Cheddar干酪的氣味和滋味影響顯著，對口感和外觀影響不顯著。氣味方面，添加0.04 g/L 干酪發(fā)酵劑加工的干酪有輕微奶香味和酒香味； 添加0.08 g/L 干酪發(fā)酵劑加工的干酪酸味過重； 添加0.06 g/L 干酪發(fā)酵劑加工的干酪得分最高， 酒香味和奶香味比例適中。滋味方面， 添加0.02 g/L 干酪發(fā)酵劑加工的干酪由于滋味平淡得分較低； 添加0.08 g/L 干酪發(fā)酵劑加工的干酪酸味過重；0.04 g/L 干酪發(fā)酵劑添加量的干酪酸度適宜，分數(shù)最高。綜合評定添加0.04 g/L 干酪發(fā)酵劑加工的干酪感官評分最高。

由以上實驗可知， 添加0.04 g/L 干酪發(fā)酵劑加工的類Cheddar 干酪產(chǎn)率高，酸度適宜，酸味與奶香味、酒味比例適中。

圖4 干酪發(fā)酵劑添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪感官評定的影響Fig. 4 Effect of cheese starter addition amount on sensory evaluation of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

2.1.3 凝乳酶添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar干酪產(chǎn)率、硬度和感官評定的影響 凝乳酶是以酶凝作用為主的干酪加工過程中必須的酶制劑[21]，主要參與凝塊的形成和干酪成熟過程中蛋白質(zhì)的降解。 由表4 可知， 隨著凝乳酶添加量的增加，類Cheddar 干酪的產(chǎn)率先顯著降低（P < 0.05）后基本不變（P > 0.05）。 本研究中，隨著凝乳酶添加量的增加，干酪加工過程中凝乳時間先縮短后增加、恒溫蒸煮時間顯著增加（結(jié)果未展示），這與凝乳酶/酪蛋白底物比例的增加會加快κ-酪蛋白的酶切作用進而加速酪蛋白的聚集、縮短凝乳時間的現(xiàn)象[22]是矛盾的， 說明凝乳酶的酶切作用受到某種因素的抑制。 凝乳酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，如前所述乙醇會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性， 因此隨著凝乳酶添加量的增加，凝乳酶的分散度增加，乙醇誘導(dǎo)的凝乳酶的變性作用可能增強，導(dǎo)致凝膠結(jié)構(gòu)變差、乳清析出增加，干酪產(chǎn)率降低。

由圖5 可知， 隨著凝乳酶添加量的增加，類Cheddar 干酪的硬度先顯著增加（P < 0.05）后基本不變（P > 0.05）。 如前所述，乙醇誘導(dǎo)的凝乳酶變性作用的增強造成乳清析出增加， 蛋白質(zhì)交聯(lián)增強，引起干酪的硬度增加。

表4 凝乳酶添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪產(chǎn)率的影響Table 4 Effect of rennet addition amount on yield of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

圖5 凝乳酶添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪硬度的影響Fig. 5 Effect of rennet addition amount on hardness of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由圖6 可知， 凝乳酶添加量對類Cheddar 干酪的口感和外觀影響顯著， 對氣味和滋味無顯著影響。 口感方面，添加223.5 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪口感細膩，得分最高；添加894 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪口感粗糙，顆粒感強；添加447 IMCU/L 和670.5 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪口感較為細膩。 外觀方面，添加223.5 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪狀態(tài)松散、 內(nèi)部孔洞較多、 略有乳清析出； 添加894 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪表現(xiàn)出色澤較暗、 稍有結(jié)皮等不良現(xiàn)象； 添加447 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪色澤均一、光滑、質(zhì)地緊實富有彈性，得分最高； 添加670.5 IMCU/L 凝乳酶加工的干酪表面光滑，色澤較均一。 綜合評定447 IMCU/L 凝乳酶添加量加工的干酪感官評分最高。

圖6 凝乳酶添加量對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪感官評定的影響Fig. 6 Effect of rennet addition amount on sensory evaluation of Cheddar-like cheese with Saccharomyces cerevisiae

由以上實驗可知， 添加447 IMCU/L 凝乳酶加工的類Cheddar 干酪產(chǎn)率較高，組織較為緊實、富有彈性。

2.2 正交實驗

2.2.1 工藝優(yōu)化正交實驗結(jié)果 以蔗糖添加量、發(fā)酵劑添加量、凝乳酶添加量為因素，依據(jù)單因素實驗篩選出的最佳水平區(qū)間對類Cheddar 干酪進行三因素三水平正交實驗工藝優(yōu)化，結(jié)果見表5。 pH 值是反映干酪品質(zhì)的重要指標之一， 影響干酪風(fēng)味、控制酶活和礦質(zhì)元素的平衡[23]；蛋白質(zhì)和脂肪是干酪中主要干物質(zhì)， 是衡量干酪營養(yǎng)價值的關(guān)鍵指標，蛋白質(zhì)和脂肪回收率是考察工藝是否合理的重要指標[7，24]。 由表5 可知，4 號干酪感官評分最高，干酪產(chǎn)率、pH 值、蛋白質(zhì)回收率、脂肪回收率較高。

2.2.2 極差分析 對正交實驗的感官評定結(jié)果進行極差分析。 由表6 可以看出，蔗糖添加量、發(fā)酵劑添加量和凝乳酶添加量的R 值均大于空列的R 值，說明3 個因素對感官得分的影響均顯著，影響大小依次為蔗糖添加量> 發(fā)酵劑添加量> 凝乳酶添加量。 優(yōu)化得到類Cheddar 干酪的最優(yōu)工藝為A2B1C1，即蔗糖添加量50 g/L， 干酪發(fā)酵劑添加量0.02 g/L，凝乳酶添加量223.5 IMCU/L。

表5 添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪工藝條件優(yōu)化正交實驗結(jié)果Table 5 Result of orthogonal experiments for processing conditions optimization of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

表6 添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪工藝條件優(yōu)化正交實驗感官得分的極差分析Table 6 Range analysis of sensory score of orthogonal experiments for processing conditions optimization of Cheddar -like cheese with Saccharomyces cerevisiae

2.2.3 驗證實驗 由表7 可知，A2B1C1工藝加工的干酪感官得分高于A2B1C2工藝加工的干酪，證實通過正交實驗優(yōu)化的工藝加工的干酪具有最高的感官得分。

因此，以感官評分為主要評價指標，添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪的最優(yōu)工藝為A2B1C1， 即蔗糖添加量50 g/L，干酪發(fā)酵劑添加量0.02 g/L，凝乳酶添加量223.5 IMCU/L。

表7 正交實驗中最優(yōu)工藝加工的干酪與感官得分最高的干酪的感官評定結(jié)果Table 7 Results of sensory evaluation of the cheese processed with the optimal conditions obtained in orthogonal experiment and the cheese with the highest sensory score

3 結(jié) 語

本研究對添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪的加工工藝進行優(yōu)化。 以感官評定和干酪產(chǎn)率為主要測定指標，通過單因素實驗確定了蔗糖的最適質(zhì)量濃度為50 g/L， 干酪發(fā)酵劑的最適質(zhì)量濃度為0.04 g/L，凝乳酶的最適活力濃度為447 IMCU/L；進一步通過三因素三水平正交實驗和驗證實驗，確定添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪的最佳工藝條件是A2B1C1，即蔗糖質(zhì)量濃度50 g/L， 干酪發(fā)酵劑質(zhì)量濃度0.02 g/L，凝乳酶活力濃度223.5 IMCU/L。 在此優(yōu)化條件下，成品干酪色澤明亮，組織狀態(tài)結(jié)實，奶香味與酒香味濃郁且適宜，接下來將會進一步研究添加釀酒酵母的類Cheddar 干酪成熟過程中的品質(zhì)變化。