• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人來源α-1,3/1,6 甘露糖轉(zhuǎn)移酶Alg2 的異源表達(dá)及活性測定

    2021-05-18 00:35:54胥欣欣王春迪高曉冬
    關(guān)鍵詞:條帶酵母質(zhì)粒

    胥欣欣, 王春迪, 陳 帥, 高曉冬

    (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫214122)

    在真核生物中,N-糖基化是一個高度保守的蛋白質(zhì)修飾過程[1-3]。 該過程發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,起始于多萜醇寡糖前體 (Dolichol Linked Oligosaccharide,DLO)的生物合成,其中14 個單糖依次轉(zhuǎn)移到多萜醇焦磷酸 (PP-Dol) 基團(tuán)上形成核心寡糖前體Glc3Man9GlcNAc2-PP-Dol[2,4-7]。 一系列ER 膜上的糖基轉(zhuǎn)移酶(GTases)統(tǒng)稱為Alg(Asparagine-linked glycosylation)蛋白,有序催化DLO 的合成[1,8-9]。 DLO合成的前7 個反應(yīng)發(fā)生在ER 的胞質(zhì)側(cè), 生成Man5GlcNAc2-PP-Dol 中間體, 隨后會翻轉(zhuǎn)至ER腔內(nèi)進(jìn)一步被延伸[10]。 最終,寡糖基轉(zhuǎn)移酶(OST)會將DLO 寡糖前體轉(zhuǎn)移到新生多肽Asn-X-Ser/Thr序列的天冬酰胺(Asn)殘基上(X 指除脯氨酸外的氨基酸)[11]。

    在N-糖基化途徑中,ALG2 基因編碼的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶具有雙功能,催化第二和第三個甘露糖的添加,即以GDP-mannose 為供體,向ManGlcNAc2-PP-Dol 添加α-1,3 和α-1,6 連鍵的甘露糖, 形成分支結(jié)構(gòu)的Man3GlcNAc2-PP-Dol[12-15]。有文獻(xiàn)報道Alg1、Alg2 和Alg11 會形成異聚復(fù)合體共同參與胞質(zhì)側(cè)甘露糖的添加[16-17]。 最初,在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 中, 研究人員通過篩選獲得一種溫度敏感性突變體alg2-1,它在限制性溫度下會積累脂連的Man2GlcNAc2[18],表明alg2-1 的糖基轉(zhuǎn)移酶存在缺陷, 無法催化α-1,6 甘露糖的添加,繼而通過回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)克隆得到ALG2 基因[19]。 關(guān)于人類ALG2-CDG 疾病相關(guān)突變體的報道也表明,ALG2 基因是添加α-1,3 連接的甘露糖所必需的[20]。利用表達(dá)ScAlg2 的大腸桿菌膜組分,Alg2 的雙功能性得到了初步鑒定,后續(xù)研究中也進(jìn)一步利用酵母微粒體膜部分制備的ScAlg2 和純化的TrxAScAlg2 證明了其可以轉(zhuǎn)移α-1,3/1,6 連鍵的甘露糖,會以不同的催化速率同時合成α-1,3 或α-1,6連鍵Man2GlcNAc2PP-Dol 兩種中間體[12-13,21]。 最近研究人員成功地將從人類胚胎腎(HEK)293 細(xì)胞中純化的hAlg2 應(yīng)用于化學(xué)酶法生產(chǎn)Man5GlcNAc2-PP-Dol 類似物[22]。

    然而, 用動物細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)成本相對較高。目前, 在大腸桿菌中表達(dá)hAlg2 的相關(guān)研究鮮有報道。 在真核細(xì)胞中,Alg2 的天然底物是Man1GlcNAc2-PP-Dol。 多萜醇(Dolichol)的碳鏈較長,使得該天然底物的合成和純化難度較高。 有研究表明,GlcNAc2-PP-Phytanyl (PPGn2) 可被用作Alg1 天然底物的替代物[23]。因此,使用碳鏈短且結(jié)構(gòu)相似的植烷醇(Phytanol)替代天然底物中的多萜醇是目前的極佳選擇。 作者所在課題組曾在大腸桿菌中表達(dá)了酵母來源的重組蛋白Alg1ΔTM,詳細(xì)闡明了其酶學(xué)性質(zhì), 并成功合成了Man1GlcNAc2-PPPhy(PPGn2M1)[24]作為hAlg2 的底物用以研究其體外活性。

    作者利用釀酒酵母生長表型回補(bǔ)系統(tǒng),對hALG2 基因的體內(nèi)功能和蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了分析。此外,利用原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單,成本低廉的特點(diǎn), 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了TrxA-hAlg2 重組蛋白, 并進(jìn)行了分離純化。 結(jié)合基于LC-MS 的Alg-MTase 體外活性測定法[21,24-26],對純化的TrxA-hAlg2進(jìn)行了體外的活性測定。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 釀酒酵母w303a 模式菌株:作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏;大腸桿菌克隆宿主細(xì)胞XL10-Gold:作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏;用于原核表達(dá)的大腸桿菌感受態(tài)Rosetta (DE3) 和用于原核表達(dá)的載體pET28a 和pET32a: 購于默克密理博公司;質(zhì)粒YEp351GAPII 和pRS315:作者在實(shí)驗(yàn)室保藏。

    LB 培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,NaCl 10;TBK 培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物24,胰蛋白胨12,三水合磷酸氫二鉀16.4,磷酸二氫鉀2.31;加入體積分?jǐn)?shù)0.4%的甘油。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,可在相應(yīng)的培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度100 μg/mL 氨芐霉素或34 μg/mL 氯霉素。

    YPAD/YPAG 培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物10,蛋白胨20, 腺嘌呤0.03;SD/SG 缺陷型培養(yǎng)基(g/L):YNB 6.7,氨基酸缺陷粉末2。YPAD 或SD 中額外加入終質(zhì)量濃度2 g/dL 的葡萄糖;YPAG 或SG 中額外加入終質(zhì)量濃度2 g/dL 的半乳糖。

    1.1.2 主要試劑和儀器 PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶、Mighty Mix DNA 連接酶、 一系列限制性內(nèi)切酶:購于寶生物工程(大連)公司;GoldView I 型核酸染色劑:購于索萊寶公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),PCR 產(chǎn)物純化、DNA 膠回收和DNA 小量抽提試劑盒:購于生工生物工程(上海)公司;BCA蛋白濃度試劑盒、SDS-PAGE 蛋白凝膠制備試劑盒: 購于碧云天生物公司;Protease inhibitor cocktail、Anti-FLAG Mouse mAb: 購于西格瑪公司;Anti-Dpm1 Mouse mAb: 購于艾博抗公司;Anti-His Mouse mAb、Goat Anti-Mouse IgG HRP、Blue Plus II Protein Marker、1 kb Plus DNA Ladder: 購于全式金生物公司;PCR 儀、凝膠成像儀、半干電轉(zhuǎn)儀:購于伯樂公司;1 mL HisTrap HP 親和層析柱、ImageQuantTMLAS 4000 mini 顯 像 儀: 購 于GE healthcare 公司;NanoDrop2000、 三重四極桿液質(zhì)連用儀: 購于賽默飛公司; 液相色譜柱粒徑1.7 μm,2.1 mm×100 mm:購于沃特世公司。

    1.1.3 實(shí)驗(yàn)溶液 Lysis buffer (酵母細(xì)胞裂解液):0.2 mol/L 山梨醇,1 mmol/L EDTA,50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5);5×Sample buffer (蛋白質(zhì)上樣緩沖液):10 g/dL SDS,0.5 g/dL 溴酚藍(lán),250 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),體積分?jǐn)?shù)50%甘油,5 g/dL β-巰基乙醇;Running buffer(蛋白質(zhì)RFM 電泳緩沖液):25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3),192 mmol/L 甘氨酸,0.1 g/dL SDS;Transfer buffer(轉(zhuǎn)膜緩沖液):25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3),192 mmol/L 甘氨酸, 體積分?jǐn)?shù)20%甲醇;TBST (洗膜緩沖液):137 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6), 體 積 分 數(shù)0.05%Tween-20;Buffer A (E. coli 裂 解 液):150 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0);Buffer B(平衡緩沖液):150 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),體積分?jǐn)?shù)0.3% Triton X-100;在Buffer B 的基礎(chǔ)上,按咪唑濃度20、60、500 mmol/L 配制梯度洗脫緩沖液;Buffer C (除鹽液):50 mmol/L NaCl,25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 體積分?jǐn)?shù)5%甘油;Buffer D (活性反應(yīng)液):38 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2),1.8 mmol/L DTT,0.28 mmol/L EDTA,0.26 g/dL NP40。

    1.2 方法

    1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建 質(zhì)粒YEp351GAPII-FLAGhALG2 的構(gòu)建如下:以人cDNA 為模板,X22:CGGG AGCTCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGCT CGAGGCGGAGGAGCAGGGCCGGG 和X23:GCTCT AGATTATACCAGCAGTTTGGTAAC 為上下游引物(劃線部分依次為Sac I 和Xba I 酶切位點(diǎn)),擴(kuò)增目的基因FLAG-hALG2。 經(jīng)Sac I 和Xba I 雙酶切后,將片段連入相同酶切的YEp351GAPII。

    質(zhì)粒pRS315-ALG2pr-FLAG-hALG2-ALG2ter的構(gòu)建如下:以YEp351GAPII-FLAG-hALG2 為模板,X48:TGCTCTAGAATGGACTACAAAGACGATGA 和X19:AAAAAAGCTTTTATACCAGCAGTTTGGTAAC為上下游引物,擴(kuò)增基因FLAG-hALG2。經(jīng)Xba I 和Hin d III 雙酶切后, 片段連入相同酶切的pRS315-ALG2pr-ALG2ter。

    質(zhì)粒pET32a-hALG2的構(gòu)建如下:以YEp351GAPIIFLAG-hALG2 為 模 板,X17:CGCGGATCCGCGGAG GAGCAGGGCCGGGA 和X19:AAAAAAGCTTTTAT ACCAGCAGTTTGGTAAC 為上下游引物, 擴(kuò)增基因hALG2。 經(jīng)Bam H I 和Hin d III 雙酶切后,片段連入相同酶切的pET32a。

    1.2.2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的構(gòu)建 以pFA6a-His3MX6-PGAL1 為模板,X33:TAGATACA GTAGTAAAGACAGATAAAAAAGAGTCGATTAGAC AAGCAAAAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 和X34:CCTAGGTCTGGATGAATAAAAGCAATCGTTCTTTT ATCCTTTTCAATCATTTTGAGATCCGGGTTTT 為上下游引物, 擴(kuò)增含有釀酒酵母ALG2 啟動子區(qū)域同源臂和半乳糖啟動子的基因片段。 經(jīng)乙醇沉淀法提取后, 線性轉(zhuǎn)化至野生型酵母w303a 中, 涂布至SD-HIS 缺陷型固體培養(yǎng)基上。 陽性轉(zhuǎn)化子由菌落PCR 和基因組PCR 驗(yàn)證后獲得, 上游引物F:CCATAGGATGATAATGCG,下游引物R:TTATATTT CTTCATAAGG。

    1.2.3 酵母點(diǎn)板實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞,OD600在1~3 之間均可。根據(jù)分光光度計測量的菌體OD 值, 計算并調(diào)節(jié)每個樣品的起始OD 數(shù)相同,用去離子水按10 倍稀釋,共4 個梯度,每個梯度分別取5 μL, 依次點(diǎn)于YPAD 或YPAG 固體培養(yǎng)基,30 ℃靜置培養(yǎng)36 h。

    1.2.4 酵母蛋白質(zhì)的提取 取對數(shù)生長期的酵母細(xì)胞,OD600在1~3 之間均可, 收集6~7 個OD 單位的細(xì)胞,用1 mL 去離子水洗滌一次。 加入200 μL Lysis buffer 重懸,同時加入適量0.3~0.4 mm 規(guī)格玻璃珠1×Protease inhibitor cocktail;振蕩1 min,冰上1 min,重復(fù)10 次,以下步驟在4 ℃下進(jìn)行。 1 000 g離心5 min,去除未破碎細(xì)胞和細(xì)胞碎片。 取上清液200 μL,3 000 g 離心5 min, 進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞核組分,取上清液180 μL 為全細(xì)胞蛋白質(zhì);13 000 g 離心30 min, 取沉淀為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分,用180 μL Lysis buffer 重 懸。 蛋 白 質(zhì) 濃 度 用NanoDrop2000 測定。

    1.2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 將含有原核表達(dá)載體pET32a-hALG2 的大腸桿菌Rosetta(DE3)單克隆轉(zhuǎn)化子,接種于5 mL 含氨芐霉素和氯霉素的LB 液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床過夜。 次日,轉(zhuǎn)接2 mL 過夜培養(yǎng)的菌液至200 mL 含卡那霉素和氯霉素的TBK 液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)3 h 左右。 測得菌體A600nm達(dá)到0.6~0.8 后,16 ℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)1 h。最后加入終濃度0.1 mmol/L IPTG,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。

    離心收集所有菌體,20 mL BufferA 重懸后冰上超聲破碎;4 000 g 離心20 min, 去除細(xì)胞碎片;取上清液20 000 g 離心90 min,取沉淀重懸于10 mL Buffer B,靜置30 min;12 000 g 離心30 min,得上清液為膜蛋白,以上過程在4 ℃下完成。

    用10 mL Buffer B 過His Trap HP(1mL)親和層析柱,平衡;取上清液膜蛋白過柱,上樣;10 mL Buffer B 去除未結(jié)合的蛋白質(zhì); 分別用10 mL 含20、60 mmol/L 咪唑和含500 mmol/L 咪唑+體積分?jǐn)?shù)5%的甘油的BufferA 依次洗脫并收集至離心管,利用SDS-PAGE 檢測純化蛋白質(zhì)。 最后,將含純化的蛋白質(zhì)洗脫液加至Amicon Ultra 10 K NMWL 濃縮管, 離心濃縮, 并以BufferC 除鹽。 蛋白質(zhì)濃度由BCA 試劑盒檢測。

    1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡 取適量蛋白質(zhì)樣品,加入對應(yīng)5×Sample buffer 后混勻,95 ℃處理5 min。根據(jù)不同樣品的蛋白質(zhì)濃度,計算并保持所有蛋白質(zhì)上樣量的一致。 裝配電泳裝置, 加注適量1×running buffer 后上樣和蛋白質(zhì)Marker, 在180 V 恒壓條件下運(yùn)行80 min。 電泳完成后采用半干法轉(zhuǎn)膜,條件設(shè)置為25 V、0.1 A、30 min。 轉(zhuǎn)膜完成后,將PVDF膜浸于含5 g/dL 脫脂奶粉的TBST 中封閉, 室溫放置1~2 h。 一抗/二抗均稀釋于含5 g/dL 脫脂奶粉的封閉液中,一抗稀釋比例1∶3 000,二抗稀釋比例1∶5 000。 封閉完成后取出PVDF 膜,按順序加入相應(yīng)一抗、二抗,抗體孵育時間為室溫1~2 h 或4 ℃過夜。 抗體孵育完成后, 用TBST 洗滌PVDF 膜10 min,重復(fù)3 次。 取適量ECL 顯示劑A 液和B 液,以體積比1∶1 混勻。將顯色液均勻散布在PVDF 膜上,靜置1 min, 用Image Quant LAS 4000 mini 進(jìn)行自動曝光拍攝。

    1.2.7 體外活性反應(yīng)體系 PPGn2M1 的合成詳見文獻(xiàn)[24]。 加入終濃度50 μmol/L PPGn2、2 mmol/L GDP-Man、10 mmol/L MgCl2至Buffer D 中, 終體系為100 μL,加入2 μg 純化的Alg1NΔTM,30 ℃靜置孵育1 h, 得TrxA-hAlg2 的底物PPGn2M1。 對于TrxA-hAlg2 的反應(yīng),取上述反應(yīng)液50 μL,直接加入2.5 μg 純化的TrxA-hAlg2,30 ℃靜置孵育1 h。

    1.2.8 LC-MS 檢測糖鏈 向反應(yīng)體系加入等體積20 mmol/L 鹽酸,100 ℃終止反應(yīng), 同時酸解釋放脂肪鏈上的糖鏈后,利用Supelclean ENVI-Carb Slurry對糖鏈進(jìn)行固相萃??; 純化所得糖鏈經(jīng)冷凍干燥后,用去離子水重懸;通過超效液相色譜儀Dionex Ultimate 3000 UPLC 自動進(jìn)樣到氨基色譜柱UPLC BEH Amide Column(粒徑1.7 μm,2.1 mm×100 mm)中,乙腈線性梯度洗脫(溶液A:乙腈;溶液B:去離子水)。洗脫條件:0~2 min 體積分?jǐn)?shù)20%B;2~15 min,體積分?jǐn)?shù)20%~50% B;15~18 min, 體積分?jǐn)?shù)50%B;流量:0.2 mL/min。 分離所得底物和產(chǎn)物,再經(jīng)由ESI-MS 儀器TSQ Quantum Ultra 在正離子模式下同步檢測相對分子質(zhì)量。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 人源Alg2 蛋白的疏水性預(yù)測

    釀酒酵母Alg2(ScAlg2)的N 端含兩個跨膜結(jié)構(gòu)域,C 端兩個疏水序列以非跨膜方式和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合[13]。 利用在線軟件TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html) 對hAlg2 進(jìn)行跨膜預(yù)測,結(jié)果見圖1。 hAlg2 僅在N 端具有一個疏水性區(qū)域,位于氨基酸85-104 位,是潛在的惟一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合域。

    hAlg2 這種膜結(jié)合形式與ScAlg2 呈現(xiàn)出明顯的差異, 這也就引出了hAlg2 在釀酒酵母中或在大腸桿菌中表達(dá)并純化后,是否和ScAlg2 之間存在差異的疑問。

    2.2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的鑒定

    在釀酒酵母中,ALG2 是必需基因,直接敲除會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 因此,難以實(shí)現(xiàn)通過基因敲除獲得完全無ALG2 基因背景的菌株。 通過基因改造母株w303a 獲得的菌株w303a-GAL1pr-ALG2, 見圖2(a)。其基因組上ALG2 自身啟動子(ALG2pr)由半乳糖啟動子(GAL1pr)取代。該菌株在半乳糖培養(yǎng)基中,ALG2 基因會被表達(dá),細(xì)胞能夠正常生長;在葡萄糖培養(yǎng)基中,ALG2 基因會被抑制表達(dá), 細(xì)胞會死亡。通過觀察XGY29 在葡萄糖培養(yǎng)基上的生長表型,可以判斷在菌株中外源表達(dá)的基因是否具有體內(nèi)活性。

    以圖2(a)中所示F、R 為上下游引物,取菌落PCR 驗(yàn)證正確的1 號、2 號單菌落基因組后進(jìn)一步PCR 驗(yàn)證,均得位于1 500~2 000 bp 之間的單一條帶,和理論大小1 753 bp 相符;而野生型(WT)中由于不含引物F 序列,無法擴(kuò)增出目的帶(圖2(b))。將w303a-GAL1pr-ALG2 (1 號) 和w303a 點(diǎn)板于YPAD 固體培養(yǎng)基上,前者表現(xiàn)出明顯的生長缺陷,即其無法在含有葡萄糖的條件下生長(圖2(c))。這些結(jié)果說明w303a-GAL1pr-ALG2 菌株構(gòu)建成功。

    圖1 hAlg2 蛋白的TMpred 跨膜預(yù)測Fig. 1 Transmembrane prediction of hAlg2 protein using TMpred

    2.3 h ALG2 在w303a-GAL1pr-ALG2 菌株中的表型回補(bǔ)和蛋白質(zhì)表達(dá)

    將融合FLAG 標(biāo)簽的h ALG2 基因分別構(gòu)建入含 TDH3 強(qiáng) 啟 動 子 的 多 拷 貝 (2μ) 質(zhì) 粒YEp351GAPII(圖3(a)、(b))和含酵母ALG2 啟動子(ALG2pr)的單拷貝質(zhì)粒pRS315(圖3(c)、(d))中, 構(gòu)建成功的兩種質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后電泳驗(yàn)證,均顯示有兩個條帶,即載體條帶和目的基因條帶(理論大小為1 281 bp)。

    隨后,將YEp351GAPII(作為空載對照)和上述兩個質(zhì)粒分別在w303a-GAL1pr-ALG2 菌株中表達(dá)。 如圖4(a)所示,在YPAG 培養(yǎng)基上,w303a-GAL1pr-ALG2 在分別轉(zhuǎn)入3 種質(zhì)粒后均能正常生長, 說明這些質(zhì)粒不影響Sc ALG2 正常表達(dá)時細(xì)胞的生長; 在YPAD 培養(yǎng)基上, 僅當(dāng)過表達(dá)外源的h ALG2 時,才能回補(bǔ)該菌株的生長缺陷。 提取對應(yīng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白組分進(jìn)行免疫印記分析,僅能檢測到過表達(dá)條件下的hAlg2p 條帶 (50 000 左右),見圖4(b)。 這些結(jié)果說明,h ALG2 基因在酵母細(xì)胞中具有功能同源性,而且僅在其過表達(dá)的條件下才能發(fā)揮功能。

    圖2 w303a-GAL1pr-ALG2 菌株的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig. 2 Construction and verification of w303a-GAL1pr-ALG2 strain

    圖3 在酵母中表達(dá)h ALG2 的質(zhì)粒構(gòu)建和驗(yàn)證Fig. 3 Construction and verification of yeast plasmids containing h ALG2

    圖4 h ALG2 基因在GAL1pr-ALG2 酵母中的回補(bǔ)和表達(dá)Fig. 4 Growth recovery and protein expression in GAL1pr-ALG2 strain by h ALG2 gene

    2.4 h ALG2 大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

    表達(dá)質(zhì)粒pET32a-h ALG2 示意圖見圖5(a)。經(jīng)雙酶切后電泳驗(yàn)證(圖5(b)),顯示為兩個條帶,下端條帶大小對應(yīng)擴(kuò)增的h ALG2 條帶(1 267 bp);上端條帶為載體片段,該質(zhì)粒經(jīng)過測序驗(yàn)證無堿基突變,說明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    圖5 質(zhì)粒pET32a-h ALG2 的構(gòu)建和驗(yàn)證Fig. 5 Construction and verification of pET32a-h ALG2

    2.5 TrxA-hAlg2 蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化

    重組菌Rosetta (DE3)/pET32a-h ALG2 在IPTG終濃度為0.1 mmol/L 的含氨芐霉素抗性的TB 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。 離心收集菌體,破碎離心純化上清液蛋白質(zhì),將洗脫后的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分析。

    理論上目的蛋白質(zhì)TrxA-hAlg2 的相對分子質(zhì)量為61 400,如圖6(a)所示,相比于誘導(dǎo)前,誘導(dǎo)后在50 000~70 000 之間出現(xiàn)一條明顯的蛋白質(zhì)條帶,表明TrxA-hAlg2 蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。純化后可以得到一條清晰的蛋白質(zhì)條帶,與誘導(dǎo)后條帶大小相同。 蛋白質(zhì)免疫印跡也能檢測到對應(yīng)相對分子質(zhì)量的純化后蛋白質(zhì)(見圖6(b)),這說明TrxA-hAlg2 蛋白成功從大腸桿菌破碎上清液中純化得到。 濃縮除鹽處理后得質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的TrxA-hAlg2 蛋白。

    圖6 TrxA-h Alg2 蛋白的表達(dá)和純化Fig. 6 Expression and purification of TrxA-h Alg2 protein

    2.6 TrxA-hAlg2 蛋白的活性分析

    以PPGn2 代替天然底物,GDP-mannose 為供體, 由Alg1NΔTM 催化反應(yīng)1 h 后,100 ℃下2 min終止反應(yīng)并滅活A(yù)lg1NΔTM。 取一半反應(yīng)液, 作為TrxA-hAlg2 的反應(yīng)底物PPGn2M1, 加入純化后的TrxA-hAlg2 后,繼續(xù)30 ℃下反應(yīng)1 h。 最后均向兩份反應(yīng)體系中加入等體積的20 mmol/L HCl,100 ℃下酸解1 h,釋放脂肪鏈上的糖鏈。 糖鏈經(jīng)固相萃取后,進(jìn)行LC-MS 分析。

    對于Alg1NΔTM 的反應(yīng), 在UPLC 液相色譜中分別出現(xiàn)8.73、9.03 的峰(見圖7(a)),ESI-MS 質(zhì)譜分析該峰對應(yīng)的質(zhì)荷比m/z 為609, 即其反應(yīng)產(chǎn)物糖鏈的加鈉值[Gn2-M1+Na]+(見圖7 (b))。 對于TrxA-hAlg2 的反應(yīng),Gn2-M1 對應(yīng)的峰完全消失,證明底物被TrxA-hAlg2 完全反應(yīng); 液相色譜顯示在10.57、10.78 和12.25、12.45 有兩組峰 (圖7(a)),ESI-MS 質(zhì)譜分析兩組峰對應(yīng)的質(zhì)荷比m/z 分別為771 和933, 對應(yīng)其反應(yīng)產(chǎn)物糖鏈的加鈉值[Gn2-M2+Na]+和[Gn2-M3+Na]+(圖7(b))。這些結(jié)果說明,在大腸桿菌中表達(dá)純化的TrxA-hAlg2 蛋白同樣具有α-1,3/1,6 甘露糖轉(zhuǎn)移酶活性, 即向PPGn2M1上添加兩個甘露糖形成PPGn2M3。

    圖7 TrxA-hAlg2 蛋白的活性測定Fig. 7 Activity assay of TrxA-hAlg2 protein

    3 結(jié) 語

    通過分析發(fā)現(xiàn),人源Alg2 蛋白的84~104 位氨基酸是潛在的惟一膜結(jié)合區(qū)域,且疏水性較小。 盡管這和釀酒酵母ScAlg2 蛋白的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全不同, 但在釀酒酵母中過表達(dá)h ALG2 基因時,hAlg2蛋白能穩(wěn)定表達(dá), 且能夠回補(bǔ)Sc ALG2 基因缺失時細(xì)胞的生長缺陷。 hAlg2 蛋白在酵母細(xì)胞體內(nèi)的功能同源性和低疏水性的膜蛋白性質(zhì),為其在大腸桿菌中的表達(dá)純化和后續(xù)活性測定提供理論依據(jù)。 作者在大腸桿菌中表達(dá)了hAlg2 并對其進(jìn)行了純化,相比動物細(xì)胞表達(dá)體系,成本較低。 在體外活性實(shí)驗(yàn)中, 結(jié)合LC-MS 技術(shù), 證實(shí)hAlg2 具有催化PPGn2M1 形成中間體PPGn2M2 和終產(chǎn)物PPGn2M3的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶功能。 對N-糖基化途徑中人源的甘露糖基轉(zhuǎn)移酶hAlg2 的外源表達(dá)和體外活性進(jìn)行的研究,為將來進(jìn)一步探索Alg2 的酶學(xué)性質(zhì)和晶體結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。 此外,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)提純的hAlg2, 也為研究ALG2-CDG 病人相關(guān)突變體的體外活性提供了更加直接、方便、快捷的方法。

    猜你喜歡
    條帶酵母質(zhì)粒
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    酵母抽提物的研究概況
    酵母魔術(shù)師
    人CyclinD1在畢赤酵母中的表達(dá)
    基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
    生物量高的富鋅酵母的開發(fā)應(yīng)用
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的鑒定
    在线天堂中文资源库| 久久精品国产亚洲av高清一级| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产片内射在线| 制服人妻中文乱码| 色播在线永久视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 午夜福利一区二区在线看| 成人亚洲欧美一区二区av| a级毛片在线看网站| 黄片无遮挡物在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产一区二区三区综合在线观看| 女人久久www免费人成看片| 日韩电影二区| 精品人妻在线不人妻| 极品少妇高潮喷水抽搐| 黄色 视频免费看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 老司机影院成人| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 国产不卡av网站在线观看| 午夜影院在线不卡| 久久久a久久爽久久v久久| 999久久久国产精品视频| 国产av国产精品国产| 久久午夜综合久久蜜桃| 好男人视频免费观看在线| 亚洲成人手机| 国产片特级美女逼逼视频| 国产 精品1| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 蜜桃国产av成人99| 啦啦啦啦在线视频资源| 免费黄色在线免费观看| 亚洲精品第二区| 一本大道久久a久久精品| 久久精品国产综合久久久| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美国产精品一级二级三级| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费观看无遮挡的男女| av国产精品久久久久影院| 久久影院123| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 午夜久久久在线观看| 国产精品成人在线| av福利片在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 久久久久精品人妻al黑| 色网站视频免费| 国产探花极品一区二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 男女午夜视频在线观看| 乱人伦中国视频| 免费看av在线观看网站| 性色av一级| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲成人手机| 国产一区二区 视频在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 97精品久久久久久久久久精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| av天堂久久9| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产免费又黄又爽又色| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品免费视频内射| 蜜桃国产av成人99| 麻豆乱淫一区二区| 在线观看免费高清a一片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 26uuu在线亚洲综合色| 成年美女黄网站色视频大全免费| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| av有码第一页| 久久久久久久久久久免费av| 日本av免费视频播放| www.精华液| 国产精品嫩草影院av在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 精品久久久久久电影网| av天堂久久9| 在线天堂最新版资源| 美女高潮到喷水免费观看| 男女下面插进去视频免费观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 伦理电影免费视频| 9热在线视频观看99| 久久人人97超碰香蕉20202| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产福利在线免费观看视频| 日韩伦理黄色片| 一级毛片电影观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲,一卡二卡三卡| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 人妻 亚洲 视频| 国产乱人偷精品视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 婷婷成人精品国产| 中文字幕亚洲精品专区| h视频一区二区三区| 不卡视频在线观看欧美| 永久免费av网站大全| 日韩伦理黄色片| 欧美精品国产亚洲| 亚洲内射少妇av| 亚洲国产欧美在线一区| 午夜免费鲁丝| 热99国产精品久久久久久7| 在线观看www视频免费| 亚洲三级黄色毛片| 女人久久www免费人成看片| 久久久久久久久久人人人人人人| 天天操日日干夜夜撸| 最新的欧美精品一区二区| 男人操女人黄网站| 国产福利在线免费观看视频| freevideosex欧美| 午夜av观看不卡| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产人伦9x9x在线观看 | 国产乱人偷精品视频| 免费看不卡的av| 久久毛片免费看一区二区三区| 免费大片黄手机在线观看| 国产精品.久久久| 美女大奶头黄色视频| 日韩中字成人| 大片电影免费在线观看免费| 日韩av免费高清视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 99久国产av精品国产电影| 久久久久久人人人人人| 午夜福利乱码中文字幕| 国产成人精品福利久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 大陆偷拍与自拍| 女性生殖器流出的白浆| 国产av精品麻豆| 边亲边吃奶的免费视频| 久久鲁丝午夜福利片| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 9色porny在线观看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲综合精品二区| 在线观看www视频免费| 国产成人精品一,二区| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 欧美精品一区二区免费开放| 国产一区二区在线观看av| 夫妻午夜视频| 久久午夜福利片| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产xxxxx性猛交| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 在线看a的网站| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品久久久av美女十八| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产探花极品一区二区| 香蕉丝袜av| 国产精品一国产av| 欧美精品国产亚洲| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久婷婷青草| 黄色一级大片看看| 人成视频在线观看免费观看| 成人国产av品久久久| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 另类精品久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线观看人妻少妇| 国产成人午夜福利电影在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 日韩av在线免费看完整版不卡| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久久久视频综合| 精品国产国语对白av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 免费少妇av软件| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日日撸夜夜添| 人人澡人人妻人| 欧美日韩精品网址| 精品人妻一区二区三区麻豆| 深夜精品福利| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 七月丁香在线播放| 天堂8中文在线网| 亚洲国产欧美网| 老汉色∧v一级毛片| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品.久久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| freevideosex欧美| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久精品国产a三级三级三级| 两个人免费观看高清视频| 在线天堂中文资源库| 成年美女黄网站色视频大全免费| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 免费黄色在线免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 中文字幕亚洲精品专区| 一个人免费看片子| 久久久久久久久久久免费av| 91国产中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久a久久爽久久v久久| 女性生殖器流出的白浆| 2022亚洲国产成人精品| 777米奇影视久久| 国产av国产精品国产| 国产精品国产三级国产专区5o| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产av精品麻豆| 国产麻豆69| 免费观看性生交大片5| 水蜜桃什么品种好| 国产在线一区二区三区精| 午夜福利,免费看| 人成视频在线观看免费观看| 七月丁香在线播放| 在线观看三级黄色| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品一区在线观看国产| 一级毛片我不卡| 美女视频免费永久观看网站| 在线观看一区二区三区激情| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 午夜福利在线免费观看网站| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产一级毛片在线| 青春草视频在线免费观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一级毛片 在线播放| 男女国产视频网站| 一本久久精品| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 青春草国产在线视频| 国产色婷婷99| 大陆偷拍与自拍| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产片内射在线| 欧美日韩精品网址| 久久人人爽人人片av| 亚洲精品一区蜜桃| 波多野结衣av一区二区av| 深夜精品福利| 日本av免费视频播放| 精品第一国产精品| 热re99久久精品国产66热6| 国产毛片在线视频| 香蕉国产在线看| 久久午夜综合久久蜜桃| 成年动漫av网址| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 99热网站在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 考比视频在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 一级片'在线观看视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲三级黄色毛片| 最近中文字幕2019免费版| 国产亚洲欧美精品永久| 最近的中文字幕免费完整| 午夜影院在线不卡| 在线看a的网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜福利视频精品| 99久久综合免费| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩一区二区视频免费看| 成人毛片a级毛片在线播放| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲欧美一区二区三区久久| 午夜精品国产一区二区电影| 熟女av电影| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 18禁观看日本| 在线天堂最新版资源| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费播放大片免费观看视频在线观看| av一本久久久久| 人妻人人澡人人爽人人| 国产成人欧美| 少妇被粗大的猛进出69影院| 电影成人av| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品久久久久久精品电影小说| 美女午夜性视频免费| 最近中文字幕2019免费版| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久这里有精品视频免费| 黄频高清免费视频| 色哟哟·www| 亚洲三区欧美一区| 在线天堂中文资源库| 少妇被粗大猛烈的视频| 午夜免费鲁丝| 亚洲少妇的诱惑av| 国产av码专区亚洲av| 亚洲av福利一区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久久a久久爽久久v久久| 国产免费福利视频在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 熟女av电影| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 精品一区二区三区四区五区乱码 | 91成人精品电影| 寂寞人妻少妇视频99o| 97在线视频观看| 成年人午夜在线观看视频| av线在线观看网站| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品一国产av| 亚洲国产最新在线播放| 国产野战对白在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 女人精品久久久久毛片| 免费黄色在线免费观看| 亚洲久久久国产精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美人与性动交α欧美软件| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品偷伦视频观看了| 综合色丁香网| 国产爽快片一区二区三区| 国产熟女欧美一区二区| 国产激情久久老熟女| 国产精品国产三级国产专区5o| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 少妇人妻久久综合中文| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久婷婷青草| 亚洲av国产av综合av卡| 男男h啪啪无遮挡| 国产午夜精品一二区理论片| 最黄视频免费看| 亚洲国产最新在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 天堂中文最新版在线下载| 色哟哟·www| 国产精品国产三级国产专区5o| 成年人免费黄色播放视频| 极品人妻少妇av视频| 一二三四在线观看免费中文在| 久久鲁丝午夜福利片| 一区二区av电影网| 国产精品免费视频内射| 老司机影院毛片| 日韩三级伦理在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 伦理电影免费视频| 18禁动态无遮挡网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av卡一久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲成人手机| 国产又爽黄色视频| 只有这里有精品99| 精品卡一卡二卡四卡免费| 免费看不卡的av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久久久精品性色| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久久国产一区二区| 青春草国产在线视频| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久久国产一级毛片高清牌| 另类精品久久| 最近中文字幕2019免费版| 丰满乱子伦码专区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 免费观看在线日韩| 9色porny在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩成人av中文字幕在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久99一区二区三区| av在线播放精品| 国产午夜精品一二区理论片| 精品国产一区二区久久| 在线 av 中文字幕| 日韩视频在线欧美| 日本av免费视频播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 最近中文字幕2019免费版| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av电影在线进入| 色播在线永久视频| 国产有黄有色有爽视频| 美国免费a级毛片| 国产熟女欧美一区二区| 日本欧美国产在线视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产 精品1| 老鸭窝网址在线观看| 水蜜桃什么品种好| 国产极品天堂在线| 国产精品久久久久久精品古装| 制服诱惑二区| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产极品粉嫩免费观看在线| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av成人精品一二三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 99热网站在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 大码成人一级视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久热在线av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 尾随美女入室| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 男人舔女人的私密视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 飞空精品影院首页| 亚洲国产av新网站| 少妇精品久久久久久久| 午夜久久久在线观看| 另类亚洲欧美激情| 久久久国产一区二区| 国产爽快片一区二区三区| 十八禁高潮呻吟视频| 人妻系列 视频| 制服丝袜香蕉在线| 欧美另类一区| 一级黄片播放器| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 免费在线观看完整版高清| 男女边吃奶边做爰视频| 乱人伦中国视频| 黄片无遮挡物在线观看| 三级国产精品片| 电影成人av| 一级毛片高清免费大全| www.999成人在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲av五月六月丁香网| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 91麻豆av在线| 亚洲国产看品久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产不卡一卡二| 伦理电影免费视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 国产有黄有色有爽视频| 老司机在亚洲福利影院| 国产精品成人在线| www.自偷自拍.com| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 咕卡用的链子| 久久精品国产亚洲av高清一级| 水蜜桃什么品种好| 又大又爽又粗| 激情视频va一区二区三区| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 丝袜人妻中文字幕| 久久精品国产综合久久久| 久久国产精品影院| 成人三级黄色视频| 在线观看午夜福利视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 日本免费a在线| 一区二区三区国产精品乱码| 精品乱码久久久久久99久播| 制服人妻中文乱码| av在线播放免费不卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲伊人色综图| 99久久精品国产亚洲精品| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲人成伊人成综合网2020| 亚洲伊人色综图| 久99久视频精品免费| 999久久久精品免费观看国产| 午夜福利在线观看吧| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲精华国产精华精| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 香蕉丝袜av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| av在线天堂中文字幕 | 久久人人精品亚洲av| 一进一出抽搐动态| 三上悠亚av全集在线观看| www.www免费av| 亚洲一区二区三区不卡视频| 成年人免费黄色播放视频| 精品第一国产精品| 国产高清激情床上av| 色综合欧美亚洲国产小说| 日本五十路高清| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看www视频免费| 中国美女看黄片| 亚洲精品国产区一区二| 国产亚洲欧美98| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| 91av网站免费观看| 久久香蕉精品热| 操出白浆在线播放| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲视频免费观看视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 欧美成人性av电影在线观看| 国产99白浆流出| e午夜精品久久久久久久| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产激情欧美一区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品国产一区二区久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久中文字幕一级| 国产视频一区二区在线看| 精品国产一区二区久久| 久久亚洲精品不卡| 国产精品野战在线观看 | 999久久久精品免费观看国产| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产欧美日韩一区二区三| 精品高清国产在线一区| 在线看a的网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产欧美日韩综合在线一区二区| av中文乱码字幕在线| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲av成人av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 成年人黄色毛片网站| 亚洲自拍偷在线| xxx96com| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲三区欧美一区| aaaaa片日本免费| 午夜免费观看网址| 中文字幕高清在线视频| 亚洲五月天丁香| 国产深夜福利视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品人妻在线不人妻| 久久久久久久久免费视频了| 视频区欧美日本亚洲| 国产成人欧美| 99久久国产精品久久久| 一区福利在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 十八禁网站免费在线| 国产成人免费无遮挡视频| 国产成人精品久久二区二区91| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成人三级做爰电影| 黄色视频不卡| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产1区2区3区精品| 久久亚洲真实| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费av中文字幕在线| 国产成人精品在线电影| 一级a爱视频在线免费观看| 日本wwww免费看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩高清综合在线| 乱人伦中国视频| 国产高清国产精品国产三级| 天天添夜夜摸| 久久精品91蜜桃| 欧美一级毛片孕妇| 国产午夜精品久久久久久|