甘氨酰tRNA 合成酶在小鼠圍著床期子宮及蛻膜化過(guò)程的時(shí)空特異性表達(dá)

姜 南，王一妹，馬興紅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

小鼠早期妊娠包括受精、著床前胚胎在輸卵管中的發(fā)育、胚胎著床和基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化等幾個(gè)重要過(guò)程。子宮由子宮腔上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及腺體組成。在卵巢雌激素和孕酮的協(xié)同影響下，著床期間的子宮發(fā)生顯著的形態(tài)和分子上的變化。小鼠胚胎在妊娠第5 天進(jìn)行著床，胚胎著床后，著床胚胎周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞分化為特殊的蛻膜細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為蛻膜化[1]。蛻膜是妊娠期間的臨時(shí)組織，通常是雙核或多倍體[2]。蛻膜具有多種功能，如提供支持胚胎發(fā)育的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的來(lái)源，在妊娠期間發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，以及調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層的侵襲 。

氨基酰tRNA 合成酶（Aminoacyl-tRNA Synthetase，AARS）參與催化所有生物體蛋白質(zhì)合成過(guò)程，將特定的氨基酸連接到它們的同源tRNA 上形成氨基酰tRNA[3]。除了這種典型的功能外，最近的幾項(xiàng)研究表明，一些AARS 家族成員可能在多種生理?xiàng)l件下具有額外的細(xì)胞因子樣活性，如葡萄糖穩(wěn)態(tài)[4]、炎癥[5]、血管生成[6]、細(xì)胞增殖[7]和凋亡[8]。近年來(lái)，AARS 家族成員甘氨酰tRNA 合成酶（Glycyl-tRNAsynthetase，GlyRS）在腓骨肌領(lǐng)域研究較多[9]。也有研究表明GlyRS與抗腫瘤應(yīng)答以及奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳和細(xì)胞增殖分化有關(guān)[10]。本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠早期妊娠和人工誘導(dǎo)蛻膜化模型，從體內(nèi)體外2 個(gè)方面研究GlyRS的表達(dá)規(guī)律，探究GlyRS 在妊娠建立過(guò)程中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 性成熟ICR 品系小鼠購(gòu)買(mǎi)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院。人工控制飼養(yǎng)環(huán)境為室溫23℃，光照周期為12 h 光照、12 h 黑暗，自由進(jìn)食及飲水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 ①早期妊娠：將性成熟的雌性小鼠與雄性小鼠按3:1 的比例于16:00 合籠交配，次日08:00 檢查發(fā)現(xiàn)陰道栓記為妊娠第1 天，分別于每天09:00 前收集小鼠妊娠第1～8 天子宮。收集小鼠妊娠第2～4 天子宮時(shí)，以從輸卵管或子宮中沖出胚胎為依據(jù)。收集小鼠妊娠第5 天子宮時(shí)，尾靜脈注射1%的芝加哥藍(lán)以確定著床位點(diǎn)。收集小鼠妊娠第6～8 天子宮時(shí)，能明顯觀察出著床位點(diǎn)，可直接取材。將子宮切成適當(dāng)大小，一部分經(jīng)液氮速凍后放入-70℃冰箱凍存，另一部分用固定液固定進(jìn)行石蠟包埋。②人工誘導(dǎo)蛻膜化：將性成熟且結(jié)扎后的健康雄性小鼠與性成熟的雌性小鼠按1:1 的比例合籠交配，次日08:00 檢查發(fā)現(xiàn)陰道栓記為假孕第1 天。在其假孕第4 天時(shí)，對(duì)其右側(cè)子宮的子宮角進(jìn)行芝麻油注射，另一側(cè)不注射，作為對(duì)照。在其假孕第8 天09:00 取材，取材方法同早期妊娠模型中的方法。

1.2 實(shí)時(shí)定量PCR

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)熒光定量設(shè)計(jì)要求，于NCBI中獲取人GlyRS基因、GAPDH基因和PRL基因的mRNA 序列并用Primer 5 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。選取引物（表1）送擎科生物（哈爾濱）公司進(jìn)行合成。

1.2.2 總RNA 提取和cDNA 合成 按照RNA 提取試劑盒（TRIzol?Reagent kit，Invitrogen 公司）說(shuō)明進(jìn)行人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞總RNA 提取實(shí)驗(yàn)。Nano Drop 2000（Thermo 公司）測(cè)定RNA 純度及濃度；使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（GoScript Reverse Transcription Mix，Promega公司），反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20℃冰箱。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TransStart?TopTaq 試劑盒（TransGen Biotech 公司），反應(yīng)體系為20 μL：Anchored Oligo (dT)18 Primer 1 μL，2×TS Reaction Μix 10 μL，TransSceipt?RT/RI Enzyme Μix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，RNA template 1 μL，RNase-Free Water 6 μL，反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)后收集熒光信號(hào)。在ABI Prism7500 機(jī)器中進(jìn)行，導(dǎo)出CT 值后采用2-ΔΔCT進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 原位雜交

1.3.1 小鼠GlyRS基因片段克隆及探針的制備 根據(jù)GenBank 相關(guān)序列設(shè)計(jì)小鼠GlyRS基因的上、下游引物（上游引物：5'-CCACTGAGCCAGAACCAAGA-3'；下游引物：5'-GGAGTAAAACCAAGCAGCCA-3'），以小鼠子宮cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，使用AxyGen膠回收試劑盒純化產(chǎn)物。將產(chǎn)物與pGEM-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單一菌落進(jìn)行搖菌，將菌液送至哈爾濱擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的GlyRS基因片段利用Roche 公司的地高辛標(biāo)記試劑盒進(jìn)行探針標(biāo)記。

1.3.2 原位雜交 將凍存的小鼠子宮組織7 μm 冰凍切片、10%中性福爾馬林溶液中固定1 h。使用地高辛標(biāo)記的GlyRSRNA 探針于雜交液中，55℃雜交過(guò)夜。洗滌，1% 封閉液室溫封閉1 h 。堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體4℃避光孵育過(guò)夜。滴加NBT/BCIP（1:50）與2 mmol/L 左旋咪唑室溫顯色8 h，甲基綠染液對(duì)染，封片拍照。

1.4 免疫組織化學(xué) 將石蠟包埋的小鼠子宮組織7 μm石蠟切片、烘片1 h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水；98℃抗原修復(fù)10 min；3%雙氧水處理10 min；10%馬血清室溫避光封閉1 h；兔抗小鼠GlyRS 多克隆抗體（1:500，absin 公司）4℃避光孵育過(guò)夜；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（ProteinTech 公司）室溫避光孵育1 h；DAB 顯色；蘇木精對(duì)染；稀釋后的鹽酸氨水反藍(lán)、梯度乙醇脫水、透明、封片拍照。

表1 引物序列

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析 提取小鼠子宮組織蛋白，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Biosharp 公司）測(cè)定蛋白樣品濃度。將相同質(zhì)量的蛋白樣品煮沸并變性，制作蛋白質(zhì)凝膠，80 V 恒壓條件下進(jìn)行SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h。恒流200 mA 條件下濕法轉(zhuǎn)膜90 min，37℃封閉1 h，兔源GlyRS一抗（1：600，absin 公司）和GAPDH 一抗（1:500，ProteinTech 公司）4℃孵育過(guò)夜。PBST 洗滌3 次，山羊抗兔IgG（ProteinTech 公司）37℃孵育1 h，PBST 洗滌3 次，ECL 超靈敏發(fā)光溶液（南京諾唯贊公司）顯影，曝光。

1.6 體外誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化 配制不含有酚紅的DMEM/F-12（1:1）培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)人子宮基質(zhì)細(xì)胞，隔天換液；細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，去除培養(yǎng)液，HBSS 緩沖液清洗3 次；胰酶消化后吹打混勻轉(zhuǎn)移至離心管中離心，除去上清加入新鮮培養(yǎng)液；重懸細(xì)胞接種到6 孔板中并隔夜換液，在細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞。誘導(dǎo)組培養(yǎng)液配方：10 nmol/L 雌二醇、1 μmol/L 醋酸甲羥孕酮（雌二醇和醋酸甲羥孕酮的溶劑均為無(wú)水乙醇），并加入終濃度為0.5 μmol/L 的二丁酰環(huán)腺苷酸（Sigma 公司）；對(duì)照組則加入相同體積的無(wú)水乙醇；在37℃ 5% CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。依次收集第1、2、4、6 天誘導(dǎo)組和對(duì)照組的細(xì)胞，提取RNA 進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 利用GraphPad Prism 5.0 軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析或Student'st檢驗(yàn)，α為0.05。利用ImageJ 軟件對(duì)灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析，以GAPDH作內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1GlyRS在小鼠早期妊娠子宮中的表達(dá)情況 原位雜交、免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，GlyRSmRNA 和蛋白在小鼠早期妊娠第1～4 天子宮腔上皮和腺上皮表達(dá)較弱。隨著妊娠的進(jìn)行，胚胎在第5 天成功植入，并且胚胎周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞增殖形成初級(jí)蛻膜區(qū)，隨后幾天初級(jí)蛻膜區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞增殖并分化成次級(jí)蛻膜區(qū)。GlyRSmRNA 和蛋白在第5、6 天的初級(jí)蛻膜區(qū)以及第7、8 天的次級(jí)蛻膜區(qū)表達(dá)并逐漸增強(qiáng)（圖1）。

圖1 GlyRS 在小鼠早期妊娠子宮中的表達(dá)情況

2.2GlyRS在小鼠人工蛻膜化模型子宮中的表達(dá)情況由圖2 可知，GlyRSmRNA 和蛋白在小鼠人工蛻膜區(qū)子宮中的表達(dá)高于非蛻膜區(qū)。

2.3GlyRSmRNA 在體外誘導(dǎo)蛻膜化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá) 人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化標(biāo)志物PRLmRNA 的表達(dá)隨誘導(dǎo)天數(shù)的增加而增加，證明了成功的誘導(dǎo)作用和高效率（圖3-A）。GlyRSmRNA 在體外誘導(dǎo)蛻膜化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量高于對(duì)照組，并且隨誘導(dǎo)天數(shù)的增加而增強(qiáng)（圖3-B）。

3 討 論

圖2 GlyRS 在小鼠人工蛻膜化子宮中的表達(dá)情況

圖3 GlyRS mRNA 在體外誘導(dǎo)蛻膜化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)

成功妊娠是物種延續(xù)與進(jìn)化的先決條件，早期妊娠的質(zhì)量對(duì)于后期的胚胎發(fā)育具有很大的影響，因而是妊娠成功的關(guān)鍵[11]。在哺乳動(dòng)物早期妊娠過(guò)程中，胚胎植入到子宮中，與母體建立物理和生理聯(lián)系的過(guò)程稱(chēng)為胚胎著床，是建立妊娠的關(guān)鍵步驟[12]。絕大多數(shù)的妊娠失敗均發(fā)生在圍著床期。在卵巢來(lái)源的雌激素和孕酮的協(xié)調(diào)作用下，著床胚胎周?chē)幕|(zhì)細(xì)胞發(fā)生形態(tài)和分子方面的顯著的分化，稱(chēng)為蛻膜化[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，GlyRS主要定位于小鼠胚胎和蛻膜組織，而且GlyRS的表達(dá)隨著蛻膜化的進(jìn)行而增強(qiáng)，這表明GlyRS基因參與了子宮基質(zhì)蛻膜化的過(guò)程。此外，在體外培養(yǎng)人子宮基質(zhì)細(xì)胞并誘導(dǎo)蛻膜化模型中，隨著蛻膜化誘導(dǎo)的逐漸增強(qiáng)，GlyRS的表達(dá)也隨之增強(qiáng)，表明GlyRS可能在哺乳動(dòng)物的蛻膜化過(guò)程中發(fā)揮比較保守的作用。

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)氨基酰tRNA 合成酶的功能與細(xì)胞增殖相關(guān)。抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶5（Cdk5）可以抑制磷酸化的谷氨酰脯氨酰tRNA 合成酶的磷酸化，阻止磷酸化的谷氨酰脯氨酰tRNA 合成酶從tRNA多合成酶復(fù)合物中釋放，并阻止mRNAs 的翻譯抑制，導(dǎo)致炎癥蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。如果在低色氨酸微環(huán)境下，色氨酰tRNA 合成酶會(huì)對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用[15]。同樣，甘氨酰tRNA 合成酶能夠正向調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中Cyclin D1 的表達(dá)量，最終促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖[16]。也有研究表明，GlyRS作為一種損傷信號(hào)，參與激活間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化和遷移過(guò)程[17]。在哺乳動(dòng)物胚胎著床和蛻膜化過(guò)程中，子宮細(xì)胞發(fā)生廣泛的增殖和分化，GlyRS在早期妊娠過(guò)程中如何發(fā)揮作用值得進(jìn)一步研究。

雷帕霉素復(fù)合物的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)（Mammalian Target Of Rapamycin，mTOR）是蛻膜營(yíng)養(yǎng)傳感器的組成部分，mTOR 信號(hào)在細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、細(xì)胞存活和遷移的調(diào)控中起著重要作用，是細(xì)胞新陳代謝、生長(zhǎng)和存活的中樞調(diào)節(jié)因子[18]。妊娠小鼠的mTOR mRNA 水平從妊娠第3 天開(kāi)始逐漸升高，在妊娠第5 天達(dá)到最大值，然后下降。mTOR的mRNA 和蛋白主要位于基質(zhì)細(xì)胞中；妊娠第4 天清晨通過(guò)宮內(nèi)注射雷帕霉素可大大減少著床位點(diǎn)的數(shù)量[19]。在子宮特異性缺失p53 的小鼠中，mTORC1 信號(hào)增強(qiáng)，蛻膜早衰，誘發(fā)妊娠小鼠早產(chǎn)，低劑量的mTORC1 抑制劑雷帕霉素可降低早產(chǎn)的發(fā)生率[20-21]。用抗糖尿病藥物二甲雙胍或抗氧化劑白藜蘆醇處理懷孕的p53 敲除小鼠可激活蛻膜細(xì)胞中的AMPK 信號(hào)傳導(dǎo)并抑制mTORC1 信號(hào)，二甲雙胍和白藜蘆醇均可預(yù)防p53 缺失引起的自發(fā)性和炎癥性早產(chǎn)[22]。有研究發(fā)現(xiàn)人的蛻膜化與mTOR 信號(hào)通路亦相關(guān)[23-24]。此外，還有研究證明甘氨酰tRNA 合成酶介導(dǎo)氨基酸誘導(dǎo)的mTOR 途徑的激活，從而調(diào)節(jié)牛奶蛋白和脂肪的合成[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠蛻膜組織和人子宮基質(zhì)細(xì)胞體外蛻膜化過(guò)程中高表達(dá)GlyRS，GlyRS與mTOR 通路的激活是否有關(guān)值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，GlyRSmRNA 和蛋白表達(dá)情況類(lèi)似，都是在小鼠早期妊娠第1～4 天的腔上皮和腺上皮表達(dá)，在第5～8 天的蛻膜區(qū)表達(dá)，并且隨著天數(shù)的增加而增強(qiáng)，在人工蛻膜化模型中蛻膜區(qū)表達(dá)。并且在體外誘導(dǎo)蛻膜化人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，隨著誘導(dǎo)蛻膜化天數(shù)的增加GlyRSmRNA 也呈上升趨勢(shì)且高于對(duì)照組，表明GlyRS參與了小鼠胚胎著床和蛻膜化的過(guò)程。本研究揭示了GlyRS在小鼠圍著床期子宮中的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步深入研究其在哺乳動(dòng)物妊娠中的功能提供了基礎(chǔ)。