常見天然抗氧化物質配比在面包制作中的優(yōu)化

陳 強，李 陽，魏廣輝，陳 黎，史金慧，郭 柱，石冰欣，蒲至恩*

（1.四川農業(yè)大學農學院，四川成都 611130；2.四川省宜賓市產品質量監(jiān)督檢驗所，四川宜賓 644000）

【研究意義】自由基是在生命體氧化反應中產生的一種有害化合物，具有強氧化性，能引發(fā)慢性疾病、衰老效應，其中最為常見的是氧自由基，如羥基自由基（-OH）、超氧陰離子自由基（O2-）等。正常情況下，生物體內自由基的產生和清除處于動態(tài)平衡，一旦自由基的活動失去控制，生命活動的秩序就會遭受破壞，并在細胞水平上對生物體產生威脅，對人類健康產生潛在危害[1-5]。為此，開發(fā)和利用天然抗氧化劑以清除體內自由基已成為食品領域發(fā)展的趨勢。【前人研究進展】目前，添加抗氧化物質是有效抑制氧化作用的重要方法之一，其作用機理主要是抗氧化物質清除自由基、螯合金屬離子、清除氧和作用于與自由基有關的酶[6]。在自然界中存在的常見天然抗氧化物質有茶多酚、大豆類黃酮、維生素C、維生素E、植酸等。已有研究表明，不同天然抗氧化劑的抗氧化活性和能力有一定差異，且相互之間的協(xié)同作用與其本身的抗氧化能力、有效濃度的高低等因素有關。其中植酸、維生素C先前在烘焙中被廣泛使用。植酸對-OH的清除作用強于O2-，作為抗氧化物質也被用來延長食品的食用期效[7]；茶多酚是一種高效復合抗氧化劑，其抗氧化性與自身各組分間的協(xié)同增效作用密切相關，且茶多酚與其他抗氧化劑之間也具有協(xié)同效應[8-9]；大豆異黃酮對超氧自由基有抑制作用，對羥基自由基也有一定的清除作用[11]；維生素C除了自身可直接作用于氧化過程外，還可以與其他高效抗氧化劑如Ve交換電子從而使Ve維持正常水平不斷發(fā)揮抗氧化作用，可見不同的抗氧化物質清除自由基的對象和能力有差異。【本研究切入點】雖然人們對抗氧化劑已經做了大量研究，但仍存在一些需要解決的問題，各類抗氧化物質之間的協(xié)同作用還未探明；另外前人研究顯示抗氧化物質在面包發(fā)酵、焙烤的加工過程中損耗最小[11]。結合這2個因素，以市場空白和人體需求為切入點，以人們日常食用的面包為載體，在面包中加入常見抗氧化物質茶多酚、大豆類黃酮、維生素C、維生素E、植酸等，探究不同抗氧化物質在面包烘烤過程中的協(xié)同效用?！緮M解決的關鍵問題】針對傳統(tǒng)單因素試驗設計的不足，采用二次回歸旋轉組合設計方法探求面包中加入不同抗氧化物質的最優(yōu)組合配比，采用多種方法測定其自由基清除能力，綜合考慮清除對象和清除能力，尋求達到最佳抗氧化性下幾種天然抗氧化物質的計量比，為天然抗氧化物質的科學復合應用天然抗氧化物質提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

面包用小麥粉來源于濱州泰裕麥業(yè)有限公司；茶多酚、大豆異黃酮、Vc采購自鄭州俊鑫誠信食品添加劑有限公司；植酸購于Ve鄭州瑞林食品添加劑有限公司；花青素由杭州眾芝康菇生物技術有限公司生產。材料均為食品級，純度≥99%。

1.2 儀器與設備

78-1磁力加熱攪拌器（金壇市醫(yī)療儀器廠）；JD200-3電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華實驗儀器廠）；UV-1800分光光度計（MAPADA）；烤箱、發(fā)酵醒發(fā)箱（SA‐MAG）。

1.3 方法

1.3.1 面包的制作 在面粉中添加天然抗氧化劑，后按照GB∕T 20981—2007標準制作面包[12]。

1.3.2 丙酮提取液制備 稱取干面包屑2 g，浸泡在20 mL質量分數(shù)為50%的丙酮溶劑中，避光15 h后過濾回收上清液[13]。

1.3.3 總酚含量的測定 參照Yu[14]方法。

1.3.4 清除自由基測定 清除DPPH的測定參照Yu[14]方法。清除羥基自由基法測定參照Yu[14]方法。清除超氧陰離子自由基測定參照王曉[15]的方法。清除ABTS的測定參照Yu[14]方法。

1.4 實驗設計

1.4.1 單因素實驗 天然抗氧化物計量參考:茶多酚稱取計量為（0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g∕kg）[16]、大豆異黃酮稱取計量為（0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 g∕kg）[17]、植酸稱取計量為（0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 g∕kg）[18]、花青素稱取計量為（0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g∕kg）[19]、Vc∕Ve（0.2:0.033、0.166:0.033、0.132:0.033、0.099:0.033、0.066:0.033）[20]。每個質量濃度的添加3次重復。

以抗氧化能力的評價指標為參考，對幾種天然抗氧化物質進行單因素優(yōu)化，得到在面包中綜合抗氧化能力達到最大值時各物質的劑量添加范圍。將此計量范圍的兩端值確定為二次正交旋轉組合設計實驗因素水平的下限（-2）和上限（+2）。

1.4.2 正交旋轉設計 選取茶多酚（X1）、大豆異黃酮（X2）、植酸（X3）、花青素（X4）、Vc∕Ve（X5）作為5個考察因素，編制因素水平編碼表[21]。根據(jù)5因素2次正交旋轉組合設計（1∕2實施）試驗方案共進行36次試驗，以抗氧化能力綜合指標作為響應值進行試驗，實驗平行進行3次。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用變異系數(shù)法對各抗氧化指標進行分析，變異系數(shù)法是一種客觀賦權的方法，利用各項指標所包含的信息，通過計算得到指標的權重。Ex是第i項指標的平均數(shù)，是第i項指標的標準差，Vx是第i項指標的變異系數(shù)。

由于各抗氧化物質對自由基的清除能力不同，故利用變異系數(shù)法確定總酚含量和DPPH、羥基自由基、超氧陰離子、ABTS清除能力共計5項指標的權重，得出抗氧化能力的綜合評定指標。采用DPS 14.0數(shù)據(jù)處理軟件及Design-Expert 8.0.6 Trial進行數(shù)據(jù)分析處理[21]。

2 結果與分析

2.1 單個抗氧化物質的抗氧化能力效應分析

根據(jù)抗氧化性能大小，通過單因素水平測試確定了單一抗氧化物質在面包中添加最大的適宜范圍:茶多酚、大豆異黃酮、植酸、花青素、Vc∕Ve計量范圍分別為（0.25～0.30）g∕kg、（0.004～0.006）g∕kg、（0.08～0.12）g∕kg、（0.08～0.10）g∕kg和（0.165∶0.033～0.132∶0.033）g∕kg。

對各因素處理進行正交編碼，回歸模型中的統(tǒng)計值已相互獨立，為進一步分析天然抗氧化物質的添加對面包中抗氧化性能的影響，可對回歸模型進行降維處理。將上述優(yōu)化模型中其他4個因素固定在零水平上可得到各因子與統(tǒng)計值的關系，得到偏回歸方程為:

根據(jù)單因子效應方程做各因素與抗氧化性的綜合評分的關系圖（圖1），可見所有因素在0水平時，抗氧化能力均為最大，但單個物質的抗氧化能力在合理的范圍內存在差異。根據(jù)逐步回歸分析的剩余標準差可知，上述抗氧化物質對面包的綜合抗氧化性的影響順序為大豆異黃酮（X2），植酸（X3），花青素（X4），另外茶多酚和Vc∕Ve在方程優(yōu)化時作為不顯著項被剔除。5種天然抗氧化物質的相對重要性在不同水平條件下是不同的。在-2≤X≤2，5個因素均呈向下的拋物線關系，-1≤X≤1水平間大部分因子趨于穩(wěn)定，隨后又開始下降。表明5種抗氧化物質均存在一個合理的添加范圍，超過這個范圍抗氧化能力就會下降，下降的程度以大豆異黃酮最為劇烈，也表明大豆異黃酮的添加量范圍更窄。

圖1 單因子效應分析Fig.1 Single factor effect analysis

2.2 抗氧化能力數(shù)學模型的建立

根據(jù)單因素實驗確定了各個抗氧化物質的上限和下限，并編制了5因素2次正交旋轉組合因素水平編碼表（表1），試驗結果見表2。

表1 實驗因素水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal tests

表2 二次回歸旋轉組合設計及試驗結果Tab.2 Quadratic rotary combination design and test results

利用回歸方程對試驗結果（表2）進行分析，得到茶多酚（X1）、大豆異黃酮（X2）、植酸（X3）、花青素（X4）、Vc∕Ve（X5）與DPPH（Y1）、總酚含量（Y2）、羥基自由基清除率（Y3）、超氧陰離子自由基清除率（Y4）、ABTS清除率（Y5）與抗氧化的綜合評分（Y6）的數(shù)學模型回歸方程分別為:

方差分析表明，方程（9）～（14）的失擬項F值＜F0.01，說明未知因素對試驗結果影響很小，可以忽略；回歸項F值＝MS回歸∕MS殘差＞F0.01；達到顯著水平，說明模型成立，預測值與實際值相吻合。

對回歸方程（9）～（13）的回歸系數(shù)進行顯著性檢驗，在α＝0.1顯著水平下剔除不顯著項，得到優(yōu)化的回歸方程分別為:

結果表明，茶多酚、植酸、Vc∕Ve可較有效的清除DPPH自由基離子；茶多酚、大豆異黃酮、植酸、Vc∕Ve對總酚含量的影響起到一定的作用；植酸與Vc∕Ve二者組合對羥基自由基的清除影響顯著；除Vc∕Ve外，其余4種抗氧化劑對超氧陰離子自由基的清除效果，在P＜0.1的水平下均達到顯著；茶多酚對ABTS的清除達顯著水平。雖然各抗氧化物質對總酚含量及幾種自由基的清除均有所貢獻，但從上述回歸方程可見，顯著項并不多，對回歸方程（14）的回歸系數(shù)進行顯著性檢驗，在α＝0.1顯著水平下剔除不顯著項，結果（表3）得到優(yōu)化的回歸方程為:

可知每種天然抗氧化物質并非對所有的自由基離子的清除率都達到顯著水平，不同的天然抗氧化物質對體內的不同自由基的清除效果不同；所以，應在面包或其他食品中添加多種抗氧化物質，以達到清除體內多種有害自由基的效果。

綜合抗氧化性與幾種天然抗氧化物質的相關系數(shù)（R2）=回歸平方和∕總平方和=0.737，說明5種天然抗氧化性可以解釋表現(xiàn)出的73.7%的抗氧化性，其他因素的影響和誤差占26.3%。同時說明除Vc∕Ve外，其余4種抗氧化劑都對綜合抗氧化性產生較為顯著的影響，也表明并非加入的抗氧化物質種類越多效果越好，同時說明協(xié)同抗氧化的能力強弱和各種抗氧化物質的濃度有關，抗氧化劑的濃度也并非越高越好。

表3 試驗結果方差分析Tab.3 Test results and variance analysis

2.3 交互效應分析

由茶多酚（X1）、大豆異黃酮（X2）、植酸（X3）、花青素（X4）、Vc∕Ve（X5）與DPPH（Y1）、總酚含量（Y2）、羥基自由基清除率（Y3）、超氧陰離子自由基清除率（Y4）、ABTS清除率（Y5）所得的5個回歸方程可知:清除DPPH自由基時，大豆異黃酮與花青素組合、植酸與花青素組合、植酸與Vc∕Ve組合、花青素與Vc∕Ve組合之間為拮抗關系，其余兩兩組合為協(xié)同關系；茶多酚與大豆異黃酮組合、大豆異黃酮與植酸組合、植酸Vc∕Ve組合對總酚含量表現(xiàn)為協(xié)同關系，其余組合表現(xiàn)為拮抗關系；清除羥基自由基時，茶多酚與植酸組合、大豆異黃酮與花青素組合、大豆異黃酮與Vc∕Ve組合、植酸與花青素組合、植酸與Vc∕Ve組合之間為協(xié)同效應，其余為拮抗關系；測定超氧陰離子自由基時，只有大豆異黃酮與花青素之間存在拮抗關系，其余組合均表現(xiàn)為協(xié)同關系；測定ABTS自由基時，茶多酚與植酸、茶多酚與花青素兩種組合之間為協(xié)同關系，其余為拮抗關系。同時，通過對抗氧化綜合評分（Y6）的分析可知:在發(fā)酵烘焙處理下，五種天然抗氧化劑中只有茶多酚與植酸、花青素、Vc∕Ve 3種組合間存在協(xié)同效應，而其余各兩兩組合之間均為拮抗關系。

2.4 實現(xiàn)最佳抗氧化性方案

采用Design-Expert 8.0.6 Trial對實驗結果進行響應曲面分析，求得在面包中加入天然抗氧化物質的最佳添加方案為:茶多酚（X1）在0水平（0.275 g∕kg），大豆異黃酮（X2）在0水平（0.005 g∕kg）、植酸（X3）在0水平（0.1 g∕kg）、花青素（X4）在0水平（0.09 g∕kg）、Vc∕Ve（X5）在1水平（0.140∶0.033 g∕kg）。

3 結論與討論

抗氧化劑應用最廣泛的為食品工業(yè)，食品工業(yè)的快速發(fā)展也反向促進了抗氧化劑的研究、開發(fā)和生產利用?？寡趸瘎┠軌蛴行ё柚够蛲七t物質的氧化。抗氧化劑可分為天然抗氧化劑和人工合成抗氧化劑，其中天然抗氧化劑是從天然動、植物體或其代謝物中提取出來的具有抗氧化活性的物質，特別是植物源抗氧化劑如多酚類、多糖類、黃酮類、維生素類、植酸、含氮化合物等，具有來源廣泛、提取率高、抗氧化能力強、與機體親和力強和安全性高等優(yōu)點[22]，但單獨使用某一種抗氧化劑時，結構的單一性，清除的特異性會使其抗氧化性受到局限。因而復配可以達到提高抗氧化性能、降低使用成本的目的[23]。本文在單一添加天然抗氧化劑的研究基礎之上，針對面包焙烤成分，選用了多種天然抗氧化物質，包括水溶性和脂溶性天然抗氧化劑進行了復配抗氧化劑研究，這一結果為天然抗氧化物質在面包中的利用提供實際參考數(shù)據(jù)。

3.1 面包中復配抗氧化劑組合的篩選

為了得到更好的復配劑效果，在進行了5種抗氧化劑的單因素試驗的基礎上，運用回歸設計的理念與方法，分析得出在面包中加入5種抗氧化物質后能得達到最佳抗氧化性的組合為:茶多酚0.275 g∕kg，大豆異黃酮0.005 g∕kg、植酸0.1 g∕kg、花青素0.09 g∕kg、Vc∕Ve復合比例0.140∶0.033 g∕kg。5種天然抗氧化劑對于綜合抗氧化性來說，茶多酚與植酸、花青素、Vc∕Ve 3種組合間存在協(xié)同效應，這與在非食品相關試驗中的結論相符[23-26]，比如茶多酚與竹蓀、海帶復配后[27]，其抗氧化能力得到提高，產生了正向協(xié)同效應，同時也存在量效關系，其余各兩兩組合之間均為拮抗關系。且從單因子對綜合抗氧化性的影響程度來看，大豆異黃酮與花青素占據(jù)主要地位。人體中的自由基以超氧陰離子自由基與羥基自由基為主，清除超氧陰離子自由基時近乎所有組合都為協(xié)同效應，清除羥基自由基時，茶多酚、大豆異黃酮、花青素均存在協(xié)同效應組合。故此建議在面包中添加茶多酚、大豆異黃酮、花青素3種抗氧化劑。

3.2 茶多酚的保護作用

在對食品花生油[28]、杏仁油[29]、鹵制雞翅[30]、香腸[31]等和抑菌抗氧化保護[32-33]中，已經有大量案例采用復配天然抗氧化劑，結果均表明復配抗氧化劑較單一抗氧化物質抗氧化能力強，而且無一例外的表明了茶多酚在復配配方中的作用，也說明茶多酚在復合抗氧化劑中的高效性[34]。茶多酚的協(xié)同機理可以解釋為基于氧化還原電位差的偶聯(lián)氧化。偶聯(lián)作用可以使直接反應的兩種物質間的電位落差降低，使反應易于進行；同時在反應體系中，使偶聯(lián)的抗氧化劑油水分配系數(shù)合理分布，使每一種抗氧化劑的功能得到充分發(fā)揮，因而茶多酚的協(xié)同作用大大增強了抗氧化效果。茶多酚本身具有較強的還原性，其結構中的酚羥基提供氫后發(fā)生氧化反應，形成具有穩(wěn)定性較高的含有鄰苯二酚結構的自由基，達到清除機體內大量的有害自由基的目的[26]。同時茶多酚對大部分自由基的清除率均達到顯著水平，但因在面包制作（揉捏、焙烤、發(fā)酵）過程中抗氧化物質會產生損失，故在發(fā)酵、焙烤的條件下的抗氧化物質組合中，茶多酚也可起到一種保護作用。同時茶多酚與植酸、花青素、Vc∕Ve 3種天然抗氧化劑間存在協(xié)同效應，因此加入茶多酚可以損失更少的抗氧化物質，從而保證面包的抗氧化營養(yǎng)。此外，根據(jù)單因素試驗與二次正交旋轉組合試驗抗氧化性的結果比對可見，添加組合配方后面包的綜合抗氧化評分與大豆異黃酮、花青素的單因素實驗結果相近，與實驗結果大豆異黃酮、花青素對面包的抗氧化綜合評分影響較大的結論相符；對于Vc∕Ve來說加入組合配方后較單因素時的抗氧化性能有所提升，和茶多酚、Vc∕Ve間存在協(xié)同效應相互印證，也和孫世利等[9]的研究結果相符。抗氧化物質之間的協(xié)同抗氧化作用與抗氧化物質本身的抗氧化能力，抗氧化物質有效濃度的高低等因素有關?？寡趸镔|之間的協(xié)同作用，在抗氧化物質本身有效濃度較低時協(xié)同作用也較低，隨著有效濃度增加，協(xié)同抗氧化作用增加，達到一個峰值后，隨著有效濃度的繼續(xù)增加，協(xié)同作用會逐漸減弱[35]。

3.3 天然抗氧化物質的選擇

在面包中，單甘酯、沙蒿膠和谷朊粉作為食品添加劑進行了復配以改善莜麥蔓越莓面包[36]。在本實驗中，針對面包制作所使用的成分，首次嘗試了在面包中復配使用包含了水溶性和脂溶性兩類抗氧化物質，并進行了配方優(yōu)化，結果印證了前人多種抗氧化劑的效果優(yōu)于單一抗氧化劑作用，也提出了抗氧化物質的添加并非種類越多越好，因為抗氧化物質之間不僅存在協(xié)同作用，同樣也存在拮抗作用，因此在添加抗氧化物質時，需要考慮各物質的化學成分，通過抗氧化劑種類、濃度、比例的優(yōu)化來使用成本，提高產品抗氧化能力。在本實驗中特別加入了花青素這一天然抗氧化物質，通常認為花青素與營養(yǎng)品質有關，最新研究表明花青素可以通過接近氨基酸集團對蛋白質的結構或者構象發(fā)生改變來影響加工品質，花青素與Gli、Glu相互結合，對兩種蛋白結構的變化，進而使得兩種蛋白中色氨酸和酪氨酸附近的微環(huán)境向親水性環(huán)境轉變，疏水性減小[24]。該研究結果為花青素對主食品品質的影響及花青素作為一種天然食品添加劑在主食品產業(yè)發(fā)展提供可靠的理論基礎和科學依據(jù)，而本實驗為這一結果的利用提供了數(shù)據(jù)支撐。

3.4 試驗誤差分析

試驗所得最優(yōu)組合（茶多酚0.275 g∕kg、大豆異黃酮0.005 g∕kg、植酸0.1 g∕kg、花青素0.09 g∕kg、Vc∕Ve復合比例0.140∶0.033）與回歸方程的擬合沒有達到極顯著，其原因可能是在食品中加入添加劑有一定的界限和安全標準，由于其添加量的限定導致試驗過程中計量的偏差，以致本試驗不能添加相關文獻所表述的相同計量；同時在優(yōu)化回歸方程時發(fā)現(xiàn)存在因子的回歸系數(shù)缺失的現(xiàn)象，相關因子作為不顯著項被剔除。說明5種因素對面包中的抗氧化性作用并未全部達到顯著水平，其原因可能是此5種抗氧化物質不完全適宜在發(fā)酵及烘焙的條件下添加，添加物質尚有待考究。

綜上雖然不同的天然抗氧化物質對體內的不同自由基的清除效果不同，多種抗氧化物質的組合效果更佳，但同時存在抗氧化物質之間的拮抗作用，5種抗氧化物的添加組合并非完全適用。本文基于試驗方程分析結果上建議在面包中添加茶多酚（0.275 g∕kg）、大豆異黃酮（0.005 g∕kg）、花青素（0.09 g∕kg）3種天然抗氧化物質，其中大豆異黃酮、花青素是對綜合抗氧化性能影響較大的2個因子，茶多酚則起到保護作用。同時，人體中主要以超氧陰離子自由基這樣的氧自由基為主，故選擇時應傾向于對其清除率影響較大的因子。試驗結果和人體需求達到一致，綜合考慮建議在面包中添加茶多酚（0.275 g∕kg）、大豆異黃酮（0.005 g∕kg）、花青素（0.09 g∕kg）。

致謝：陳黎老師在實驗設計以及數(shù)據(jù)處理中給予了大力幫助，謹致謝意！