抗呋喃它酮代謝物衍生物單鏈抗體-堿性磷酸酶融合蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

陳薪竹，杜華英，洪艷平，王 丹，王玉波，楊武英，熊建華

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院∕南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330045）

【研究意義】呋喃它酮是一種人工合成的硝基呋喃類抗生素[1-2]。研究表明，呋喃它酮及其代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-惡唑烷基酮（5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ）屬于強(qiáng)致癌物，已被禁止使用[3-6]。呋喃它酮原藥在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，但其代謝物AMOZ會(huì)與動(dòng)物細(xì)胞膜蛋白形成結(jié)合態(tài)長(zhǎng)期存留在體內(nèi)難以消除[7]，人類使用此類食物后會(huì)造成潛在危害，因此代謝物的檢測(cè)比原藥更有意義[8-9]。受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，此類藥物非法使用情況仍很嚴(yán)重，所以建立AMOZ殘留的檢測(cè)方法有著十分緊迫的現(xiàn)實(shí)意義。【前人研究進(jìn)展】AMOZ殘留檢測(cè)常用的方法主要有儀器分析法[10-15]和免疫分析法[16-18]等。免疫分析法作為近年來發(fā)展迅速的一種快檢方法，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，在動(dòng)物性食品AMOZ殘留快速篩查中優(yōu)勢(shì)明顯。在免疫分析方法建立中，抗體質(zhì)量好壞直接影響其靈敏度。單鏈抗體（single chain variable fragment，scFv）作為基因工程抗體，是近年來的研究熱點(diǎn)之一，分子量小、抗原性低，可通過發(fā)酵大量生產(chǎn)，極大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)抗體的不足[19-20]，目前已成為了應(yīng)用最廣泛的基因重組抗體之一。且scFv能與堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）有效結(jié)合形成融合蛋白，此融合蛋白在保留抗體分子生物活性的同時(shí)也保留了AP酶活性，在實(shí)際檢測(cè)中免去了酶標(biāo)二抗的使用，縮短了操作時(shí)間。【本研究切入點(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒plip6∕GN-AMOZscFv，可溶性表達(dá)載體plip6∕GN本身帶有的AP酶基因，可將轉(zhuǎn)入的scFv基因與載體中本身帶有的AP酶基因進(jìn)行融合表達(dá)，得到既具有抗體活性又保留AP酶活性的融合蛋白AMOZscFv-AP。但載體plip6∕GN的拷貝數(shù)低導(dǎo)致外源基因的表達(dá)量也不高，因此，優(yōu)化融合蛋白的表達(dá)條件為為后期融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)制備具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)對(duì)能表達(dá)抗AMOZscFv-AP融合蛋白的基因工程菌進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，有效提高融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量，為后期融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)制備和基于此融合蛋白的動(dòng)物性食品中AMOZ殘留免疫快速篩查方法的建立奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所選大腸桿菌E.coliBL21（DE3)、DH5α、Top10、XL1-BLUE均由本實(shí)驗(yàn)室保存，陰性對(duì)照質(zhì)粒plip6∕GN購(gòu)于BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心，陽(yáng)性重組質(zhì)粒plip6∕GN-AMOZscFv（氨芐青霉素抗性Ampicillin，Amp）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[21-22]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同宿主菌對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響 重組質(zhì)粒plip6∕GN-AMOZscFv分別轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3)、DH5α、Top10、XL1-BLUE后，涂布LB-Amp（100 μg∕mL）平板37 ℃培養(yǎng)過夜，次日挑取單菌落接種至LB-Amp（100μg∕mL）液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r∕min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切鑒定后，加入IPTG（0.6 mmol∕L）誘導(dǎo)表達(dá)7 h，同時(shí)將plip6∕GN-BL21（DE3）設(shè)置為空菌對(duì)照。菌液離心，取沉淀加入50μL水和等體積2×蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min后利用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)，并使用Quantity one V4.6.6軟件對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行分析，優(yōu)選出最適宿主菌。

1.2.2 最適培養(yǎng)基的選擇 在最適宿主菌條件下將基因工程菌復(fù)蘇培養(yǎng)，以10%接種量將其轉(zhuǎn)接至100 mL含有Amp（100 μg∕mL）的SOB、SOC、TB、2xYT、LB、SB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方見文獻(xiàn)[23]。37 ℃、250 r∕min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后誘導(dǎo)表達(dá)7 h，經(jīng)SDS-PAGE分析比較融合蛋白表達(dá)量，優(yōu)選出適合融合蛋白表達(dá)的最佳培養(yǎng)基。

1.2.3 最適培養(yǎng)基初始pH的選擇 將基因工程菌plip6∕GN-scFv∕BL21（DE3）轉(zhuǎn)接至初始pH值為6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的最適培養(yǎng)基SB中，誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE分析比較融合蛋白表達(dá)量，優(yōu)選出培養(yǎng)基的最適初始pH值。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)期的選擇 在確定了初始pH的SB培養(yǎng)基的條件下，將基因工程菌plip6∕GN-scFv∕BL21（DE3）分別培養(yǎng)至OD600分別為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0，IPTG（0.6 mmol∕L）誘導(dǎo)7 h后，經(jīng)SDSPAGE分析比較融合蛋白表達(dá)量，確定最適誘導(dǎo)時(shí)期。

1.2.5 誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的選擇 在最優(yōu)初始pH的SB培養(yǎng)基的條件下，培養(yǎng)菌液至最適誘導(dǎo)時(shí)期加入IPTG（0.6 mmol∕L），分別誘導(dǎo)表達(dá)3，4，5，6，7，8，9，10 h后，經(jīng)SDS-PAGE分析比較融合蛋白表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.6 IPTG濃度的選擇 在上述所有優(yōu)選出的最佳條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)劑IPTG濃度的選擇，將IPTG濃度分別設(shè)為0.1，0.6，1.0 mmol∕L，誘導(dǎo)9 h，SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)量，考察不同IPTG濃度對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)的影響。

1.2.7 AMOZscFv-AP融合蛋白的活性檢測(cè) 在上述選出的最佳表達(dá)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析后轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上，以鼠抗大腸桿菌堿性磷酸酶單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western-blotting分析，同時(shí)設(shè)空載體為空白對(duì)照。采用dcELISA對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液上清中的融合蛋白進(jìn)行活性檢測(cè)，步驟如下:將包被抗原AMOZA-OVA用碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）稀釋至1 μg∕mL后加入酶標(biāo)板中，100μL∕孔，4 ℃放置過夜；PBST洗滌3次，每孔加入200μL封閉液（5%脫脂奶粉）37 ℃封閉3 h，每孔加入50μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)藥物NPAMOZ，接著每孔加入50μL一定稀釋倍數(shù)的AMOZscFv-AP融合蛋白，37 ℃下孵育45 min加入，PBST洗滌5次,加入底物溶液對(duì)硝基苯磷酸二鈉100μL顯色10 min，最后加入100μL 3 mol∕L NaOH溶液終止反應(yīng)，于405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。使用軟件Originpro 8.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合計(jì)算，并繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適宿主菌的選擇

宿主菌的選擇對(duì)菌體生長(zhǎng)速度和后期外源基因進(jìn)行表達(dá)時(shí)的表達(dá)能力有一定影響，相同載體在不同宿主菌中的表達(dá)水平會(huì)有所不同，有的甚至不表達(dá)[24]。由于plip6∕GN載體融合表達(dá)外源基因時(shí)的拷貝數(shù)一般較低，為了有效提高融合蛋白AMOZscFv-AP的表達(dá)量，本試驗(yàn)將重組質(zhì)粒plip6∕GNAMOZscFv轉(zhuǎn)化至不同大腸桿菌（E.coliDH5α、Top10、XL1-BLUE、BL21（DE3)）中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選出最適宿主菌。4種轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果如圖1A所示，得到了750 bp左右的scFv基因片段。酶切鑒定所用酶為BglI，plip6∕GN空載體序列中有3個(gè)BglI酶切位點(diǎn)，空載體經(jīng)BglI酶切后有2條2 000 bp左右和一條3 000 bp左右的條帶，在電泳圖中2 000 bp處的條帶會(huì)更亮，plip6∕GN-scFv重組質(zhì)粒經(jīng)BglI酶切后有一條2 000 bp左右和2條3 000 bp左右的條帶，在電泳圖中3 000 bp處條帶會(huì)更亮，由圖1PCR、酶切鑒定結(jié)果可知結(jié)果正確。說明plip6∕GN-scFv重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化至4種大腸桿菌中。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后觀察SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在選擇的4種宿主菌的蛋白表達(dá)物中均出現(xiàn)了AMOZscFv-AP融合蛋白的表達(dá)條帶（圖2A），條帶大小約為55～70 ku。利用軟件Quantity one V4.6.6分析得到宿主菌E.coliBL21（DE3）中的表達(dá)水平最高約達(dá)7.94%（圖2B），所以將E.coliBL21（DE3）作為最適宿主菌。這可能是因?yàn)樗拗骶鶥L21（DE3）為載體plip6∕GN上的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子提供了其所需的特異性結(jié)合蛋白，且菌內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境有利于此類融合蛋白的表達(dá)、積累。

圖1 重組質(zhì)粒PCR鑒定（A）和酶切鑒定結(jié)果（B）Fig.1 Identification of the recombinant plasmid Plip6∕GN-scFv by PCR（A）and restriction enzyme digestion（B）

圖2 宿主菌對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of host bacteria on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein

2.2 培養(yǎng)基對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響

菌體在生長(zhǎng)過程中，培養(yǎng)基為其提供了生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)成分，同一菌體在營(yíng)養(yǎng)成分不同的培養(yǎng)基中，其生長(zhǎng)狀態(tài)存在著較大差異[23]。通常，細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)成分充足的培養(yǎng)基中更容易生長(zhǎng)，且融合蛋白的表達(dá)更好。對(duì)比6種不同培養(yǎng)基對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響，由圖3可得，相比其他5種培養(yǎng)基，由SB培養(yǎng)基培養(yǎng)的基因工程菌plip6∕GN-scFv∕BL21（DE3）經(jīng)誘導(dǎo)后，AMOZscFv-AP融合蛋白的表達(dá)水平最高，利用軟件Quantity one V4.6.6分析其表達(dá)量約達(dá)9.09%。SB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基都是由胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉組成，但對(duì)比各組分含量發(fā)現(xiàn)，SB培養(yǎng)基中酵母提取物濃度比LB培養(yǎng)基高2倍。所以將SB培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of different media on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein

2.3 培養(yǎng)基初始PH對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響

菌株在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，除培養(yǎng)基的成分會(huì)影響菌體生長(zhǎng)外，培養(yǎng)基的初始pH值也與菌體的生長(zhǎng)代謝有著密切相關(guān)的聯(lián)系。pH值不同，往往會(huì)引起菌體代謝過程的不同。pH偏離太大時(shí)，菌體中各種酶的活性會(huì)受到影響，進(jìn)而妨礙了菌體的新陳代謝；而且會(huì)調(diào)度微生物細(xì)胞膜原本的電荷狀態(tài)，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，影響微生物代謝產(chǎn)物的排泄及某些組分的解離，從而導(dǎo)致目的蛋白的表達(dá)發(fā)生差異[25]。通常，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值在6.8～7.6范圍內(nèi)時(shí)適合菌體的生長(zhǎng)代謝。由圖4可知，將SB培養(yǎng)基的初始pH調(diào)整到6.8～7.0時(shí)，融合蛋白AMOZscFv-AP的表達(dá)水平最高，表達(dá)量經(jīng)軟件Quantity one V4.6.6分析其約達(dá)9.71%。之后，隨著pH值的不斷增高，融合蛋白的表達(dá)量逐漸呈下降趨勢(shì)。因此，當(dāng)SB培養(yǎng)基初始pH為7.0時(shí)更適合外源蛋白AMOZscFv-AP表達(dá)。

圖4 不同培養(yǎng)基初始PH對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of initial pH of media on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein

2.4 誘導(dǎo)時(shí)期對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響

對(duì)于通過熱誘導(dǎo)方式來實(shí)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)的工程菌來說，過早進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，菌液中不僅菌體含量少，且目的蛋白的表達(dá)量很低；過晚誘導(dǎo)表達(dá)，菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝已趨于緩慢、酶活性也明顯降低，從而也會(huì)導(dǎo)致表達(dá)量明顯下降[26]。當(dāng)菌體細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期時(shí)，菌體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯酶體系生長(zhǎng)代謝極為旺盛，此時(shí)期適合進(jìn)行蛋白表達(dá)。如圖5所示，在不同OD值下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白表達(dá)水平各有差異，當(dāng)OD600為0.6時(shí)，外源基因進(jìn)行蛋白表達(dá)其表達(dá)量最高約達(dá)10.5%，隨后蛋白表達(dá)量逐漸呈下降趨勢(shì)。因此，當(dāng)OD600為0.6即對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)最好。

圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)期對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of different induction periods on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein

2.5 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響

IPTG作為一種誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，與乳糖操縱子作為啟動(dòng)子不同的是，IPTG不會(huì)被細(xì)胞代謝掉，且在結(jié)構(gòu)上與乳糖相似，因此它可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的持續(xù)表達(dá)。但I(xiàn)PTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)蛋白表達(dá)量有著直接影響，誘導(dǎo)時(shí)間過短，其目的蛋白量就少；誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)，其表達(dá)量增高不明顯，耗費(fèi)時(shí)間和能源[27]。為了探究不同誘導(dǎo)時(shí)間后的蛋白表達(dá)量情況，本試驗(yàn)選擇了8個(gè)不同誘導(dǎo)時(shí)間來觀察其差異。如圖6所示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，蛋白表達(dá)量也呈逐步上升的趨勢(shì)，誘導(dǎo)9 h后，表達(dá)量趨于平穩(wěn)。因此，可確定融合蛋白AMOZscFv-AP的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為9 h。

圖6 不同誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.6 Effect of different induction expression time on the expression level of AMOZscFv-AP fusion protein

2.6 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響

IPTG本身是有一定毒性的，當(dāng)IPTG濃度過高時(shí)，不僅不利于蛋白表達(dá)，而且還會(huì)產(chǎn)生毒性破壞菌體的生長(zhǎng)[28-29]。為了探究不同IPTG濃度對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響，將IPTG濃度分別設(shè)為0.1，0.6，1.0 mmol∕L，結(jié)果如圖7所示，當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)9 h后，不同IPTG濃度下誘導(dǎo)后均在70 ku左右出現(xiàn)了明顯的目的條帶，0.6 mmol∕L濃度下誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量較高，但差異并不明顯。因此，選擇濃度為0.6 mmol∕L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。

圖7 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)AMOZscFv-AP融合蛋白表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of different IPTG concentrations on the expression of AMOZscFv-AP fusion protein.

2.7 融合蛋白的活性鑒定

在上述優(yōu)選出的最佳表達(dá)條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blotting分析。因?yàn)锳MOZscFv蛋白分子量為20～30 ku，AP酶分子量為50～60 ku，所以AMOZscFv-AP融合蛋白分子量約為70 ku。SDS-PAGE結(jié)果如圖3A（1）所示，與plip6∕GN∕BL21（DE3）對(duì)照菌相比，plip6∕GN-scFv-phoA∕BL21（DE3）工程菌在分子量55～72 ku處出現(xiàn)一條新生蛋白帶，該條帶就是AMOZscFv-AP融合蛋白，經(jīng)軟件Quantity one V4.6.6分析得到該條帶的表達(dá)水平達(dá)11.45%，比表達(dá)條件優(yōu)化前的表達(dá)量（7.94%）增加了3.51%，有效提高了表達(dá)量。Western-blotting結(jié)果如圖3A（2）所示，轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜后plip6∕GNscFv-phoA∕BL21（DE3）菌體總蛋白泳道50～70 ku處出現(xiàn)明顯的AMOZscFv-AP融合蛋白印跡條帶。以標(biāo)準(zhǔn)藥物NPAMOZ濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，B∕B0為縱坐標(biāo)（B表示不同藥物濃度下的OD405，B0表示不加藥物時(shí)的OD405），得到dcELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3B），通過軟件Originpro 8.5擬合計(jì)算得到IC50值和最低檢測(cè)限LOD值分別為10.62 ng∕mL、4.83 ng∕mL，這說明在上述優(yōu)選的表達(dá)條件下誘導(dǎo)表達(dá)得到的AMOZscFv-AP融合蛋白具有良好的生物活性。

圖8 AMOZscFv-AP融合蛋白的SDS-PAGE、Western-Blot（A）鑒定和NPAMOZ的dcELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig.8 Identification of the AMOZscFv-AP fusion protein by SDS-PAGE，Western Blot（A）and dcELISA standard curve of NPAMOZ（B）

3 討論

單鏈抗體常用的表達(dá)系統(tǒng)為原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)形式包括包涵體表達(dá)和可溶性表達(dá)。包涵體表達(dá)的蛋白表達(dá)量高，但其需要蛋白變性、復(fù)性等步驟，操作繁瑣，且蛋白經(jīng)變性、復(fù)性后活性會(huì)受到一定的影響；與包涵體表達(dá)相比，可溶性表達(dá)不需要蛋白變性、復(fù)性等操作，直接在菌液上清和周質(zhì)腔里表達(dá)出了有活性的目的蛋白，其表達(dá)量雖沒有包涵體表達(dá)的產(chǎn)量多，但這不會(huì)對(duì)目的蛋白的生物學(xué)活性造成影響[30]。在前期工作中，筆者將構(gòu)建好的抗AMOZ衍生物單鏈抗體（AMOZscFv）基因轉(zhuǎn)入PET-22b（+）載體并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，得到的是包涵體表達(dá)的帶His標(biāo)簽的scFv，需要經(jīng)過變性、復(fù)性后才能得到具有活性的抗體蛋白，基于此蛋白建立的免疫檢測(cè)方法都為間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法[21-22]。

本試驗(yàn)所用的plip6∕GN表達(dá)載體是一種可溶性表達(dá)載體，AMOZ-scFv基因能與表達(dá)載體中的AP酶基因進(jìn)行可溶性融合表達(dá)，此融合表達(dá)后的蛋白既有抗體活性又保留了AP酶的活性，基于此融合蛋白建立的免疫檢測(cè)方法都為直接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法，和基于包涵體抗體蛋白建立的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法相比，免去了酶標(biāo)二抗和抗His標(biāo)簽抗體的使用，還省略了這2種抗體加入后的洗滌步驟，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。但是AMOZ-scFv基因在plip6∕GN表達(dá)載體中融合表達(dá)時(shí)的拷貝數(shù)不高，為了有效提高此融合蛋白的表達(dá)量，本試驗(yàn)對(duì)融合蛋白AMOZscFv-AP在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，將重組質(zhì)粒plip6∕GN-AMOZscFv轉(zhuǎn)化至不同大腸桿菌中，確定最適宿主菌，然后分別研究不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)基初始pH、不同誘導(dǎo)時(shí)期、不同誘導(dǎo)時(shí)間和不同濃度蛋白誘導(dǎo)表達(dá)劑IPTG對(duì)最適宿主菌中融合蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明以初始pH為7.4的SB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基、在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期即OD600為0.6時(shí)采用濃度為0.6 mmol∕L的IPTG對(duì)融合蛋白AMOZscFv-AP進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)9 h，融合蛋白表達(dá)量約達(dá)11.45%，成功提高了抗AMOZ單鏈抗體在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量，為后期AMOZscFv-AP融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)制備和基于此融合蛋白的動(dòng)物性食品中AMOZ殘留免疫快速篩查方法的建立奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有較好的應(yīng)用前景。