平榛PYL基因家族全基因組鑒定及果實(shí)發(fā)育表達(dá)分析

張興政，趙豫川，陳 玥，孫 博，劉劍鋒

（吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∕吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林四平 136000）

【研究意義】平榛（Corylus heteropylla），山毛櫸目（Fagales），樺木科（Betulaceae），榛屬（Corylus）植物，其繁殖方式主要通過(guò)風(fēng)媒授粉，因其果實(shí)種仁富含油脂、蛋白、維生素和膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種重要經(jīng)濟(jì)林木[1]。榛子分布范圍較廣，在歐洲、亞洲和北美洲均有分布，在我國(guó)尤以東北地區(qū)為主，榛果也是東北重要特色食品之一。近年來(lái)，我國(guó)的榛子的栽培面積和產(chǎn)量也在不斷增加[2]，對(duì)東北等地方經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有著重要的影響。因此，對(duì)于榛子果實(shí)發(fā)育分子機(jī)制的深入研究將有助于后續(xù)輔助榛子品種的選育，利于榛子的高質(zhì)量生產(chǎn)。【前人研究進(jìn)展】植物激素脫落酸（Abscisic acid，ABA）在植物種子成熟、休眠、生長(zhǎng)及幼苗生長(zhǎng)等各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，也與植物的高鹽、干旱、水澇等非生物脅迫響應(yīng)也密切相關(guān)[3-5]。ABA對(duì)植物的調(diào)控是通過(guò)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，研究發(fā)現(xiàn)，PYR∕PYL∕RCAR（Pyrabactin Resistance1∕PYR1-like∕Regulatory Component of ABA Receptor），能夠通過(guò)與脅迫誘導(dǎo)的ABA結(jié)合，從而參與植物體內(nèi)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，因此被認(rèn)為是一種ABA可溶性受體[6]。ABA通過(guò)結(jié)合Pyra‐bactin resistance 1-like（PYL）后與Protein Phosphatases 2C（PP2C）進(jìn)一步結(jié)合形成ABA-PYL-PP2C復(fù)合體，并抑制PP2C蛋白的磷酸酶活性[7]，進(jìn)而與PP2C結(jié)合的Sucrose non-fermenting 1-related Protein Ki‐nase 2s（SnRK2s）被釋放，調(diào)控下游效應(yīng)蛋白實(shí)現(xiàn)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以參與植物發(fā)育或脅迫響應(yīng)調(diào)控[8-9]。目前，在擬南芥[10-12]、水稻[13-14]、大豆[15]、葡萄[16-17]和蘋果[18]等植物中均鑒定獲得該基因家族成員，部分基因其生物學(xué)功能也進(jìn)行了深入研究?？傮w上，對(duì)基因響應(yīng)非生物脅迫研究較多，例如，過(guò)表達(dá)OsPYL10、Os-PYL6均能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性[19-20]，且前者還能提高植株的耐寒性；異源表達(dá)野葡萄VyPYL9則能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性[21]，相較而言，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控領(lǐng)域研究較少。擬南芥中共鑒定得到14個(gè)PYLs基因家族成員，且研究發(fā)現(xiàn)部分基因存在功能冗余，導(dǎo)致部分單基因突變不影響其對(duì)ABA敏感性，但多基因成員突變則會(huì)導(dǎo)致ABA高度不敏感[7,10]；且研究發(fā)現(xiàn)除了AtPYL13外，其他成員均可與ABA結(jié)合抑制蛋白磷酸酶PP2C的活性[22]，但另有研究也表明，AtPYL13在ABA存在的時(shí)候可以與A類PP2C蛋白相結(jié)合以實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能[23]；在ABA處理后11個(gè)成員其表達(dá)水平產(chǎn)生了顯著變化，AtPYL11和AtPYL13在成熟種子中特異表達(dá)，且在ABA介導(dǎo)的種子萌發(fā)過(guò)程中起正調(diào)控作用[11]，其中，AtPYL11還可通過(guò)延遲種子萌發(fā)和通過(guò)ABA依賴或不依賴途徑誘導(dǎo)的氣孔快速關(guān)閉來(lái)響應(yīng)冷害脅迫[5]；外源ABA處理能夠抑制擬南芥?zhèn)雀L(zhǎng)，且敲除AtPYL8和AtPYL9后側(cè)根生長(zhǎng)抑制時(shí)間更長(zhǎng)且對(duì)ABA敏感性下降[24]；對(duì)煙草NtPYLs研究發(fā)現(xiàn)，其在不同組織中表達(dá)水平存在差異，且響應(yīng)非生物脅迫表達(dá)模式也各有不同，其中NtPYL19∕20∕28∕29可能參與ABA響應(yīng)及種子萌發(fā)，NtPYL6∕710∕11∕12則可能參與非生物脅迫響應(yīng)[25]。研究還發(fā)現(xiàn)ABA信號(hào)通路也參與調(diào)控植物果實(shí)成熟，對(duì)番茄施加ABA能夠通過(guò)誘導(dǎo)乙烯合成通路來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)其果實(shí)成熟[26]；且番茄中的12個(gè)PYL同源基因中[27]，SlPYL9在其花、種子及果實(shí)中均有表達(dá)，且過(guò)表達(dá)或抑制SlPYL9基因可影響植株對(duì)ABA的敏感性，也通過(guò)改變ABA信號(hào)通路PP2C1/2/9、SnRK2.8等基因的表達(dá)，進(jìn)而影響乙烯的釋放、細(xì)胞壁的形成及果實(shí)成熟[28]。

【本研究切入點(diǎn)】作為ABA受體，PYLs在參與植物果實(shí)發(fā)育的研究十分欠缺，因此該基因家族參與平榛果實(shí)發(fā)育的研究將對(duì)PYLs基因功能研究領(lǐng)域的重要補(bǔ)充。本研究中借助生物信息學(xué)方法從本實(shí)驗(yàn)測(cè)序所得的平榛（Corylus heteropylla）全基因組中篩選并鑒定得到8個(gè)ABA受體基因（ChPYR/PYL/RCAR，簡(jiǎn)稱為ChPYLs），最終明確了其相應(yīng)的理化、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等，并基于課題組現(xiàn)有高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)明確了各基因在子房及胚珠不同發(fā)育時(shí)期其表達(dá)水平，也進(jìn)一步利用qRT-PCR驗(yàn)證了其在胚珠不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，可初步篩選出參與榛子果實(shí)發(fā)育的候選基因，將為后續(xù)深入研究榛子果實(shí)發(fā)育提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

本研究榛子果實(shí)材料取自12年樹齡的平歐雜交榛品種“達(dá)維”（吉林，四平），在胚珠發(fā)育的4個(gè)不同時(shí)期進(jìn)行取樣，分別為胚珠形成期（OV1），早期胚珠生長(zhǎng)期（OV2），胚珠快速生長(zhǎng)期（OV3）以及胚珠成熟期（OV4）[29]，采集后迅速液氮冷凍；胚珠材料RNA提取選用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）；反轉(zhuǎn)錄試劑及熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自天根生化科技有限公司（北京）；研究中所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 數(shù)據(jù)下載及榛子PYL同源序列篩選及鑒定

本研究所涉及到的擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、葡萄（Vitis vinifera）和橡膠樹（Hevea brasiliensis）PYL基因家族編碼序列（Coding sequences，CDS）及其編碼蛋白序列下載于TAIR（https:∕∕www.arabidopsis.org∕）、Phytozome 12.0（https:∕∕phytozome.jgi.doe.gov∕pz∕portal.html）及NCBI（https:∕∕www.nc‐bi.nlm.nih.gov∕）等數(shù)據(jù)庫(kù)，其擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)為Arabidopsis thalianaTAIR10。平榛全基因組為本實(shí)驗(yàn)室首次測(cè)序完成（基因組數(shù)據(jù)上載于http:∕∕218.27.6.107∕#∕map，尚未發(fā)表）。為鑒定榛子中PYL基因家族成員，以14條擬南芥PYL蛋白序列和11條橡膠樹PYL蛋白序列作為檢索序列，通過(guò)BioEdit軟件進(jìn)行BlastP本地同源比對(duì)（E-value ＜e-20，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)參數(shù)），從平榛基因組中篩選PYLs同源序列；對(duì)篩選結(jié)果人工排除重復(fù)、相似度低或不完整短序列（無(wú)PYR_PYL_RCAR_like結(jié)構(gòu)域或不完整），為確保候選基因準(zhǔn)確和可靠性。并將其編碼蛋白序列再次進(jìn)行Pfam（http:∕∕pfam.xfam.org∕）以及PROSITE（https:∕∕prosite.expasy.org∕）在線工具預(yù)測(cè)；通過(guò)ProtParam在線工具（https:∕∕web.expasy.org∕protparam∕）分析蛋白分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化參數(shù)；通過(guò)WoLF PSORT在線預(yù)測(cè)工具（https:∕∕wolfpsort.hgc.jp∕）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3 ChPYLs基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

本研究利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析。提取擬南芥、水稻和橡膠樹PYLs蛋白序列，并與本研究篩選的ChPYLs蛋白序列通過(guò)Clustal W程序（默認(rèn)參數(shù)比對(duì)）進(jìn)行多重序列比對(duì)，對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，采用鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構(gòu)建基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹，計(jì)算模型為“No.of differences”，空位處理設(shè)置為“Pairwise deletion”，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap設(shè)置為500；對(duì)獲得的系統(tǒng)進(jìn)化樹并利用Evolview在線工具（https:∕∕www.evolgenius.info∕evolview∕）進(jìn)行美化和可視化。

1.4 ChPYLs基因序列及其編碼蛋白比對(duì)、保守結(jié)構(gòu)域分析

為研究基因?qū)?yīng)結(jié)構(gòu)，從本實(shí)驗(yàn)室搭建的在線平榛基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Hazel Omic，http:∕∕218.27.6.107∕#∕map，未發(fā)表）中分別提取8條ChPYLs基因的CDS以及基因組序列，并提交到在線基因結(jié)構(gòu)分析工具Gene Structure Display Server（GSDS，http:∕∕www.mybiosoftware.com∕gsds-2-0-gene-structure-display-server.html）進(jìn)行可視化。

基于篩選獲得的基因編碼蛋白序列，通過(guò)BioEdit軟件進(jìn)行多序列比對(duì)（Clustal W，比對(duì)參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)）；通過(guò)在線分析工具PSIPRED（http:∕∕bioinf.cs.ucl.ac.uk∕psipred∕）分析蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用MEME（http:∕∕meme-suite.org∕）、Pfam（http:∕∕pfam.xfam.org∕）、PROSITE，NCBI CDD（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕Structure∕cdd∕wrpsb.cgi）和Motif Scan（https:∕∕myhits.sib.swiss∕cgi-bin∕motif_scan）在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析蛋白序列中所包含的保守基序及結(jié)構(gòu)域，所預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域及基序均用TBtools軟件進(jìn)行可視化和美化[30]。

1.5 ChPYLs基因在果實(shí)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

子房及胚珠不同發(fā)育時(shí)期高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)源于本實(shí)驗(yàn)室前期研究，原始數(shù)據(jù)可下載于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕sra∕?term=PRJNA591492）；對(duì)ChPYLs基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證胚珠發(fā)育的4個(gè)時(shí)期表達(dá)水平，所用引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 平榛PYL同源序列全基因組篩選、鑒定及理化性質(zhì)分析

通過(guò)與擬南芥和橡膠樹PYLs蛋白序列進(jìn)行比對(duì)和挖掘，人工去除重復(fù)序列和短序列，在新組裝的平榛全基因組中篩選獲得8個(gè)PYL同源序列，基于其測(cè)序基因座位號(hào)分別命名為ChPYL1～ChPYL8。蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果表明（表2），ChPYLs基因家族成員所編碼蛋白其長(zhǎng)度在168～208個(gè)氨基酸（aa），其相應(yīng)蛋白分子量也介于18.8～22.6 kD；理論等電點(diǎn)（PI）其范圍為5.35～7.75；對(duì)蛋白不穩(wěn)定系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，其中ChPYL3，ChPYL5，ChPYL6和ChPYL8為穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)小于40），其它蛋白均為不穩(wěn)定蛋白；所有蛋白總平均親水性為負(fù)值，所以均為親水性蛋白；依據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ChPYLs蛋白可定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 ChPYLs基因序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為明確平榛ChPYLs基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究結(jié)合擬南芥、水稻、葡萄和橡膠樹4個(gè)物種PYLs基因所編碼蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ）。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，依據(jù)所構(gòu)建進(jìn)化枝，所有PYLs可分為3個(gè)組別（Group I，Group II和Group III），且各組中均包含5個(gè)物種的PYLs基因家族部分成員（圖1）。Group I包括3個(gè)ChPYLs，分別為Cor0021020.1（ChPYL1）、Cor0025220.1（ChPYL2）和Cor0203430.1（ChPYL7）；Group II包括3個(gè)ChPYLs，分別為Cor0031400.1（ChPYL3）、Cor0047750.1（ChPYL5）和Cor0050430.1（ChPYL6）；Group III包括2個(gè)ChPYLs，分別為Cor0035760.1（Ch-PYL4）和Cor0213400.1（ChPYL8）。分析結(jié)果還表明ChPYL基因家族其進(jìn)化關(guān)系與橡膠樹、葡萄更近，與擬南芥和水稻較遠(yuǎn)；擬南芥、水稻和橡膠樹部分成員各自組成較為獨(dú)立聚集的進(jìn)化枝，表明同一物種不同成員在進(jìn)化過(guò)程中可能由多次復(fù)制事件多產(chǎn)生；平榛8條ChPYLs基因其進(jìn)化分析結(jié)果則進(jìn)一步顯示，該基因家族在本物種中主要分為2個(gè)進(jìn)化枝，表明其可能來(lái)自于2個(gè)祖先基因（圖2A）。

表1 ChPYLs基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物Tab.1 Primers of ChPYLs used for real-time qRT-PCR

表2 平榛ChPYLs蛋白理化性質(zhì)Tab.2 The physical and chemical properties analysis of ChPYLs in Corylus heterophylla

2.2 ChPYLs基因及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析

以前人研究為基礎(chǔ)，本研究也進(jìn)一步分析了ChPYLs基因及其編碼蛋白序列的結(jié)構(gòu)及保守性。分析結(jié)果顯示，大多ChPYLs基因不含內(nèi)含子，只有ChPYL4和ChPYL8含2個(gè)內(nèi)含子，ChPYL5含有1個(gè)內(nèi)含子（圖2A）。通過(guò)NCBI中保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)所有ChPYLs蛋白均含有典型的PYR_PYL_RCAR_like結(jié)構(gòu)域（圖2B），這與其他物種該基因家族的相關(guān)研究結(jié)果相一致；利用Pfam在線分析工具分析也發(fā)現(xiàn)所有蛋白均含有1個(gè)Polyketide_cyc2結(jié)構(gòu)域（PF10604），該結(jié)構(gòu)域是START超家族中的重要結(jié)構(gòu)[31]，但比較不同成員間該結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，ChPYL5中該結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度較之其他成員更短，結(jié)合其基因結(jié)構(gòu)比較結(jié)構(gòu)，預(yù)示著盡管ChPYL3與其可能進(jìn)化關(guān)系最近，但兩者基因功能產(chǎn)生了差異；同時(shí)，預(yù)測(cè)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，ChPYL1、Ch‐PYL7、ChPYL3和ChPYL5還含有1個(gè)保守的Bet_v_1結(jié)構(gòu)域（PF00407）（圖2C），且它被認(rèn)為是一個(gè)古老的保守結(jié)構(gòu)域[32]，該結(jié)構(gòu)域包含7個(gè)β 折疊和2個(gè)α 螺旋，形成一個(gè)螺旋握結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)繼續(xù)折疊則形成一個(gè)中心疏水區(qū)，可與脂類、激素等疏水成分相結(jié)合[31]。結(jié)合蛋白保守模體分析發(fā)現(xiàn)，在該基因家族編碼蛋白中所含的10種篩選的模體中，成員間所含的模體數(shù)量存在一定差異，所含的保守模體數(shù)量在4～6個(gè)，但在所有的蛋白中均含有Motif 1、Motif 2和Motif 3，同時(shí)也與PYR_PYL_RCAR_like和Polyketide_cyc2保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域相對(duì)應(yīng)。

圖1 ChPYLs基因家族及其他物種PYLs基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（NJ）Fig.1 Phylogenetic analysis of ChPYLs family genes and PYLs genes in other species

2.3 基于高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析ChPYLs基因表達(dá)水平

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)于榛子子房及胚珠發(fā)育不同時(shí)期的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)[2，29]，以8條ChPYLs基因序列為檢索序列與測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，并獲得對(duì)應(yīng)基因序列及其表達(dá)量數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，在未授粉花序（F）、子房形成（S）、子房分化（T）和子房生長(zhǎng)（FO）4個(gè)時(shí)期基因家族成員間表達(dá)模式存在一定差異（圖5A）。除未比對(duì)到對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)的ChPYL2和ChPYL5基因外，ChPYL1、ChPYL7、ChPYL3和ChPYL6在4個(gè)時(shí)期均低表達(dá)，但ChPYL1和ChPYL7在授粉后隨著子房的發(fā)育，其表達(dá)呈稍下降趨勢(shì)，后2個(gè)基因則無(wú)顯著差異；另外，ChPYL4和ChPYL8在4個(gè)時(shí)期均相對(duì)高表達(dá)，且后者表達(dá)量更高，同時(shí)兩者在授粉后隨著子房的生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)也呈逐漸下降趨勢(shì)。分析胚珠發(fā)育過(guò)程中胚珠形成（OV1）、早期生長(zhǎng)（OV2）、快速生長(zhǎng)（OV3）及胚珠成熟（OV4）4個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，8個(gè)基因家族成員除ChPYL4、ChPYL6和ChPYL8外，其他基因均無(wú)表達(dá)或表達(dá)水平極低；并且ChPYL4和ChPYL6在4個(gè)時(shí)期均低表達(dá)，前者無(wú)顯著差異，后者則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；ChPYL8在4個(gè)時(shí)期均高表達(dá)，且在4個(gè)時(shí)期呈現(xiàn)雙峰表達(dá)模式，即OV2和OV4時(shí)期表達(dá)量更高，且在OV2時(shí)期表達(dá)量最高，OV1時(shí)期表達(dá)量最低。

圖2 ChPYLs基因及其編碼蛋白結(jié)構(gòu)及保守基序分析Fig.2 Analysis of gene and protein sequences structure of ChPYLs in Corylus heterophylla

圖3 ChPYLs蛋白序列及其他物種部分PYLs蛋白序列比對(duì)Fig.3 Protein sequences alignment of ChPYLs and PYLs in other species

圖4 ChPYLs基因在子房及胚珠發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平熱圖Fig.4 Expression heatmap of ChPYLs genes in different development stages of ovary and ovule

2.4 基于qRT-PCR驗(yàn)證ChPYLs基因在不同胚珠發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平

為進(jìn)一步驗(yàn)證ChPYLs家族基因成員在胚珠發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平，筆者利用qRT-PCR對(duì)各基因進(jìn)行了表達(dá)水平檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，總體而言各成員間其表達(dá)模式各有差異，且該基因家族成員表達(dá)水平較低。其中，ChPYL1和ChPYL5表達(dá)呈現(xiàn)相似模式，OV1和OV3時(shí)期表達(dá)量更高；ChPYL2、ChPYL3和ChPYL7則在胚珠發(fā)育初期表達(dá)量較高，且前兩者呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)；ChPYL4在OV1時(shí)期表達(dá)量最高，其他3個(gè)時(shí)期均低表達(dá)；ChPYL6則在OV3時(shí)期表達(dá)量最高；ChPYL8表達(dá)呈現(xiàn)雙峰模式，即OV2和OV4時(shí)期表達(dá)量更高。該驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果較為一致，也進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有較高可靠性。

圖5 胚珠發(fā)育不同時(shí)期ChPYLs表達(dá)量檢測(cè)（qRT-PCR）Fig.5 Expression level analysis of ChPYLs in different development stages of ovule（qRT-PCR）

3 結(jié)論與討論

本研究在平榛中共鑒定獲得8個(gè)PYL基因家族成員，通過(guò)與擬南芥、水稻、葡萄以及橡膠樹PYL基因家族進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)平榛PYLs與葡萄及橡膠樹PYLs親緣關(guān)系更近，這也與物種親緣關(guān)系相一致；另外，多物種PYL基因家族進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，ChPYL4與VvPYL3親緣關(guān)系更近（圖1），且研究發(fā)現(xiàn)葡萄在高鹽和干旱脅迫下VvPYL3表達(dá)量降低，預(yù)示著其可能作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子參與葡萄響應(yīng)高鹽和干旱脅迫；另外，研究發(fā)現(xiàn)與ChPYL2親緣關(guān)系更近的AtPYL11和AtPYL12能夠正調(diào)控ABA介導(dǎo)種子萌發(fā)[11]，故在后續(xù)Ch-PYL4及ChPYL2功能研究中可依據(jù)以上預(yù)測(cè)進(jìn)行側(cè)重研究；基因結(jié)構(gòu)之間的差異與各成員間進(jìn)化關(guān)系密切相關(guān)，通過(guò)基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，平榛PYLs中除ChPYL4、ChPYL5和ChPYL8外均不含內(nèi)含子，表明大部分成員均具有高度的保守性，可能在進(jìn)化上較為原始；對(duì)基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，各成員編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域均含有α螺旋、β折疊及無(wú)規(guī)則卷曲，且數(shù)量和分布規(guī)律也與在水稻、橡膠樹中的研究結(jié)果相一致；另有研究發(fā)現(xiàn)，PYL家族編碼蛋白中CL2區(qū)域是ABA受體與PP2C互作的重要區(qū)域，且該區(qū)域中的K（賴氨酸）與I（異亮氨酸）的轉(zhuǎn)變（圖3）會(huì)導(dǎo)致對(duì)于ABA依賴性的改變，也是該區(qū)域重要的功能位點(diǎn)[7]。分析發(fā)現(xiàn)ChPYL4和ChPYL8在該位點(diǎn)與其他蛋白存在差異，可能影響其對(duì)ABA的依賴性。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果也顯示，在子房及胚珠發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，ChPYL4和ChPYL8均有更高的表達(dá)水平，且其他基因均表達(dá)量極低或無(wú)表達(dá)，因果實(shí)發(fā)育初期內(nèi)源ABA含量極低或檢測(cè)不到[33]，鑒于PYL作為ABA受體可分為ABA依賴型和不依賴型，例如，在番茄的12個(gè)PYLs成員中也發(fā)現(xiàn)SlPYL3和SlPYL12為ABA-不依賴受體[27]，故上文提及ChPYL4和ChPYL8蛋白位點(diǎn)的改變可能導(dǎo)致其對(duì)ABA依賴性更小或不依賴；ChPYL2和ChPYL5基因在子房發(fā)育時(shí)期未比對(duì)獲得對(duì)應(yīng)表達(dá)數(shù)據(jù)，預(yù)示著兩者在該過(guò)程可能無(wú)表達(dá)且無(wú)顯著差異，即不參與該過(guò)程調(diào)控；ChPYL4和ChPYL8基因在子房發(fā)育的4個(gè)時(shí)期呈下降趨勢(shì)，表明它們可能作為負(fù)調(diào)控因子參與調(diào)控子房發(fā)育過(guò)程，且后者功能更顯著；ChPYL8在胚珠發(fā)育的4個(gè)時(shí)期則呈現(xiàn)雙峰表達(dá)模式，表明在胚珠中可能具有更精細(xì)的調(diào)控模式；通過(guò)熒光定量分析發(fā)現(xiàn)ChPYL6在胚珠發(fā)育4個(gè)時(shí)期盡管表達(dá)量較低，但發(fā)育后期表達(dá)量更高，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)較為一致，預(yù)示著該基因可能在榛子胚珠發(fā)育過(guò)程發(fā)揮正調(diào)控作用。

綜上所述，基于目前PYL基因家族參與植物果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的研究相對(duì)較少、不夠深入的現(xiàn)狀，本研究以重要的經(jīng)濟(jì)林木植物——榛子為研究材料，也將為后續(xù)該基因家族成員參與榛子果實(shí)發(fā)育方面的研究提供重要理論基礎(chǔ)，另外，該基因家族成員在非生物脅迫響應(yīng)的生物學(xué)功能也有待深入探究。