不同廠家硫酸鎂對(duì)乳酵素發(fā)酵的影響

鹿曉慧，謝全喜，周 紅，侯楠楠，王 梅，王 倩，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安271000）

硫酸鎂是重要的無(wú)機(jī)化工產(chǎn)品，可應(yīng)用于飼料、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)硫酸鎂的方法主要是硫酸合成法等。在臨床中，硫酸鎂多用于治療妊娠期高血壓，具有解痙、鎮(zhèn)靜、降壓、利尿等功效[1-4]。硫酸鎂作為一種無(wú)機(jī)鹽添加在培養(yǎng)基中，鎂離子是多種酶的催化劑，有助于碳水化合物在體內(nèi)的合成與轉(zhuǎn)化，參與脂肪代謝與蛋白質(zhì)的合成，是賴氨酸產(chǎn)生的重要酶激活劑[5]。鎂離子是生物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)第2大離子成分，參與并調(diào)節(jié)機(jī)體許多離子通道活性及酶反應(yīng)，是生物體內(nèi)造骨過(guò)程中和肌肉收縮時(shí)所必需的因子，可以抑制乙酰膽堿的釋放，阻止神經(jīng)肌肉連接處的傳導(dǎo)，降低或解除肌肉收縮，對(duì)生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝和神經(jīng)功能起著重要作用。硫元素有利于含硫氨基酸的合成，影響機(jī)體對(duì)蛋白的利用，提高動(dòng)物機(jī)體生產(chǎn)性能，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。硫酸鎂作為良好飼料添加劑，一方面可以保證畜禽機(jī)體的正常生長(zhǎng)繁殖；另一方面可以預(yù)防多種疾病，降低死亡率，提高畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益[6-8]。

乳酵素作為飼料添加劑，其作用機(jī)理是發(fā)酵后可以活化乳酸菌使其迅速在動(dòng)物體內(nèi)定植，改善動(dòng)物腸道pH值，抑制副傷寒桿菌等有害菌的活性。乳酸菌內(nèi)的過(guò)氧化氫能夠刺激過(guò)氧化氫酶及胃蛋白酶的活化，有效抑制革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌等，同時(shí)提高飼料的消化吸收率[9-10]。乳酵素是一款水溶性產(chǎn)品，硫酸鎂作為乳酵素的組成成分，其溶解度影響乳酵素的水溶性。經(jīng)過(guò)調(diào)查，選取相同價(jià)位區(qū)間市售較好的8個(gè)廠家硫酸鎂產(chǎn)品，研究其對(duì)乳酵素發(fā)酵的影響，選擇適宜乳酵素產(chǎn)品的硫酸鎂。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

硫酸鎂采購(gòu)自不同廠家；乳酸菌由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

乳酵素：乳酸菌0.11 g（1.0×109CFU/g）、乳清粉51.5%、硫酸銨12.5%、氯化鈉6.5%、輕鈣3.5%、硫酸鎂2.5%、葡萄糖23.5%。

MRS 培養(yǎng)基：硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.5 g、吐溫801 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸銨2 g、無(wú)水乙酸鈉5 g、酵母浸膏5 g、牛肉浸膏10 g、蛋白胨10 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL。固體培養(yǎng)基需加入1.5%瓊脂粉，pH值自然。

1.3 儀器與設(shè)備

DHP-9082 數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、DHG-9140A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（常州諾基儀器有限公司）、HH-4 恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）、XW-80A旋渦混合器（上海弛唐電子有限公司）、PB-10Sartorius 精密pH 計(jì)[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、YXQGD4B手提式壓力蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 硫酸鎂溶解性

準(zhǔn)確稱取5 g硫酸鎂溶解于100 mL蒸餾水中，觀察記錄硫酸鎂的溶解速度、有無(wú)沉淀等。參照GB/T 9738—2018《化學(xué)試劑水不溶物測(cè)定通用方法》對(duì)硫酸鎂進(jìn)行水不溶物的測(cè)定。

1.4.2 液體發(fā)酵

按4%添加量添加乳酵素至水中進(jìn)行液體發(fā)酵，初始乳酸菌活菌數(shù)≥1.0×105CFU/mL。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。

1.4.3 pH值測(cè)定

準(zhǔn)確量取5 mL 發(fā)酵液樣品于10 mL 滅菌后的離心管中，直接使用玻璃電極pHS-3C型pH計(jì)測(cè)定pH值[11]。

1.4.4 乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》對(duì)發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-way ANOVA 進(jìn)行方差分析，最小顯著差數(shù)（least significant difference，LSD）法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 8個(gè)廠家硫酸鎂物理性質(zhì)比較（見表1）

表1 8個(gè)廠家硫酸鎂物理性質(zhì)Tab.1 Physical properties of magnesium sulfate from eight manufacturers

由表1 可知，8 個(gè)廠家硫酸鎂水不溶物存在顯著差異（P<0.05）。

2.2 8個(gè)廠家硫酸鎂對(duì)乳酵素發(fā)酵的影響（見表2、表3）

由表2 可知，8 個(gè)廠家硫酸鎂乳酵素發(fā)酵液pH 值在0～48 h 均呈下降趨勢(shì)，且差異顯著（P<0.01）。乳酵素發(fā)酵后，乳酸菌活菌數(shù)差異顯著（P<0.05）。

由表3 可知，在本次發(fā)酵過(guò)程中，pH 值及乳酸菌活菌數(shù)無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

進(jìn)行乳酸菌MRS 發(fā)酵，進(jìn)一步驗(yàn)證硫酸鎂對(duì)液體發(fā)酵的影響。

表2 8個(gè)廠家硫酸鎂對(duì)乳酵素發(fā)酵的影響Tab.2 Influence of fermentation of magnesium sulfate lactase from eight manufacturers

表3 4個(gè)廠家硫酸鎂對(duì)乳酵素發(fā)酵pH值及乳酸菌的影響Tab.3 Fermentation pH of magnesium sulfate lactase from four manufacturers and the influence of lactic acid bacteria

2.3 4個(gè)廠家硫酸鎂對(duì)MRS液體發(fā)酵的影響（見表4、表5）

由表4可知，在MRS液體發(fā)酵過(guò)程中，pH值及乳酸菌活菌數(shù)無(wú)顯著性差異（P>0.05），說(shuō)明同一添加量的硫酸鎂對(duì)植物乳桿菌0126進(jìn)行MRS液體發(fā)酵影響不大。

表4 4個(gè)廠家硫酸鎂對(duì)MRS液體發(fā)酵的影響Tab.4 The influence of 4 manufacturers of magnesium sulfate on MRS liquid fermentation

根據(jù)液體發(fā)酵結(jié)果選取D、G、H3 個(gè)廠家的硫酸鎂進(jìn)行不同添加量的MRS 液體發(fā)酵，1 號(hào)硫酸鎂添加量為0.5‰，2號(hào)硫酸鎂添加量為1‰，發(fā)酵結(jié)果見表5。

表5 硫酸鎂添加量及廠家不同對(duì)MRS液體發(fā)酵的影響Tab.5 The influence of magnesium sulfate addition and different manufacturers on MRS liquid fermentation

由表5 可知，液體發(fā)酵前期的乳酸菌活菌數(shù)與硫酸鎂溶解性呈正相關(guān)，硫酸鎂添加量為0.5‰和1‰時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)隨硫酸鎂溶解性的增加而升高；當(dāng)硫酸鎂添加量1‰時(shí)，發(fā)酵24 h 后的乳酸菌活菌數(shù)存在顯著性差異（P<0.05)。

3 討論

3.1 不同廠家硫酸鎂物理性質(zhì)比較

8 個(gè)廠家硫酸鎂從外觀及溶解性等方面存在明顯差異，除F廠家外，水不溶物與沉淀多少呈正相關(guān)，推測(cè)可能是因?yàn)镕廠家溶液顏色為淡黃色，導(dǎo)致未溶解的微粒肉眼無(wú)法觀察。以H廠家水不溶物最低，說(shuō)明該廠家硫酸鎂溶解性最好，其次是A廠家和G廠家，3個(gè)廠家在水不溶物方面差異不顯著（P<0.05)。

3.2 不同廠家硫酸鎂對(duì)乳酵素發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液中pH 值的變化幅度可以反映同一菌株對(duì)不同發(fā)酵基質(zhì)利用率的高低，在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中pH 值降低還能影響一些不耐酸微生物的生長(zhǎng)繁殖[12]。發(fā)酵基質(zhì)中活菌數(shù)的變化反映菌種利用發(fā)酵基質(zhì)性能的強(qiáng)弱[13]。在本試驗(yàn)中，根據(jù)第一次發(fā)酵結(jié)果，所選植物乳桿菌對(duì)B、D、G、H 4個(gè)廠家的硫酸鎂組成的乳酵素發(fā)酵基質(zhì)利用率較高，因此選取這4個(gè)廠家的硫酸鎂進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。乳酵素發(fā)酵24 h時(shí)，4個(gè)廠家硫酸鎂pH值均呈下降趨勢(shì)，B 廠家pH 值最低，下降率最高（分別是4.76%、28.42%）；48 h時(shí)pH值下降率8%左右，H廠家下降率最高（9.86%）。發(fā)酵24 h后，乳酸菌活菌數(shù)均在108CFU/mL以上，H 廠家乳酸菌活菌數(shù)最高（2.65×108CFU/mL）。由試驗(yàn)結(jié)果可知，發(fā)酵24 h時(shí)乳酸菌活菌數(shù)與硫酸鎂溶解性呈正相關(guān)，48 h時(shí)卻沒(méi)有表現(xiàn)出此特性。推測(cè)是因?yàn)槿樗峋诎l(fā)酵過(guò)程中先吸收利用溶解的硫酸鎂，剩余的硫酸鎂雖然沒(méi)有溶解，但也可以被乳酸菌利用，所以在發(fā)酵后期（48 h）之間乳酸菌活菌數(shù)與硫酸鎂溶解性并沒(méi)有直接的線性關(guān)系。乳酸菌在發(fā)酵后期活菌數(shù)上升可能是因?yàn)槿樗峋诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生蛋白酶，蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)形成多肽，多肽被吸收后水解為氨基酸提供乳酸菌生長(zhǎng)需要,進(jìn)一步促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)繁殖[14]。

3.3 不同廠家硫酸鎂對(duì)MRS液體發(fā)酵的影響

在MRS 液體發(fā)酵過(guò)程中，硫酸鎂溶解性對(duì)MRS 發(fā)酵影響與乳酵素發(fā)酵結(jié)果一致，在發(fā)酵前期24 h 后，乳酸菌活菌數(shù)與硫酸鎂溶解性呈正相關(guān)，在發(fā)酵后期（48 h）乳酸菌活菌數(shù)與硫酸鎂溶解性沒(méi)有直接的線性關(guān)系。

發(fā)酵24 h后，各組pH值均下降39%左右，活菌數(shù)達(dá)到109CFU/mL，其中H 廠家乳酸菌活菌數(shù)最高達(dá)到2.16×109CFU/mL。與乳酵素液體發(fā)酵不同的是，在發(fā)酵48 h時(shí)，MRS發(fā)酵液乳酸菌活菌數(shù)均呈下降狀態(tài)。這一方面可能由于發(fā)酵液中pH 值過(guò)低（均在4以下）不利于菌株存活，乳酸菌產(chǎn)生自溶現(xiàn)象；另一方面可能由于MRS發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，難以支持高濃度乳酸菌的存活需求；還可能由于乳酸菌利用發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶水解蛋白質(zhì)后形成了對(duì)細(xì)菌有害的產(chǎn)物[15-16]。MRS 發(fā)酵液和乳酵素發(fā)酵液在24 h 時(shí)活菌數(shù)差距較大，可能是由于MRS 培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分比乳酵素高有關(guān)，MRS 培養(yǎng)基中蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的組成成分如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和維生素等可以更全面、有效地滿足乳酸菌的生長(zhǎng)。也有研究表明，不同營(yíng)養(yǎng)水平的培養(yǎng)基對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)存在影響[17-18]。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，不同廠家硫酸鎂物理性質(zhì)存在差異，其中水不溶物差異最為顯著。以硫酸鎂為原料進(jìn)行乳酵素及MRS 發(fā)酵，短時(shí)間發(fā)酵效果與硫酸鎂溶解度呈正相關(guān)，硫酸鎂溶解性越高，發(fā)酵效果越好。