聚合物納米材料在疫苗佐劑領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展

畢毓彤，周萌萌，李承禹，陳孝起，李彥濤，肖繼君*

（1. 河北科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院航空輕質(zhì)復(fù)合材料與加工技術(shù)河北省工程試驗(yàn)室河北省材料近凈成形技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室河北省柔性功能材料重點(diǎn)試驗(yàn)室，河北石家莊050018；2. 河北省科學(xué)院能源研究所，河北石家莊050081；3. 河北工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津300130）

納米材料具有良好的生物相容性、黏膜吸收性、生物降解性、易加工等優(yōu)點(diǎn)。因此，納米技術(shù)和納米材料科學(xué)的發(fā)展及應(yīng)用在近年來得到各行各業(yè)的廣泛關(guān)注，尤其是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究進(jìn)展。納米材料表面可控，通常通過包埋、吸附和化學(xué)鍵合等方式將藥物與粒子緊密結(jié)合，并傳輸?shù)絼游餀C(jī)體發(fā)揮作用[1-3]，能促進(jìn)功能分子進(jìn)入細(xì)胞，保護(hù)DNA 和蛋白質(zhì)不被降解[4]。因此，納米材料在疫苗和藥物方面的研究越來越多[5]。目前，隨著對納米粒子的應(yīng)用研究，聚合物納米材料因其優(yōu)異的生物相容性和低黏膜粘附毒性[6]、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和高度藥物釋放可控性可提高藥物的穩(wěn)定性和利用率，并且因其在機(jī)體的儲存作用、靶向作用、調(diào)控作用且易于表面修飾，具有穩(wěn)定性好、安全性好等特點(diǎn)，在生物疫苗佐劑領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[7-8]。

文章從聚合物納米材料的種類、作用機(jī)理及研究應(yīng)用現(xiàn)狀等方面總結(jié)聚合物納米顆粒佐劑、聚合物納米膠束和聚合物納米乳液在生物疫苗佐劑領(lǐng)域的應(yīng)用與研究進(jìn)展。

1 聚合物納米顆粒佐劑

聚合物顆粒最先在1976年由Kreuter 等[9]報(bào)道出其佐劑特性。聚合物納米顆粒不僅可以保護(hù)抗原免受酶解，且具有抗原儲存效應(yīng)、APC 靶向性、免疫調(diào)控等作用，還具有易于表面修飾、穩(wěn)定性好和安全性高的優(yōu)點(diǎn)[10]。基于聚合物納米顆粒的獨(dú)特優(yōu)勢，已成為近年來疫苗佐劑的熱門研究方向之一。

1.1 聚乳酸（PLA）類納米顆粒佐劑

隨著聚合物納米材料在生物領(lǐng)域的深入研究，生物相容性優(yōu)良的聚乳酸材料得到眾多科研學(xué)者的關(guān)注與探究。自1995年，美國FDA（Food and Drug Administration）批準(zhǔn)聚乳酸及其衍生物可以作為藥用輔料進(jìn)行臨床應(yīng)用[11]，聚乳酸納米材料在藥物釋放領(lǐng)域及生物免疫學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛[12-14]。

Tukhvatulin 等[15]制備的PLGA 納米顆粒，配合抗原使用，在小鼠試驗(yàn)中表現(xiàn)出體液免疫和細(xì)胞免疫均得到增強(qiáng)；與使用非聚合物納米粒子的佐劑相比，抗原的保護(hù)效力提高10 倍左右。2009年，Jain 等[16]發(fā)現(xiàn)，PEG-PLAPEG 嵌段共聚物包埋乙肝表面抗原疫苗顆?？梢栽鰪?qiáng)黏膜攝取，引起有效的免疫應(yīng)答，試驗(yàn)證明合成的納米粒子可作為口服免疫載體發(fā)揮作用。Thomas 等[17-18]采用雙相乳液溶劑蒸發(fā)法制備帶正電荷的聚乳酸-羥基乙酸共聚物包埋重組乙肝表面抗原（PLGA-HBsAg）顆粒，經(jīng)肺部給藥后結(jié)果表明，帶有正電荷的顆?？僧a(chǎn)生全身體液和黏膜免疫反應(yīng)，且相比未用正電荷修飾的顆粒更有效。徐婧[19]制備帶正電荷的粒徑分別為100 nm、300 nm、1 μm的聚乳酸納米顆粒，并將OVA 吸附在聚乳酸顆粒表面，通過肌肉注射的方式對小鼠進(jìn)行免疫，經(jīng)過小鼠抗原特異性表達(dá)和脾細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，合成的聚合物納米顆粒具有明顯的佐劑效果，隨著粒徑的減小聚乳酸顆粒佐劑效果更明顯，可以得出結(jié)論帶正電荷的聚乳酸顆粒是一種非常具有潛力的佐劑。張威風(fēng)[20]采用微孔膜乳化技術(shù)制備粒徑均一的微球，與OVA 和流感裂解疫苗分別制備成亞單位疫苗，并研究粒徑、表面電荷、共用免疫增強(qiáng)劑和抗原裝載方式對微球佐劑效果的影響及作用機(jī)制，為聚乳酸納米顆粒在疫苗佐劑領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展提供參考。

此外，其他聚合物納米顆粒在疫苗佐劑的應(yīng)用也有研究，例如聚谷氨酸納米顆粒[21-22]、聚賴氨酸納米顆粒、聚己內(nèi)酯納米顆粒[23]等多種聚合物納米粒子作為疫苗載體或佐劑活性已有相關(guān)報(bào)道。

1.2 殼聚糖類納米顆粒佐劑

殼聚糖是一種天然多糖類陽離子高分子材料，具有生物相容性良好、生物降解性好和低毒性等優(yōu)點(diǎn)，在藥物領(lǐng)域殼聚糖同樣得到廣泛研究與應(yīng)用[24-25]。殼聚糖在機(jī)體內(nèi)可以提高巨噬細(xì)胞和多形核細(xì)胞的聚集和活化。因此，Gordon等[26]和Reed等[27]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖納米顆粒作為免疫佐劑應(yīng)用時可明顯增強(qiáng)局部反應(yīng)和系統(tǒng)的抗體反應(yīng)。殼聚糖納米顆粒作為佐劑具有黏膜吸附性[27]、免疫刺激活性[28]、促滲作用[29]、緩釋和控制作用[25]以及特異靶向性[30]，其作用機(jī)理主要是抗原儲存作用[31]、靶向作用[32]、免疫調(diào)節(jié)作用[33]和抗原提呈作用[34]。基于殼聚糖及其衍生物納米顆粒的特性，在疫苗佐劑領(lǐng)域的研究與應(yīng)用值得深入探討[35-36]。

董浩蘇等[37]采用殼聚糖納米粒子為魚類疫苗佐劑，研究該佐劑的免疫增強(qiáng)作用，發(fā)現(xiàn)該佐劑負(fù)載蛋白ETAE-1227 在斑馬魚進(jìn)行免疫測試后，免疫性能與油佐劑相當(dāng)，在未來可作為新型佐劑進(jìn)行進(jìn)一步研究。殼聚糖作為疫苗佐劑是安全有效的，且是一種有潛力的可應(yīng)用于流感疫苗的引導(dǎo)黏膜免疫的佐劑[38-40]。Svindland等[41]研究發(fā)現(xiàn)，含殼聚糖佐劑的H5N1流感疫苗經(jīng)小鼠鼻腔免疫可以明顯誘導(dǎo)流感病毒特異性抗體分泌細(xì)胞，能刺激機(jī)體在局部和全身產(chǎn)生高濃度抗體。該佐劑是一種具有潛力的流感疫苗佐劑，可進(jìn)行下一步的臨床研究試驗(yàn)。Alginate 等[42]采用海藻酸鈉包被殼聚糖納米顆粒作為甲型肝炎抗原的載體，對小鼠進(jìn)行免疫應(yīng)答試驗(yàn)，通過提高血清轉(zhuǎn)化率，甲型肝炎抗體水平和脾細(xì)胞增殖可知該佐劑可以明顯提高免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，具有平衡Th1/Th2 免疫響應(yīng)的作用。

此外，殼聚糖納米顆粒也可以應(yīng)用于熱裂谷熱病毒滅活抗原的載體，經(jīng)免疫后，動物機(jī)體的中和抗體效價和免疫球蛋白G（IgG）效價得到顯著提高，白細(xì)胞介素-2（IL-2）和干擾素（IFN-r）表達(dá)相應(yīng)增加，促進(jìn)Th1 型免疫應(yīng)答[43]。眾多研究學(xué)者聚焦于其他天然有機(jī)高分子聚多糖聚合物，如海藻酸鹽[44-45]是來自藻類細(xì)胞壁的陰離子多糖聚合物，海藻酸鹽對單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞具有顯著的活性激發(fā)作用和佐劑作用。研究報(bào)道，海藻酸鹽以共價鍵、納米凝膠和微粒的形式在亞單位疫苗進(jìn)行應(yīng)用。透明質(zhì)酸是一種線性黏多糖，由D-葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸的雙糖重復(fù)單元組成，通過離子絡(luò)合作用與脂質(zhì)體形成復(fù)合物，可負(fù)載蛋白等，通過刺激機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫反應(yīng)[46]。

1.3 聚丙烯酸（PAA）類納米凝膠顆粒佐劑

聚丙烯酸材料具有安全、無毒、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，因此在生物醫(yī)用材料得到廣泛的應(yīng)用。并且該材料與滅活病毒抗原經(jīng)物理混合后進(jìn)行機(jī)體免疫可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[47-51]。

聚丙烯酸類納微粒凝膠可促使抗原在注射位點(diǎn)形成儲存庫產(chǎn)生持續(xù)釋放抗原效應(yīng)，并刺激機(jī)體產(chǎn)生短的炎癥反應(yīng)從而誘導(dǎo)機(jī)體固有免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，抗原和蛋白在聚丙烯酸佐劑表面有很強(qiáng)的吸附力且安全性好[52-53]?；谝陨显?，聚丙烯酸類材料及其衍生物在免疫佐劑領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

聚丙烯酸水凝膠是一種高分子性能的特異性水溶有機(jī)高分子，水凝膠載體可以控制外界條件在一定的速率下釋放藥物[54]。Yoshida 等[55]制備具有pH 值響應(yīng)性聚合物載體聚（甲基丙烯酸乙二醇）水凝膠，采用雞卵清蛋白（OVA）和霍亂毒素（CT）為抗原模型，通過體外摻入和釋放試驗(yàn)顯示，該載體可以增加血漿的抗體IgG 水平，是一種有前途的口服疫苗載體。揭少衛(wèi)等[56]制備具有pH 值敏感性殼聚糖/聚丙烯酸水凝膠磁微球，并研究該水凝膠磁微球?qū)Φ鞍孜镔|(zhì)的吸附和釋放。因此，該聚合物水凝膠在疫苗佐劑的領(lǐng)域具有很高的潛在應(yīng)用價值。

2 聚合物納米膠束佐劑

聚合物納米膠束是將具有親水和疏水基團(tuán)的兩親嵌段共聚物在水中的自組裝形成，具有核-殼結(jié)構(gòu)的納米膠束，由共聚物形成的納米膠束有載藥量高、載藥范圍廣、穩(wěn)定性好、體內(nèi)滯留時間長等特點(diǎn)，使用聚合物納米膠束可提高藥物的穩(wěn)定性和生物利用度等[57-58]。近年來，聚合物納米膠束在疫苗和醫(yī)藥領(lǐng)域得到研究者的廣泛關(guān)注[59]。

Li 等[60]研究1 種兩親性嵌段膠束，可將負(fù)載的抗原（OVA）和免疫刺激佐劑（CL264）遞送至樹突狀細(xì)胞，在一定程度上促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的攝取、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抗原向T 細(xì)胞的交叉呈遞，促使動物機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫。進(jìn)一步的小鼠試驗(yàn)證明，該膠束的遞送系統(tǒng)進(jìn)行免疫，明顯阻止小鼠的腫瘤生長。羅資超等[61]制備一種由聚賴氨酸和聚亮氨酸合成的納米膠束，通過負(fù)載OVA 研究其免疫機(jī)理，經(jīng)過小鼠試驗(yàn)可知該聚多肽納米膠束是一種優(yōu)良的疫苗載體，除可提高樹突狀細(xì)胞對抗原的攝取，還可以增強(qiáng)體液免疫。師帥等[62]采用聚乙二醇-聚己內(nèi)酯合成骨架，通過與乙烯亞胺結(jié)合形成陽離子納米膠束，通過正負(fù)電荷的物理吸引完成對蛋白類抗原的表面吸附，采用簡單的電荷吸附完成抗原的裝載與吸附，增強(qiáng)機(jī)體對抗原的免疫應(yīng)答；該納米佐劑具有低毒性、優(yōu)秀的生物相容性、較好的免疫性以及優(yōu)越穩(wěn)定性。Song等[63]通過對聚（γ-谷氨酸）納米膠束中的多價羧基進(jìn)行胺化，膠束的尺寸變小，通過模擬病原體進(jìn)入淋巴結(jié)的引流試驗(yàn)，研究表明，該膠束可激發(fā)淋巴結(jié)中炎癥小體和固有免疫系統(tǒng)。2020年，史林啟等[64]公開1 種可控捕獲、釋放抗原的納米復(fù)合膠束癌癥疫苗的制備方法，該疫苗的機(jī)制建立在PCL-b-PEG/PCL-b-PAE 復(fù)合膠束，依靠pH 值響應(yīng)鏈段PAE 在不同pH 值條件進(jìn)行疏水微區(qū)捕獲抗原和釋放抗原，該膠束合成方法簡單，在癌癥疫苗領(lǐng)域具有廣泛的研究及應(yīng)用前景。

3 聚合物納米乳液佐劑

油乳佐劑屬于一種貯存型佐劑[65]，以礦物油加小分子乳化劑（如span-85 或Tween-80）及穩(wěn)定劑（硬脂酸鋁）為連續(xù)油相，再與適當(dāng)?shù)目乖芤海ǚ稚⑾啵┗旌先榛捎腿樾妥魟?。油乳佐劑在獸用生物制品中應(yīng)用較多。油乳佐劑通常分為3種類型：水包油型、油包水型、水包油包水型佐劑[66]。因油乳佐劑含有礦物油，注射后往往引起動物機(jī)體組織炎癥、動物發(fā)熱等副反應(yīng)。因此，采用聚合物與乳化劑和少量的油制備的聚合物納米乳液，可以有效避免炎癥，減少副反應(yīng)的發(fā)生，且具有較好的免疫性能。

潘京學(xué)等[67]發(fā)明1 種動物疫苗的聚合物佐劑及其應(yīng)用，將聚合物與乳化劑和助劑以一定的條件下制備成聚合物組合佐劑，抗原以儲存的形式在聚合物形成的囊泡中被包裹，也可以被聚合物均勻吸收，分布在聚合物內(nèi)，該佐劑可輔助禽畜類疫苗發(fā)揮作用。史記華等[68]公布1 種聚丙烯酸類聚合物用于動物疫苗佐劑的研制方法，采用乳化劑合成的聚丙烯酸類聚合物佐劑，該佐劑誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，并實(shí)現(xiàn)快速免疫保護(hù)和長期持續(xù)免疫保護(hù)，同時具有較好的生物相容性和生物可降解性。

4 結(jié)論

疫苗是防控傳染性疾病發(fā)生的重要措施之一，因此生產(chǎn)和使用安全有效的疫苗尤為關(guān)鍵。在疫苗的生產(chǎn)制備中，佐劑的添加尤為重要，佐劑的使用可以增強(qiáng)疫苗的免疫原性、減少抗原用量、提高安全性和穩(wěn)定性等。聚合物納米材料與抗原結(jié)合后經(jīng)免疫可在機(jī)體產(chǎn)生儲存庫效應(yīng)，且抗原提呈細(xì)胞對聚合物納米粒子吞噬作用可激發(fā)固有免疫系統(tǒng)并刺激產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。聚合物納米佐劑因其具有良好的誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的能力，成為最有潛力的疫苗佐劑之一。

聚合物納米材料的潛在佐劑作用受許多因素的影響，如免疫機(jī)體之間的種類差異、免疫系統(tǒng)的差異和納米粒子對機(jī)體的毒理性能都將影響聚合物納米材料是否依然保持佐劑活性；聚合物納米佐劑的形貌、表面化學(xué)性質(zhì)、載體對抗原的釋放平衡等對也會對機(jī)體免疫性能產(chǎn)生影響；聚合物納米材料在制備過程中有機(jī)溶劑的含量對機(jī)體產(chǎn)生毒性等問題。因此，在未來的研究中將深入研究聚合物納米材料與機(jī)體免疫的作用機(jī)理；聚合物納米材料包被抗原的儲存與釋放穩(wěn)定性及其對免疫機(jī)體的毒理作用等問題。隨著未來對聚合物納米佐劑材料作為佐劑及其作用機(jī)理的深入研究，必將制備出安全、穩(wěn)定、高效的聚合物納米佐劑，聚合物納米材料作為新型生物疫苗免疫佐劑必將在傳染性疾病的預(yù)防中發(fā)揮重要作用。