當(dāng)前我國豬偽狂犬病的流行及疫苗應(yīng)用

李少麗，胡曉鳳，王家福，康 斌，李建林，尹忠良

（杭州佑本動物疫苗有限公司，浙江杭州310018）

1 豬偽狂犬病概述

偽狂犬病最早于1813年發(fā)生于某牛群，病牛極度瘙癢，癥狀與狂犬病相似，因此稱為“偽狂犬病”。20 世紀(jì)70年代后，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)開始密集，再加上國際貿(mào)易引起動物及副產(chǎn)品運(yùn)輸量增加的影響，偽狂犬病由牛傳染給豬[1]。偽狂犬病病原為PRV，屬皰疹病毒科甲皰疹病毒亞科，其毒力由多個基因協(xié)同控制，主要有編碼胸苷激酶（TK）、糖蛋白gE、gD、gI 和核苷酸還原酶（RR）等，其中TK 是PRV的主要毒力基因。TK基因的失活大大地降低病毒毒力而不影響病毒在組織培養(yǎng)中的增殖，該基因?qū)Σ《驹谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中的復(fù)制起主要作用，而且通過基因工程手段完全缺失TK基因的疫苗毒株在臨床應(yīng)用中不會出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象。gE糖蛋白為豬偽狂犬病病毒的非必需蛋白，決定其毒力，并促進(jìn)其進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。gE基因的缺失可降低病毒毒力及神經(jīng)組織嗜性，從而進(jìn)一步提高疫苗的安全性。gG 蛋白是一種趨化因子結(jié)合蛋白，通過結(jié)合趨化因子使其不能發(fā)揮功能，導(dǎo)致機(jī)體不易或難以識別入侵的病毒，缺失gG基因可以迅速繼發(fā)細(xì)胞免疫，產(chǎn)生大量的α和β干擾素[1-2]。

PRV 宿主范圍廣、復(fù)制周期短、高度致病性。徐志文等[3]構(gòu)建的SA215 重組病毒可在Vero、BHK21、IBRS、PK15、MDBK 和CEF 細(xì)胞上增殖并產(chǎn)生細(xì)胞病變。陳陸等[4]將SA215 接種Vero 細(xì)胞后8 h 細(xì)胞即變圓變亮，集聚成團(tuán)，24 h 約有50%細(xì)胞形成空斑，40 h 時蝕斑面積可達(dá)90%。Wang 等[5]將構(gòu)建的缺失gE 基因的HN1201 株接種PK15 細(xì)胞做蝕斑純化，疫苗滅活前抗原含量達(dá)108.67TCID50/mL。豬是PRV 的主要宿主和貯存宿主，一旦感染將終生帶毒。2 周齡以內(nèi)仔豬感染PRV 后100%死亡，成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可出現(xiàn)屢配不孕、產(chǎn)木乃伊胎、返情率高等；公豬患病則睪丸腫脹、萎縮，失去種用能力。PRV 常在神經(jīng)節(jié)形成潛伏感染。PRV 通過口鼻感染后，最初在上呼吸道的上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)生復(fù)制，接著感染扁桃體和肺，病毒還可通過三叉神經(jīng)和嗅神經(jīng)末梢侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致化膿性腦膜炎，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時病毒被激活，向外界排毒并造成持續(xù)性感染，即使接種疫苗也無法保護(hù)攜帶PRV的豬，只能通過剔除潛伏感染豬才能實(shí)現(xiàn)豬偽狂犬的凈化[6]。

2 豬偽狂犬病疫苗的應(yīng)用

2011年以前使用Bartha-K61 疫苗，我國豬偽狂犬病控制得很穩(wěn)定。2011年末，很多接種過Bartha K-61 疫苗的豬場暴發(fā)豬偽狂犬病。2012年1月，山東有超過8 萬頭以上的豬發(fā)病，表現(xiàn)出豬偽狂病的臨床癥狀，患病率達(dá)50%，大多數(shù)豬在出現(xiàn)癥狀后第3 d開始死亡，懷孕70～90 d的母豬中有35%出現(xiàn)流產(chǎn)。在發(fā)病豬中分離的3 種PRV毒株gE 基因在138～140 和1472～1474 位點(diǎn)有2 個不連續(xù)插入[7]。An等[8]對6個省15個豬場的臨床樣本PCR均檢測到PRV 的gE 基因，序列分析顯示所有分離株屬于一個相對獨(dú)立的基因決定簇，也含2個氨基酸插入。在保護(hù)試驗(yàn)中，Bartha-k61 疫苗接種豬對SC 經(jīng)典PRV 的攻擊提供100%保護(hù)，但對PRV 流行毒HeN1 只有50%保護(hù)。Wang等[5]以2011年分離的PRV變異株HN201為研究對象，缺失gE基因制備滅活疫苗，免疫3周齡仔豬，免疫豬均存活，未表現(xiàn)出任何臨床癥狀，而不免疫對照組豬則表現(xiàn)出典型的PRV呼吸系統(tǒng)癥狀和神經(jīng)癥狀。

2.1 PRV滅活疫苗使用現(xiàn)狀

2001年，陳煥春等[9]從湖北某豬場死亡新生仔豬腦及內(nèi)臟中分離出PRV 分離株Ea 株，接種BHK-21 細(xì)胞培養(yǎng)制備抗原，研制成功我國第1 個全病毒油乳劑滅活疫苗。母豬多次定期免疫該疫苗后，血清PRV 中和抗體可達(dá)、1∶16～1∶32，乳汁的中和抗體可達(dá)1∶64～1∶128，仔豬哺乳后中和抗體可達(dá)1∶64[10]。另一種被批準(zhǔn)的是gE基因缺失的HN1201-△gE株滅活疫苗。據(jù)其研發(fā)團(tuán)隊(duì)介紹，該疫苗對經(jīng)典株（閔A 株）和變異株（HN1201 株）的攻擊均可達(dá)100%保護(hù)，而Bartha-K61 免疫組對變異株的攻擊只有60%保護(hù)。

2.2 PRV活疫苗使用現(xiàn)狀

1961年，Bartha將分離的PRV野毒在雞胚成纖維細(xì)胞上連續(xù)傳代，獲得了Bartha K-61（也稱K-61）疫苗株。該疫苗株不僅缺失了主要毒力基因gE及能與其組成復(fù)合物的gI蛋白基因，還在US區(qū)存在其他一些缺失，是一種天然的基因缺失疫苗，確保了疫苗的安全性。1979年，哈爾濱獸醫(yī)研究所將Bartha-K61 種毒引入國內(nèi)成功試制弱毒疫苗，有效遏制我國PR 疫情。吳文福等[11]測定該疫苗免疫豬后的抗體消長規(guī)律，發(fā)現(xiàn)豬免疫后第7 d 抗體水平開始上升，35 d達(dá)高峰，高水平的免疫抗體維持時間長達(dá)2個月以上，直至免疫后365 d PRV 中和抗體效價仍可達(dá)6.8，表現(xiàn)出優(yōu)良的免疫效果。

2003年，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)郭萬柱教授團(tuán)隊(duì)研制出我國第一個豬偽狂犬gE/gI/TK/LacZ+基因缺失活疫苗（SA215）。用SA215 株疫苗免疫母豬所產(chǎn)的所有仔豬均獲得高水平母源抗體，7 日齡平均效價高達(dá)28.56，隨著日齡增長抗體水平呈下降趨勢，到60日齡平均效價為22.56；70日齡商品豬接種后，經(jīng)過近100 d育肥，其出欄率增加20.83%。陳陸等[4]將三基因缺失疫苗（SA215株）和Bartha-K61株進(jìn)行免疫攻毒，第2 d起接種豬均出現(xiàn)發(fā)熱、精神沉郁、食欲下降，第5 d 恢復(fù)正常；而未接種對照組則在攻毒后第1 d 發(fā)熱、腹瀉，第4～5 d死亡，攻毒后SA215比Bartha接種豬的增重受阻天數(shù)、發(fā)熱期及散毒期均縮短。

豬偽狂犬活疫苗TK/gG/gE 三基因缺失疫苗株（HB-98株）是以Ea株為背景，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)改造篩選的活疫苗毒株[2]。何啟蓋等[12]以105.0TCID50的PRV HB-98株接種新生仔豬，接種后連同對照組用鄂A 強(qiáng)毒攻擊，試驗(yàn)豬未出現(xiàn)不良反應(yīng)，而對照豬全部發(fā)病，其中3/4的仔豬死亡。受現(xiàn)實(shí)低溫冷凍條件制約，疫苗的研發(fā)又延伸了1個新方向，2016年，豬偽狂犬病TK/gE/gI 三基因的缺失株耐熱保護(hù)劑活疫苗（HB2000）獲批。

實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中不乏免疫失敗的現(xiàn)象發(fā)生，其中1 個非常主要的因素是免疫方式。仔豬最好要采用噴鼻免疫，噴鼻免疫屬于黏膜免疫，霧狀疫苗在黏膜表面2 h 內(nèi)可被機(jī)體吸收，保證機(jī)體吸收足量的抗原。吸收的抗原利用“提前占位”原則，提前進(jìn)入三叉神經(jīng)節(jié)，避免后期偽狂犬野毒的感染。

而針對近年來Bartha-K61 毒株疫苗對我國當(dāng)前流行的PRV 強(qiáng)毒株保護(hù)不佳的問題，學(xué)者們開始著手PRV 流行毒疫苗的開發(fā)。

3 豬偽狂犬病疫苗發(fā)展趨勢

無論對活疫苗還是滅活疫苗，免疫佐劑均可以刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性免疫應(yīng)答，增強(qiáng)疫苗的免疫效果。PRV疫苗以細(xì)胞免疫為主。Lin等[13]在Ea株滅活疫苗中加入重組豬IL2，可顯著提高免疫豬的中和抗體水平和CTL活性，對Ea 株強(qiáng)毒的攻擊產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)。Rooij 等[14]以BarthaK-61疫苗為基礎(chǔ)制備PRV弱毒活疫苗和滅活疫苗，兩次免疫SPF 豬并于二免后接種105PFU 的NIA3 野毒，接種BarthaK-61 活疫苗+佐劑組和BarthaK-61 活疫苗組的豬產(chǎn)生了高水平中和抗體及明顯的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（LPT），尤其是BarthaK-61活疫苗加佐劑組的LPT反應(yīng)最強(qiáng)。相比之下，接種Bartha K-61 滅活疫苗的兩組試驗(yàn)豬只產(chǎn)生了低水平的中和抗體和極弱的LPT反應(yīng)，兩個滅活疫苗組盡管抗體水平有顯著差異，但兩組免疫保護(hù)效果均較差。表明免疫保護(hù)與LPT反應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)，與中和抗體滴度之間缺乏相關(guān)性。

PRV 基因組龐大，具有眾多非必需基因和非編碼區(qū)，PRV還具有很好的免疫原性且易感動物廣泛，適合作為載體表達(dá)外源基因開發(fā)多種動物疫病的多聯(lián)疫苗。徐志文等[15]以PRV SA215株為載體插入HCV 的E2基因，構(gòu)建重組病毒SA215（A），仔豬免后28、42 d 分別進(jìn)行PRV（Fa 強(qiáng)毒，106PFU）和HCV（豬瘟石門系血毒1ml，105MLD）攻毒。結(jié)果重組病毒SA215（A）對于偽狂犬病與SA215活疫苗相當(dāng)，對于豬瘟則介于豬瘟兔化弱毒疫苗和豬瘟睪丸細(xì)胞苗之間，顯示出較好的免疫效果。Lei 等[16]以PRV 變異株為骨架，缺失gE/gI/TK基因后也插入CSFV的E2基因構(gòu)建重組病毒，以PRV（TJ株）、豬瘟石門系攻毒，免疫豬未表現(xiàn)出任何臨床癥狀且產(chǎn)生了針對PRV和CSFV的中和抗體，表明構(gòu)建的重組病毒可完全抵抗PRV和CSFV強(qiáng)毒的攻擊。徐高原等[17]構(gòu)建了表達(dá)乙型腦炎病毒NS1 基因的重組偽狂犬病病毒株TK-／gG-／NS1+，經(jīng)檢測重組病毒能表達(dá)具有生物活性的NS1蛋白，免疫仔豬能產(chǎn)生乙型腦炎病毒特異性抗體及CTL 活性。目前，關(guān)于PRV 病毒載體的重組疫苗均處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，希望將來能有所突破，開發(fā)出安全性好，免疫原性強(qiáng)的重組疫苗，達(dá)到PR根除的最終目標(biāo)。

4 結(jié)論

文章對當(dāng)前我國豬偽狂犬病的流行現(xiàn)狀進(jìn)行了論述。在當(dāng)前非洲豬瘟背景下，針對安全性更高，采用豬偽狂犬病流行毒株制備的商品化滅活疫苗對變異株進(jìn)行保護(hù)是比較妥當(dāng)?shù)倪x擇。鑒于PRV 作為基因表達(dá)載體的有利條件，研發(fā)以PRV為載體的多聯(lián)疫苗具有很好的發(fā)展前景。