消除大腸桿菌耐藥性的中藥復(fù)方研究進(jìn)展

王芝超，劉 洋，呂新彪，林冬梅，朱 陣，2，張永英，2*

（1. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲056000；2. 河北省禽病工程技術(shù)研究中心，河北邯鄲056000）

近年來，多藥耐藥大腸桿菌的出現(xiàn)和廣泛傳播[1]，使抗菌藥物的治療效果越來越差。相比細(xì)菌抗性突變的速度，新藥研發(fā)在周期上明顯滯后。隨著超級(jí)耐藥菌的產(chǎn)生，治療過程中不得不超劑量使用或多種抗生素聯(lián)合使用；而抗菌藥物的大劑量廣泛使用造成細(xì)菌耐藥譜增寬、動(dòng)物性產(chǎn)品藥物殘留、對(duì)環(huán)境和人類健康造成污染和損害[2]。

由于大腸桿菌耐藥性的廣泛傳播，開始研究如何消除大腸桿菌耐藥性，提高其對(duì)抗菌藥物的敏感性。中藥在治療細(xì)菌感染時(shí)不易產(chǎn)生耐藥性、對(duì)機(jī)體的毒性作用較小，且復(fù)方中藥具有多靶點(diǎn)的優(yōu)勢。中藥在消除細(xì)菌耐藥性方面的研究逐漸增多，也取得一些成績[3]。文章對(duì)近年來中藥消除大腸桿菌耐藥性的研究做以下幾方面的闡述。

1 中藥消除大腸桿菌的耐藥機(jī)制

1.1 消除大腸桿菌R質(zhì)粒

大腸桿菌R質(zhì)粒攜帶多種耐藥基因，使細(xì)菌對(duì)部分抗生素產(chǎn)生耐藥性。中藥可有效消除大腸桿菌R質(zhì)粒，且在疾病治療中發(fā)揮重要作用。劉洋[4]研究表明，山楂水提取物作用8株β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥大腸桿菌后，其質(zhì)粒條帶均缺失1～3 條，耐藥消除率達(dá)20%以上。張傳津等[5]研究表明，蒼術(shù)、金銀花對(duì)多重耐藥大腸桿菌R 質(zhì)粒均具有消除作用，中藥分別作用20 h 后，大腸桿菌對(duì)抗生素耐藥率均下降6.67%。中藥千里光水浸液也可消除多重耐藥大腸桿菌R 質(zhì)粒，質(zhì)粒消除率在10%左右[6]。消除R 質(zhì)粒是降低大腸桿菌耐藥性主要方法之一，但耐藥大腸桿菌對(duì)不同類別的中藥敏感度不同，因此耐藥消除率也存在差異。

1.2 抑制β-內(nèi)酰胺酶活性

耐藥大腸桿菌可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶，此酶可水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物中β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使耐藥菌對(duì)抗生素敏感性降低甚至喪失。Shrivastav等[7]研究發(fā)現(xiàn)，丁香油和羅勒葉對(duì)β-內(nèi)酰胺酶具有很好的抑制能力，并且2種中藥協(xié)同使用效果更佳。曹敏[8]研究表明，蘆薈大黃素、木樨草素、苦參堿、大蒜素、香紫蘇醇能抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，5種中藥中蘆薈大黃素抑制β-內(nèi)酰胺酶效果較明顯，濃度為90 μg/mL 時(shí)，可抑制81.7%的β-內(nèi)酰胺酶活。中藥重樓皂苷、黃芩黃酮和敗醬草皂苷也能抑制產(chǎn)ESBLs大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺酶活性，多重耐藥消除率為71.43%以上，并且最小抑菌濃度（MIC）在2.500～10.918 mg/mL之間[9]。目前，除研發(fā)可消除β-內(nèi)酰胺酶的藥物之外，還需尋找新抑制劑防止藥物中β-內(nèi)酰胺環(huán)被水解失去活性。

1.3 抑制大腸桿菌主動(dòng)外排系統(tǒng)

主動(dòng)外排系統(tǒng)（AcrAB–TolC）是大腸桿菌多重耐藥重要機(jī)制之一，該系統(tǒng)將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，使胞內(nèi)藥物濃度下降，從而逃避藥物的殺傷作用達(dá)到自我保護(hù)的目的。主動(dòng)外排系統(tǒng)使大腸桿菌對(duì)許多抗生素產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致治療效果差；而中藥可通過抑制大腸桿菌主動(dòng)外排系統(tǒng)中AcrA表達(dá)量，使細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，減少抗菌藥物流出，有助于降低大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生。Zhang 等[10]研究表明，穿心蓮內(nèi)酯直接抑菌作用是通過抑制多重耐藥大腸桿菌外排泵表達(dá)和抗生素抗性位點(diǎn)恢復(fù)部分抗生素敏感性；間接抑菌作用是抑制耐藥菌生物膜形成，毒力因子產(chǎn)生和細(xì)菌之間黏附作用及破壞細(xì)菌完整性，通過這2 種抑菌作用使其耐藥性下降。Banerjee 等[11]研究表明，多重耐藥大腸桿菌AG100A（AcrAB-TolC 外排泵系統(tǒng)突變體）以及大腸桿菌D22（EnvA1突變體）MIC 分別為125 μg/mL 和250 μg/mL，穿心蓮對(duì)LPS 缺陷菌株（D22）和外排泵突變菌株（AG100A）具有一定滲透性。劉坤友等[12]研究表明，苦丁茶處理多重耐藥大腸桿菌前后主動(dòng)外排系統(tǒng)中AcrA-mRNA 表達(dá)量由5.01 下降至1.77；小飛揚(yáng)草處理多重耐藥大腸桿菌前后AcrA-mRNA 表達(dá)量由1.57降至0.32。

1.4 改變細(xì)胞膜通透性

大腸桿菌耐藥率與細(xì)胞外膜形成能力成正比。此外，中藥對(duì)具有強(qiáng)生物膜形成能力菌株表現(xiàn)出明顯抑制作用，為弱化大腸桿菌耐藥性提供基礎(chǔ)。Qu等[13]研究表明，多重耐藥大腸桿菌經(jīng)槲皮素處理后，其β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶水平顯著升高，大腸桿菌細(xì)胞外膜破裂。中藥當(dāng)歸在亞抑菌濃度下，使耐藥大腸桿菌變形，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完全破壞，出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)流失[14]。張玉國[15]研究發(fā)現(xiàn)，黃連連續(xù)作用四環(huán)素類藥物耐藥大腸桿菌后，菌株細(xì)胞外膜蛋白OmpF 和OmpC 由缺失恢復(fù)表達(dá)，使耐藥大腸桿菌細(xì)胞外膜黏附性下降，其耐藥消除率在0.5%～19.0%之間。中藥作用導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞膜破壞，使細(xì)菌面臨巨大生存壓力，從而達(dá)到消除耐藥性目的。

1.5 抑制耐藥基因表達(dá)

大腸桿菌因攜帶多種耐藥基因而產(chǎn)生耐藥性。李棟[16]研究表明，五味子、黃芩、黃連可消除喹諾酮類耐藥大腸桿菌PMQR 耐藥基因，其中黃連消除耐藥基因效果最好，3味中藥對(duì)耐藥基因PMQR消除效果均為高劑量組>中劑量組>低劑量組，并且高劑量組五味子和黃連對(duì)喹諾酮類耐藥大腸桿菌耐藥消除率在90%以上，而高劑量組黃芩耐藥消除率在70%以上。張奎[17]通過對(duì)6 株β-內(nèi)酰胺類耐藥大腸桿菌部分耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，中藥苦參堿和吳茱萸堿可消除耐藥基因blaTEM，從而降低β-內(nèi)酰胺類耐藥大腸桿菌的耐藥性。中藥是抑制耐藥大腸桿菌中耐藥基因的有效藥物，通過抑制基因表達(dá)量降低耐藥大腸桿菌耐藥性。

2 中藥消除大腸桿菌耐藥性的時(shí)間及濃度依賴性

2.1 中藥作用時(shí)間對(duì)大腸桿菌耐藥性的影響

中藥作用耐藥菌時(shí)間越長耐藥消除率越高，但超過一定時(shí)間其耐藥效果有所下降。汪晶等[18]研究發(fā)現(xiàn)，五倍子作用多重耐藥大腸桿菌不同時(shí)間其耐藥消除率不同，作用48 h耐藥消除率為3.6%，作用72 h耐藥消除率為4.8%。彭苗苗[19]研究表明，黃檗處理多重耐藥大腸桿菌48 h其消除率為9.5%；作用72 h其消除率為14.4%。陳群等[20]研究表明，黃連連續(xù)作用多重耐藥大腸桿菌48 h 和72 h 后，其消除率由2.42%升至22.57%。中藥作用耐藥大腸桿菌均表現(xiàn)出隨作用時(shí)間延長耐藥消除率增加的特點(diǎn)，并且不同中藥消除大腸桿菌耐藥性最佳作用時(shí)間有所不同，通常在48～72 h間耐藥消除率較高。

2.2 中藥作用濃度對(duì)大腸桿菌耐藥性的影響

不同中藥對(duì)大腸桿菌耐藥消除率均有差別，在限定時(shí)間內(nèi)藥物濃度越高其耐藥消除率也顯著升高。黃永志[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃連、黃芩、五味子、艾葉可以消除多重耐藥大腸桿菌耐藥性。其中，黃連和黃芩耐藥消除效果較明顯，隨藥物濃度增大黃連作用大腸桿菌24 h 其耐藥消除率由61.2%（1/4MIC）升至78.1%（1/2MIC）；而黃芩耐藥消除率由78.1%（1/4MIC）升至82.8%（1/2MIC）。Sun 等[22]研究表明，不同濃度苦參堿對(duì)多重耐藥大腸桿菌細(xì)胞外膜形成能力的抑制程度不同。在抑制ompA基因調(diào)節(jié)上1/2 MIC濃度苦參堿比1/4 MIC 濃度苦參堿抑制效果更明顯，表明苦參堿在抑制大腸桿菌細(xì)胞外膜形成機(jī)制中，濃度在1/2 MIC 時(shí)引起基因下調(diào)程度比濃度在1/4 MIC 時(shí)要強(qiáng)。耐藥大腸桿菌對(duì)不同類別的中藥敏感度不同，所以表現(xiàn)出耐藥消除率不盡相同，但與其他濃度中藥相比濃度為1/2 MIC時(shí)，其耐藥消除率更高，消除耐藥效果更明顯。

3 單味和復(fù)方中藥對(duì)消除細(xì)菌耐藥性的影響

3.1 單味和復(fù)方中藥對(duì)耐藥菌株消除率的影響

三黃湯（黃連、黃芩、大黃）在傳統(tǒng)復(fù)方中藥中具有清熱解毒、燥濕功效、抑菌成分復(fù)雜，各中藥之間可起到協(xié)同抑菌作用。寧官保等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在亞抑菌濃度下，黃芩處理多重耐藥大腸桿菌24 h，其耐藥消除率為4%；處理48 h，其耐藥消除率為6%。黃連處理多重耐藥大腸桿菌24 h，其耐藥消除率為3%；處理48 h，其耐藥消除率為4%。大黃處理多重耐藥大腸桿菌24 h，其耐藥消除率為2%；處理48 h，其耐藥消除率為3.5%。由這3種成分組成的三黃湯處理大腸桿菌24 h，其耐藥消除率為9%；處理48 h，其耐藥消除率為10%。韋嬪等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在亞抑菌濃度下黃連分別處理5 株多重耐藥大腸桿菌24 h，平均耐藥消除率為5.34%；分別處理48 h，平均耐藥消除率為7.27%。金銀花分別處理5 株多重耐藥大腸桿菌24 h，平均耐藥消除率為2.67%；分別處理48 h，平均耐藥消除率為3.47%；而連翹在亞抑菌濃度下總耐藥消除率為5%。吳崢嶸[25]表明，由黃連、金銀花和連翹組成的雙黃連處理多重耐藥大腸桿菌24 h，其耐藥消除率為20.1%；時(shí)間延長至48 h，其耐藥消除率為25.4%，耐藥消除率隨作用時(shí)間延長而升高。黃連、黃芩、黃檗、梔子這4種成分都以不同程度消除多重耐藥大腸桿菌耐藥性，消除耐藥率在3%～6%之間。李永偉等[26]發(fā)現(xiàn)，將4種成分組成的黃連解毒湯濃度在0.3 g/L時(shí)對(duì)產(chǎn)ESBLs 大腸桿菌耐藥消除率在60%～75%之間。由黃連、黃芩、黃檗、梔子組成黃連解毒湯，在配伍使用中達(dá)到增效目的，使黃連解毒湯耐藥消除率高于其單味中藥耐藥消除率。以上研究說明，雖然單味中藥和復(fù)方對(duì)大腸桿菌耐藥消除率均隨作用時(shí)間延長而上升；但與組成復(fù)方的單味中藥相比，復(fù)方中藥耐藥消除率更高。

3.2 單味和復(fù)方中藥對(duì)作用靶位的影響

中藥復(fù)方多采用清熱解毒和清熱燥濕的方劑，組成上相對(duì)簡單，與單味中藥相比，復(fù)方作用較全、消除靶位較多。楊奇等[27]研究發(fā)現(xiàn)，黃連、黃芩、大黃和三黃湯消除耐藥機(jī)制有所不同。當(dāng)黃芩、黃連和大黃分別作用于多重耐藥大腸桿菌后，均有部分質(zhì)粒條帶缺失，并且黃連中小檗堿可以抑制多重耐藥大腸桿菌細(xì)胞膜蛋白合成；黃芩中黃酮類化合物可以消除多重耐藥大腸桿菌R 質(zhì)粒中耐藥基因，抑制多重耐藥大腸桿菌DNA和RNA形成；大黃中蒽醌衍生物可以抑制耐藥菌核酸和蛋白質(zhì)形成，從而達(dá)到消除耐藥性目的。然而，三黃湯在消除耐藥機(jī)制方面比上述3 種中藥更全面。蘆亞君等[28]研究表明，經(jīng)三黃湯處理后多重耐藥大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶含量由0.0345 降至0.0230。舒剛等[29]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用三黃湯處理多重耐藥大腸桿菌之后，3條質(zhì)粒條帶均消失，質(zhì)粒消除前后抗菌藥物MIC均有下調(diào)趨勢。尹秀玲等[30]研究表明，多重耐藥大腸桿菌經(jīng)加減三黃湯處理后主動(dòng)外排系統(tǒng)中AcrA基因含量呈現(xiàn)明顯下調(diào)的趨勢。馬馳[31]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金銀花、黃芩、連翹分別作用于多重耐藥大腸桿菌后，所攜帶質(zhì)粒條帶均有不同程度缺失。但由這3種藥物組成的雙黃連不僅可以消除多重耐藥大腸桿菌R質(zhì)粒，還可以抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，改變大腸桿菌細(xì)胞膜通透性。吳崢嶸[25]研究表明，亞抑菌濃度的雙黃連可使多重耐藥大腸桿菌R 質(zhì)粒濃度下降，其耐藥消除率與傳統(tǒng)消除劑相當(dāng)，并且將高、中、低濃度雙黃連分別作用多重耐藥大腸桿菌時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶活性由初始9.52 分別降至3.81、7.54、9.08，當(dāng)雙黃連作用耐藥菌24 h 時(shí)，大腸桿菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被完全被破壞，出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)流失。鹽酸黃連素、黃芩總苷、大黃，在亞抑菌濃度下對(duì)多重耐藥大腸桿菌耐藥消除率在2%～6%之間，其中黃連素可消除多重耐藥大腸桿菌耐藥質(zhì)粒；大黃中的蒽醌衍生物可抑制耐藥菌核酸和蛋白質(zhì)形成；黃芩苷可消除耐藥大腸桿菌R 質(zhì)粒，抑制大腸桿菌DNA 和RNA 形成[32]。朱利霞等[33]研究發(fā)現(xiàn)，將3 種成分組成三黃片可消除多重耐藥大腸桿菌R質(zhì)粒，降低β-內(nèi)酰胺酶含量，其耐藥消除率為31%。

由此可見，雖然單味中藥對(duì)耐藥菌具有耐藥消除作用，但作用靶位較單一；而復(fù)方不僅可以消除耐藥菌R 質(zhì)粒，還可抑制β-內(nèi)酰胺酶活性，并且改變大腸桿菌細(xì)胞膜通透性。表明復(fù)方比單味中藥更好從多靶位消除大腸桿菌耐藥性，恢復(fù)大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。

4 結(jié)論

復(fù)方中藥與單味中藥相比，作用較全面并且多靶位、多方面作用，相比之下復(fù)方中藥可以更好地消除大腸桿菌耐藥性。但是，傳統(tǒng)中藥復(fù)方組成上相對(duì)簡單，消除耐藥作用靶位2～3個(gè)，存在一定局限性。在消除細(xì)菌耐藥的中藥方劑開發(fā)和研究中，可以嘗試從消除細(xì)菌耐藥機(jī)制方面，采用作用不同靶位的藥物或有效成分結(jié)合中醫(yī)的復(fù)方原則進(jìn)行復(fù)方，這樣可以從全方位、多角度的消除細(xì)菌的多重耐藥性，延長抗生素使用壽命。