青錢柳中5種三萜酸成分對肝細(xì)胞糖異生的影響

曹靜靜，鄭顯,，劉瑤，殷志琦，蔣翠花，張健*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室，江蘇 南京 210028；3.中國藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室&天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009)

根據(jù)世界糖尿病大會(IDF)報道[1]，2019年全球約有4.63億成人患有糖尿病，預(yù)計到2045年全球糖尿病患者人數(shù)將上升至7億，其中中國糖尿病患者人數(shù)和發(fā)病率位居世界第一。糖尿病患者中超過90%為2型糖尿病(T2DM)。研究表明，胰高血糖素主要通過刺激肝臟糖異生以在空腹或饑餓時維持血糖水平[2-3]，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者肝糖異生功能異常增強(qiáng)，致使空腹血糖升高[4]。因此，挖掘特異性靶向肝糖異生的先導(dǎo)化合物，可為T2DM治療藥物的開發(fā)提供有益的參考。

青錢柳(Cyclocaryapaliurus),又名搖錢樹、麻柳等，為胡桃科青錢柳屬植物，具有降血糖、降血脂和抗氧化等功效[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)青錢柳三萜酸部位可以有效降低糖尿病小鼠的高血糖[7-8]，但其對肝臟葡萄糖代謝和糖異生的影響尚不明確。因此，本文評價青錢柳中5種主要三萜酸成分對小鼠原代肝細(xì)胞糖異生及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6Pase)的影響，以期發(fā)現(xiàn)抑制肝糖異生的先導(dǎo)化合物，為青錢柳降糖提供更充分的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物

D-Hanks緩沖液、DMEM高糖、噻唑蘭(MTT)、PBS溶液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；氯化鈣、ITS(Insulin、Transferrin、Selenium)細(xì)胞培養(yǎng)添加物、丙酮酸鈉、乳酸鈉、Ⅳ型膠原酶、地塞米松(美國Sigma公司)；無糖DMEM培養(yǎng)基、Williams′Medium E培養(yǎng)基、L-glutamin、HEPES、Ⅰ型膠原(美國Gibco公司)；EGTA、Percoll、0.4%臺盼藍(lán)染液、Triton X-100(索萊寶公司)；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、雙抗(青霉素-鏈霉素溶液)、二甲基亞砜(DMSO)、PBS(10×)、DEPC水、山羊抗兔IgG、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(碧云天生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；glucagon(Med Chem Express公司)；二甲雙胍(愛必信生物科技有限公司)；Trizol Reagent(Ambion公司)；葡萄糖含量測試盒、BCA測試盒(南京建成生物工程研究所)；SYBR Green Realtime PCR Master Mix、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(東洋紡公司)；引物設(shè)計合成(上海捷瑞生物工程有限公司)；PEPCK、G6Pase、CK-18抗體(Abclonal公司)；內(nèi)參抗體β-tublin(沈陽萬類生物有限公司)。

arjunolic acid(1)、hederagenin(2)、3β,23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid(3)、cyclocaric acid B(4)、2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic(5)由中國藥科大學(xué)中藥制藥系殷志琦教授課題組提供，純度>98%(HPLC面積歸一化法測定)。

1.2 儀器

MS205DU精密天平(美國Mettler Tolerdo)；Vert.A1倒置熒光顯微鏡(德國CARL ZEISS公司)；Synergy H1多功能微孔板檢測儀(美國BioTek公司)；Quantsdutio DX熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；S1000PCR熱循環(huán)儀、164-5051電泳儀、電泳槽及轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；TUS-200P振蕩型恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)；Sapphire RGBNIR雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)(美國Azure Biosystems公司)。

1.3 實驗動物

SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證號SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心，12 h光照循環(huán)，溫度為(24±2)℃，相對濕度(60±10)%，自由進(jìn)食和飲水條件進(jìn)行飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 小鼠原代肝細(xì)胞分離

參照Salem等[9]建立的實驗方法，采用兩步灌注法分離小鼠原代肝細(xì)胞。小鼠采用戊巴比妥鈉45 mg/kg麻醉后，消毒，留置針插入下腔靜脈，在體灌注37 ℃預(yù)熱的Buffer 1灌注液(50 mL Hanks+10 mg EGTA，pH 值7.4)，戳破門靜脈，讓血水流出。Buffer 1沖完前，換Buffer 2灌注液(50 mL Hanks+11 mg CaCl2+15 mg Ⅳ型膠原酶)，灌注完成，分離肝臟置DMEM高糖中，70 μm篩網(wǎng)過濾，4 ℃、50×g離心2 min，棄上清，梯度離心液(5 mL 10×PBS+45 mL percoll+50 mL DMEM高糖)重懸，1 500 rpm離心8 min，棄上清，DMEM高糖重懸后，再次50×g離心2 min，棄上清，加入肝細(xì)胞培養(yǎng)液，臺盼藍(lán)計數(shù)，以1.5×105個/mL接種于24孔板，4 h細(xì)胞貼壁，觀察生長狀態(tài)。

2.2 小鼠原代肝細(xì)胞鑒定

2.2.1 CK-18蛋白水平檢測

分離獲得原代肝細(xì)胞以1.5×105個/mL接種于預(yù)先包被Ⅰ型鼠尾膠原的60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h后，棄上清，PBS清洗細(xì)胞2次，每皿加入150 μL RIPA裂解液(含1% PMSF)，冰上裂解5 min，刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管，13 000 rpm 4 ℃離心20 min，收集上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。配制10%分離膠及5%濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，加入CK-18抗體孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌3次，加入二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光檢測法顯色。

2.2.2 免疫熒光染色

原代肝細(xì)胞按方法“2.1”項下鋪于24孔板培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)基，預(yù)熱PBS清洗2次，每次5 min，清洗完成后，吸去PBS，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛固定15 min。棄去多聚甲醛，PBS清洗3次，每次5 min，每孔加入500 μL 0.5%的Triton X-100通透液，室溫靜置通透5 min。棄去通透液，PBS清洗3次，每次5 min，每孔加入500 μL 5%的BSA封閉液，室溫靜置封閉1 h。吸去封閉液，PBS清洗3次，每次5 min，吸去PBS，每孔加入300 μL稀釋后的CK-18抗體(稀釋比例為1∶200)，室溫靜置封閉2 h或4 ℃封閉過夜。吸去一抗，PBS清洗3次，每次5 min，吸去PBS，避光加入300 μL稀釋后的Alexa Fluor 488熒光二抗，室溫避光孵育1 h。吸去二抗，PBS清洗3次，每次5 min，棄去PBS，避光加入200 μL DAPI，室溫避光孵育10 min。棄去DAPI染色液，PBS清洗4次，每次5 min，棄去PBS，倒置熒光顯微鏡下拍照。

2.3 藥物配制及原代肝細(xì)胞糖異生實驗

2.3.1 藥物配制

取一定量的青錢柳三萜酸化合物1～5，用DMSO溶解(DMSO濃度不超過最終使用濃度的千分之一)，然后用無糖DMEM稀釋至需要濃度。

2.3.2 glucagon對原代肝細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

原代肝細(xì)胞按“2.1”項下鋪于96孔板中，貼壁24 h后，將培養(yǎng)基換為含有50、100、200、400、600、800、1 000 nmol/L glucagon的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育4 h，棄去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，振蕩10 min，于490 nm處測定吸光度(A)。

2.3.3 glucagon對原代肝細(xì)胞糖異生的影響

原代肝細(xì)胞按“2.1”項下鋪于24孔板中，貼壁4 h后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，用無糖DMEM潤洗后，將培養(yǎng)基換為含2 mmol/L pyruvate、20 mmol/L乳酸的無糖DMEM，并分別添加50、100、200、400 nmol/L glucagon培養(yǎng)3、6、12 h后，取上清，4 ℃、10 000 rpm離心3 min，葡萄糖測試盒測定上清中葡萄糖含量，同時用BCA試劑盒檢測各孔中蛋白濃度以校正葡萄糖含量。

2.4 5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞毒性的影響

原代肝細(xì)胞按“2.1”項下方法鋪于96孔板中，貼壁24 h后，給藥組加入不同濃度的化合物(1、5、10、20、40、80、100 μmol/L)培養(yǎng)12 h后，方法同“2.3.2”，檢測490 nm處吸光度，計算細(xì)胞活力。

2.5 5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞糖異生的影響

原代肝細(xì)胞按 “2.1”項下方法鋪于24孔板中，貼壁4 h后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)18 h，用無糖DMEM潤洗后，分為正常對照組(NC組，2 mmol/L pyruvate+20 mmol/L乳酸)、模型組(M組，2 mmol/L pyruvate+20 mmol/L乳酸+100 nmol/L glucagon)、給藥組(分別為10 μmol/L化合物1～5)和二甲雙胍組(Met組，150 μmol/L Metformin)，共孵育6 h后，方法同“2.3.3”，測定上清中葡萄糖含量。

2.6 G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)水平檢測

原代肝細(xì)胞按“2.1”項下方法鋪于6孔板中，貼壁4 h后更換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，無糖DMEM潤洗后，分為NC組、M組、給藥組(10 μmol/L化合物1、3、5)和Met組，孵育6 h后，棄去上清，PBS清洗細(xì)胞2次，用Trizol試劑抽提細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀測定A260/280及其濃度，A260/280在1.8～2.0視為提取純度合適，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照PCR試劑盒進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。各引物序列如表1所示。

表1 實時PCR檢測的引物序列

2.7 Western Blot分析

原代肝細(xì)胞按“2.1”項下方法接種于60 mm培養(yǎng)皿中，按“2.6”項下條件誘導(dǎo)糖異生和分組處理，孵育6 h后，棄去上清，PBS清洗細(xì)胞2次，每皿加入150 μL RIPA裂解液(含1% PMSF)，在冰上裂解5 min，刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管，4 ℃ 13 000 rpm 離心20 min，收集上清液，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品稀釋至相同濃度，配制10%分離膠及5%濃縮膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，加入一抗孵育，4 ℃過夜。TBST洗滌3次，然后加入二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光檢測法顯色，Image pro plus 6.0軟件掃描蛋白條帶灰度值并進(jìn)行分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)

采用兩步灌注法及多次離心分離小鼠原代肝細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計數(shù)肝細(xì)胞存活率>90%。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(見圖1A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種4 h后，細(xì)胞基本貼壁，形狀近似圓形，細(xì)胞核可見單核或雙核；接種20 h后，細(xì)胞變大且不規(guī)則，相鄰細(xì)胞互相連接。

3.2 小鼠原代肝細(xì)胞鑒定

3.2.1 CK-18蛋白水平檢測

CK-18是肝細(xì)胞常用的標(biāo)記蛋白。分離獲得細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，Western Blot顯示分離所得的細(xì)胞CK-18表達(dá)陽性，表明分離獲得細(xì)胞為肝臟細(xì)胞(見圖1B)。

注：A：肝細(xì)胞培養(yǎng)0～20 h(×200)；B：CK-18(1：HUVEC,2：AML12,3：自行分離細(xì)胞)；C：CK-18免疫熒光(×200)。圖1 小鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

3.2.2 免疫熒光染色鑒定

肝細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行抗CK-18免疫熒光染色后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞輪廓清晰，綠色熒光在胞質(zhì)中均勻分布(見圖1C)，進(jìn)一步證實分離所得細(xì)胞為肝臟細(xì)胞。

3.3 肝細(xì)胞糖異生模型的建立

3.3.1 glucagon對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

如圖2A所示，MTT法檢測50、100、200、400、600、800、1 000 nmol/L glucagon對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，與NC組相比，1 000 nmol/L以內(nèi)的glucagon對原代肝細(xì)胞無毒性影響，因此選擇50、100、200、400 nmol/L濃度進(jìn)行相關(guān)實驗。

3.3.2 glucagon對原代肝細(xì)胞糖異生的影響

glucagon濃度為100 nmol/L，培養(yǎng)6 h時，糖異生最為顯著(P<0.01)(見圖2B)。故選用100 nmol/L glucagon濃度的無糖培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h建立糖異生模型。

3.4 5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

如圖3A所示，MTT法檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，化合物1、3、5在40 μmol/L及以上濃度對原代肝細(xì)胞有顯著毒性(P<0.01)，化合物2、4在20 μmol/L及以上濃度對原代肝細(xì)胞有顯著毒性(P<0.01)；此外，加入100 nmol/L glucagon刺激，以上結(jié)果無明顯變化(見圖3B)，故選取10 μmol/L的化合物1～5作為安全濃度開展后續(xù)實驗。

注：A：glucagon對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響(12 h)；B：不同濃度glucagon對原代肝細(xì)胞糖異生的影響；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 Glucagon誘導(dǎo)條件下對小鼠原代肝細(xì)胞糖異生的影響

注：A：5種成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響(12 h)；B：100 nmol/L glucagon +5種成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響(12 h)；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 青錢柳中5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞細(xì)胞活力的影響

3.5 5種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞糖異生的影響

如圖4所示，與NC組相比較，glucagon可誘導(dǎo)糖異生顯著升高54.9%(P<0.01)。而此條件下，10 μmol/L的化合物1、3、5的抑制率分別為16.2%、19.1%、14.9%(P<0.05)。該結(jié)果表明化合物1、3、5可以顯著抑制小鼠原代肝細(xì)胞糖異生。

注：與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 青錢柳中3種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞異生的影響

3.6 青錢柳中3種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞中G6Pase、PEPCK mRNA及蛋白表達(dá)的影響

3.6.1 藥物對G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)的影響

如圖5A所示，glucagon刺激可顯著增加G6Pase和PEPCK的mRNA(P<0.01)，在此條件下，10 μmol/L的化合物1、3、5可顯著降低G6Pase和PEPCK的 mRNA水平(P<0.05)，說明化合物1、3、5可顯著降低glucagon刺激條件下原代肝細(xì)胞中G6Pase和PEPCK mRNA表達(dá)。

3.6.2 化合物1、3、5對G6Pase、PEPCK蛋白水平的影響

如圖5B所示，與NC組相比，glucagon刺激條件下，G6Pase和PEPCK的蛋白水平顯著增加38.7%、55.9%(P<0.05)，化合物1、3、5干預(yù)后可顯著降低G6Pase和PEPCK的蛋白水平(P<0.05)。提示化合物1、3、5可顯著降低glucagon刺激條件下原代肝細(xì)胞中G6Pase和PEPCK蛋白的表達(dá)。

注：A：G6Pase、PEPCK mRNA表達(dá)水平；B：G6Pase、PEPCK蛋白水平；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖5 青錢柳中3種三萜酸成分對原代肝細(xì)胞中G6Pase、PEPCK蛋白水平及mRNA表達(dá)的影響

4 討論

肝內(nèi)胰高血糖素反應(yīng)失調(diào)，肝糖異生功能明顯增強(qiáng)，是產(chǎn)生高血糖的主要原因之一，有效抑制肝糖異生是控制血糖的重要方式[3,10-11]。本實驗建立了糖異生細(xì)胞水平篩選模型，利用小鼠原代肝細(xì)胞評價化合物對糖異生的影響，發(fā)現(xiàn)來自青錢柳三萜酸的天然產(chǎn)物arjunolic acid、3β,23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid、2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oic通過調(diào)控G6Pase、PEPCK的表達(dá)水平，有效抑制肝糖異生。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病的發(fā)生多因臟腑虛損、陰虛燥熱，并主張以“清熱瀉火、養(yǎng)陰生津”來治療糖尿病。中藥黃連、秋葵、石斛、青錢柳等均可降低血糖?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃連能抑制炎癥，降低大鼠血糖[12]；秋葵可改善肥胖，降低血糖[13]；石斛能改善胰島β細(xì)胞功能[14]；青錢柳可以提高糖耐量[15]。其中，青錢柳作為藥食兩用植物[16]，食用方便、味道甘甜且降糖效果顯著，越來越受到關(guān)注。已有研究證實，青錢柳降糖主要活性成分為三萜和黃酮類化合物[17]。研究表明青錢柳三萜中青錢柳酸B和青錢柳苷H可改善糖代謝紊亂，其機(jī)制包括改善胰島素抵抗、促進(jìn)葡萄糖攝取等[18]。而本實驗研究表明青錢柳三萜酸中主要成分arjunolic acid、3β,23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid和2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oi可以通過抑制糖異生降低血糖。

本研究發(fā)現(xiàn)青錢柳三萜中主要成分arjunolic acid、3β,23-dihydroxy-12-ene-28-ursolic acid、2α,3α,23-trihydroxyurs-12-en-28-oi可以抑制胰高血糖素誘導(dǎo)條件下的糖異生，提示上述單體可能是通過調(diào)控胰高血糖素信號通路發(fā)揮作用的。作為調(diào)控能量穩(wěn)態(tài)的重要激酶，AMPK可通過影響胰高血糖素信號通路調(diào)控肝臟糖異生[19]。研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳三萜類化合物可通過調(diào)控AMPK促進(jìn)葡萄糖攝取，進(jìn)而達(dá)到降糖效果[8,18]?？梢姡鲜?種單體抑制糖異生的機(jī)制可能與AMPK有關(guān)。

綜上所述，本研究在前期青錢柳降糖作用研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)青錢柳中部分三萜酸類成分可顯著抑制糖異生，進(jìn)一步完善了青錢柳三萜部位降糖的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，也為從調(diào)控糖異生的角度出發(fā)來治療糖尿病提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。但這些成分是通過何種機(jī)制調(diào)控肝臟糖異生關(guān)鍵酶G6Pase、PEPCK的表達(dá)發(fā)揮作用，以及其體內(nèi)藥效和安全性均需進(jìn)一步研究。