石斛合劑基于PKB/FoxO1通路抑制糖尿病大鼠 肝糖異生的機制研究

林心君 胡海霞 何昱霖 劉佳繡 陳勇 施紅

〔摘要〕 目的 觀察復(fù)方石斛合劑對糖尿病大鼠肝PKB/FoxO1信號通路分子蛋白表達(dá)的影響，探討其抑制肝糖異生的分子機制。方法 隨機選取11只雌性Wistar大鼠為正常組，其余36只大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)，6周后腹腔注射STZ 2次。按糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選出糖尿病成模大鼠33只，再隨機分為模型組、二甲雙胍組、石斛合劑組，每組11只。給藥12周后，檢測空腹血糖（FBG）、血清空腹胰島素（FINS）、游離脂肪酸（FFA）;免疫組化檢測各組的肝臟的胰島素受體（InsR）、叉頭框蛋白O1（FoxO1）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）表達(dá)情況。Western blot檢測各組大鼠肝組織PKB、p-PKB、FoxO1、p-FoxO1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與正常組比較，模型組FBG、FINS、FFA明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，石斛合劑組FBG、INS、FFA顯著下降（P<0.05或P<0.01）;石斛合劑組與二甲雙胍組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。免疫組化結(jié)果顯示石斛合劑能促進(jìn)InsR表達(dá)，抑制PEPCK和FoxO1的表達(dá)（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示石斛合劑組p-PKB/PKB、p-FoxO1蛋白表達(dá)增加（P<0.05或P<0.01）;FoxO1表達(dá)減少（P<0.01）。結(jié)論 石斛合劑能抑制肝糖異生，調(diào)節(jié)糖脂代謝，增強胰島素敏感性，可能與其調(diào)節(jié)PKB/FoxO1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 胰島素抵抗;糖異生;石斛合劑;糖尿病;PKB/FoxO1信號通路

〔中圖分類號〕285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.08.006

Study on the Mechanism of Dendrobium Mixture in Inhibiting Hepatic Gluconeogenesis in

Diabetic Rats Based on PKB/FoxO1 Pathway

LIN Xinjun1， HU Haixia2， HE Yulin2， LIU Jiaxiu2， CHEN Yong1， SHI Hong1*

（1. College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fujian， Fuzhou 350122， China; 2. Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fujian， Fuzhou 350122， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Dendrobium Mixture on the protein expression of liver PKB/FoxO1 signaling pathway in diabetic rats， and to explore its molecular mechanism of inhibiting liver gluconeogenesis. Methods 11 female Wistar rats were randomly selected as normal group， the remaining 36 rats were fed with high-fat and high-sugar， 6 weeks later， STZ was injected intraperitoneally twice. 33 diabetes model rats were screened according to the diagnostic criteria of diabetes， and then randomly divided into model group， metformin group， Dendrobium Mixture group. After 12 weeks of administration， fasting blood glucose （FBG）， serum fasting insulin （FINS）， and free fatty acid （FFA） were tested; and the liver of each group was tested by immunohistochemistry for insulin receptor （InsR）， forkhead box protein O1 （FoxO1）， phosphoenolpyruvate carboxykinase （PEPCK） expression. Western blot method was used to detect the expression of PKB， p-PKB， FoxO1， p-FoxO1 in liver tissues of rats in each group. Results Compared with the normal group， FBG， FINS and FFA in the model group increased significantly （P<0.01）; compared with the model group， FBG， INS and FFA in the Dendrobium Mixture group decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; and there was no significant difference between Dendrobium Mixture group and metformin group （P>0.05）. The results of immunohistochemistry showed that Dendrobium Mixture can promote the expression of InsR and inhibit the expression of PEPCK and FoxO1. Western blot results showed that the expression of p-PKB/PKB and p-FoxO1 protein in the Dendrobium Mixture group increased （P<0.05 or P<0.01）; the expression of FoxO1 decreased （P<0.01）. Conclusion Dendrobium Mixture can inhibit liver gluconeogenesis， regulate glucose and lipid metabolism and enhance insulin sensitivity. It may be related to the protein expression of signal molecules related to the PKB/FoxO1 signaling pathway.

〔Keywords〕 insulin resistance; gluconeogenesis; Dendrobium Mixture; diabetes; PKB/FoxO1 signaling pathway

糖尿病由遺傳和環(huán)境因素引起持續(xù)的高血糖與長期代謝紊亂，是全球廣泛關(guān)注的公共健康問題;最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中國18歲及以上成年人中12.8%患有糖尿病，且糖尿病流行率在世界范圍內(nèi)繼續(xù)上升[1]。因此，如何有效防治糖尿病已成研究熱點。

糖異生是將一些非糖前體，如乳酸、甘油、生糖氨基酸等轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟堑倪^程。2型糖尿病多伴隨糖異生作用異?；钴S[2]，這也是導(dǎo)致內(nèi)源性葡萄糖輸出增多的原因，是糖尿病主要的病理生理特點。肝臟在葡萄糖代謝中起著核心的作用[3]，其中包括對肝糖異生和肝臟糖原合成的調(diào)節(jié)。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase， PEPCK）是催化糖異生第一步的的關(guān)鍵限速酶，在催化草酰乙酸轉(zhuǎn)變成磷酸烯醇式丙酮酸，最后異生為糖的生化過程中起重要作用[4]。PI3K-PKB通路是胰島素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的重要傳導(dǎo)通路之一。叉頭框蛋白O1（forkhead box O1， FoxO1）[5]是受胰島素信號負(fù)性調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子，在胰島素對肝臟糖代謝的調(diào)節(jié)中起重要作用，其通過結(jié)合糖異生基因啟動子促進(jìn)糖異生關(guān)鍵酶的基因表達(dá)。胰島素與細(xì)胞表面胰島素受體結(jié)合后[6]，激活細(xì)胞內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)，發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，最終作用到效應(yīng)靶點;研究[7-8]表明，胰島素受體（insulin receptor， InsR）等參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子數(shù)量、結(jié)構(gòu)及功能的異常，將導(dǎo)致胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙、生理效應(yīng)減弱，從而導(dǎo)致胰島素抵抗和代謝紊亂。

西醫(yī)治療糖尿病常用的藥物有胰島素、二甲福明、噻唑烷二酮（TZD）和磺酰脲類處方藥，雖有明確療效，但難以避免因長時間用藥引起的藥物不良反應(yīng)、耐藥性及繼發(fā)的肝腎損害。因此，尋找能改善糖尿病癥狀、穩(wěn)定血糖的中藥，成為亟待解決的問題。富含多種有效活性成分的中藥可以多途徑、多靶點發(fā)揮治療作用[9-10]。本課題組系列研究[11-12]證明，復(fù)方石斛合劑有明顯緩解糖尿病患者臨床癥狀、糾正糖耐量異常、改善胰島素抵抗的作用。肝糖異生不僅決定空腹血糖水平，且對糖穩(wěn)態(tài)維護(hù)起關(guān)鍵作用，因此，抑制肝臟糖異生被認(rèn)為是糖尿病治療的重要靶點[13]。本部分以高脂高糖喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型，觀察石斛合劑調(diào)控胰島素信號途徑抑制糖異生、改善糖穩(wěn)態(tài)的分子機制。

1 材料

1.1? 實驗動物

健康Wistar大鼠，SPF級，雌性，體質(zhì)量（200±20） g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司限公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室中，室溫25 ℃、相對濕度60%～70%。單籠5只飼養(yǎng)大鼠，自由取食和飲水，12 h光照/12 h黑暗?；A(chǔ)飼料配方由福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供;高脂飼料購于福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。配方參照本課題組前期實驗經(jīng)驗高脂飼料配方[14]：60.7%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、15%蔗糖、10%蛋黃粉、4%膽固醇、0.3%膽酸鹽。

1.2? 實驗藥物

石斛合劑（石斛15 g，黃芪20 g，五味子8 g，葛根15 g，丹參15 g，生地黃15 g，地龍8 g）購于福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂;二甲雙胍（格華止）片劑由中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.85 g/片，國藥準(zhǔn)字：H20023370，批號：1302094。

1.3? 主要試劑

血清胰島素ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，貨號F6403）;FFA測定試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號BC0590）;InsR、PKB和p-PKB抗體購自美國Cell Singaling公司（貨號分別為3025、4685、9611）;FoxO1和p-FoxO1抗體購自美國ABCAM公司（貨號分別為ab179450、ab60945）。

1.4? 主要儀器

HM340E型石蠟切片機（德國Microm公司）;ELx800型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）;垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠）;2500型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）;EPS 300型電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1? 動物造模、分組及干預(yù)

雌性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取11只為正常組（CTR組），其余36只大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)，6周后2次腹腔注射STZ 25 mg·kg-1m-2，期間間隔4天觀察大鼠情況，然后用血糖測定儀測血糖選取連續(xù)2 d FBG>11.0 mmol/L或PBG>16.7 mmol/L者為糖尿病模型大鼠。選取符合模型標(biāo)準(zhǔn)的大鼠33只，按體質(zhì)量、血糖分層后隨機分為模型組、石斛合劑組、二甲雙胍組，每組11只。分組及干預(yù)為正常組：正常鼠+普通飼料+生理鹽水灌胃組（10 mL·kg-1·d-1），模型組：模型鼠+普通飼料+生理鹽水灌胃（10 mL·kg-1·d-1），石斛合劑組：模型鼠+普通飼料+石斛合劑灌胃（11.3 g·kg-1·d-1），二甲雙胍組：模型鼠+普通飼料+二甲雙胍灌胃（100 mg·kg-1·d-1）。各組用藥劑量按60 kg成人臨床等效劑量進(jìn)行計算，大鼠灌胃體積均為10 mL·kg-1。治療12周后的大鼠于取材前夜禁食、不禁水第2天上午8點稱重后經(jīng)腹主動脈采血，離心制備血清，-20 ℃保存待測; 同時迅速取出各組大鼠肝臟等組織器官，一部分肝臟按照每100 mg置于一個1.5 mL的EP管中置于液氮中速凍保持，迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存以待通過Western blot法對PKB、p-PKB等蛋白進(jìn)行分析。

2.2? 指標(biāo)檢測

2.2.1? 檢測空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、游離脂肪酸（FFA）? 葡萄糖氧化酶法測定FBG，酶聯(lián)免疫分析法檢測FINS，按照ELISA試劑盒說明進(jìn)行實驗。FFA檢測：稱取肝組織約0.1 g，加入1.0 mL提取液，勻漿后8 000 r·min-1，4 ℃離心10 min（離心半徑為6.5 cm），取上清液，待測;測定步驟：分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長到550 nm，無水乙醇調(diào)零，試劑二在37 ℃水浴中預(yù)熱30 min以上;標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：將標(biāo)準(zhǔn)品用氯仿稀釋成0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 μmol/mL;按說明書在1.5 mL離心管中加入相應(yīng)試劑;并計算FFA含量。FFA（μmol/g）=X×V樣總÷W;X：吸光值，V樣總：上清液總體積，W：樣本質(zhì)量。

2.2.2? 免疫組化檢測肝臟InsR、FoxO1和PEPCK蛋白表達(dá)? 切片、貼片、脫蠟，枸櫞酸緩沖液進(jìn)行修復(fù)，PBS清洗3次×5 min，加入阻斷性內(nèi)源性過氧化物酶孵育10 min，PBS清洗;山羊血清室溫封閉孵育2 h，除去血清，各組滴加適合濃度的InsR、FoxO1和PEPCK一抗（濃度均1∶500），濕盒中4 ℃孵育過夜;滴加二抗工作液（1∶1 000），于室溫在濕盒中孵育10 min， PBS清洗;滴加適量的鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶孵育10 min，PBS清洗;加DAB顯色液20 s～2 min，流水沖洗、蘇木素復(fù)染、流水返藍(lán)、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織并拍照，用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。

2.2.3? Western blot檢測PKB、p-PKB、FoxO1、p-FoxO1蛋白表達(dá)? 按實驗分組準(zhǔn)備組織樣品，每個樣品取50～100 ug大鼠肝臟組織，組織勻漿器研磨勻漿，冰面上用RIPA裂解液裂解組織，冰上裂解30 min后，4 ℃，14 000 r·min-1離心20 min（離心半徑為6.5 cm），吸取上清液獲取總蛋白;根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣。制膠，95 ℃滅活蛋白5 min，SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉40 min，4 ℃相應(yīng)的一抗孵育過夜，TBST洗5 min×3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗5 min×3次，增強化學(xué)發(fā)光法（ECL）曝光顯影，采用BIO-RAD Image Lab軟件進(jìn)行灰度值分析。

2.3? 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用“x±s”表示，若滿足正態(tài)性及方差齊性則采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時則采用Games-Howell法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組大鼠血清FBG、FINS、FFA的變化

與正常組比較，模型組FBG、FINS、FFA明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，石斛合劑組、二甲雙胍組FBG、FINS、FFA明顯降低（P<0.05或P<0.01）與;石斛合劑組與二甲雙胍組比較，則差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3.2? 免疫組化檢測各組大鼠肝組織InsR、FoxO1和PEPCK的蛋白表達(dá)水平

與正常組比較，模型組FoxO1和PEPCK蛋白陽性染色增多，呈現(xiàn)棕黃色，表達(dá)量有顯著升高（P<0.05）;而InsR蛋白的表達(dá)量顯著減少（P<0.05）;與模型組比較，石斛合劑組和二甲雙胍組FoxO1和PEPCK的表達(dá)顯著減少（P<0.01），InsR顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與二甲雙胍組比較，石斛合劑組FoxO1表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。見圖1-2。3.3? Western blot檢測各組大鼠肝組織PKB、p-PKB、FoxO1、p-FoxO1的蛋白表達(dá)水平

與正常組比較，模型組p-FoxO1、p-PKB/PKB表達(dá)下降，F(xiàn)oxO1表達(dá)增加（P<0.05）。與模型組比較，石斛合劑組和二甲雙胍組p-FoxO1、p-PKB/PKB表達(dá)明顯增加（P<0.05或P<0.01），F(xiàn)oxO1表達(dá)減少（P<0.01）;石斛合劑組與二甲雙胍組比較，二甲雙胍組p-PKB/ PKB、p-FoxO1 表達(dá)增加更為顯著（P<0.05）。見圖3。

4 討論

糖尿病根據(jù)其臨床表現(xiàn)和特征，屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”范疇。本病的發(fā)生與遺傳、環(huán)境、生活飲食習(xí)慣、情志等諸多因素的共同作用有關(guān)。歷代醫(yī)家治療糖尿病多以滋陰法或滋陰益氣法論治。我們認(rèn)為T2DM病機[16]為本虛（氣陰）標(biāo)實（血瘀）、夾雜階段性瘀、痰、濕及其進(jìn)一步的病理產(chǎn)物形成“濁毒”，愈加耗氣、傷陰、成瘀，形成惡性循環(huán)。因此，課題組按滋陰益氣活血法則，選定了由石斛、黃芪、丹參、生地、葛根、五味子、地龍組成的石斛合劑，是福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑（批號：閩Q/YZ-2012-315，已獲國家發(fā)明專利，專利號ZL201110408411.0）。方中諸藥相須為用，使陰津得補，燥熱得消，氣血流暢，而有效防治T2DM及其并發(fā)癥，臨床療效顯著[10-11]。本課題組前期肝組基因表達(dá)譜芯片研究[17]發(fā)現(xiàn)：糖尿病模型大鼠與正常組存在差異的已知功能基因1 339個（P<0.05），石斛合劑治療后的糖尿病模型大鼠近千個基因表達(dá)量恢復(fù)正常，聚類分析接近正常組。從基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度證實了石斛合劑在動物模型體內(nèi)產(chǎn)生的分子效應(yīng)，一定程度印證了上述對T2DM病機規(guī)律認(rèn)識的科學(xué)性。二甲雙胍作為雙胍類口服降糖藥的代表[18-19]，能促進(jìn)外周胰島素敏感組織對葡萄糖的攝取和利用，改善胰島素抵抗，使肝臟糖異生減少，從而降低血糖，被諸多指南推薦的2型糖尿病首選用藥，故本實驗選用二甲雙胍作為對照藥物。

課題組前期動物實驗研究[14]發(fā)現(xiàn)，高脂高糖飼養(yǎng)大鼠6周后聯(lián)合2次小劑量STZ腹腔注射制備出的糖尿病大鼠模型成模率高，模型穩(wěn)定，故本實驗采用高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射的方法成功制備2型糖尿病大鼠模型。與正常組相比，模型組大鼠空腹血糖有顯著上升（P<0.01）;與模型組相比，治療12周后，石斛合劑組、二甲雙胍組血糖均明顯降低（P<0.01）;說明石斛合劑有確切的降血糖作用。

研究[20]發(fā)現(xiàn)高胰島素血癥是胰島素抵抗的始動因素之一，持續(xù)高胰島素狀態(tài)可降低外周組織細(xì)胞的胰島素受體表達(dá)，從而減少細(xì)胞對葡萄糖的氧化利用，反饋刺激胰島素分泌進(jìn)一步增加，造成惡性循環(huán)。本實驗結(jié)果顯示：與正常組比，模型組FINS顯著上升（P<0.01），說明糖尿病模型大鼠出現(xiàn)高胰島素血癥和胰島素抵抗;經(jīng)石斛合劑治療后，F(xiàn)INS較模型組有明顯下降（P<0.01），說明石斛合劑可明顯減輕糖尿病大鼠高胰島素血癥，改善其胰島素抵抗。

胰島素抵抗與肥胖和FFA水平過高密切相關(guān)[21]。FFA是肝臟代謝的主要來源之一[22]，血液中FFA過量導(dǎo)致肝臟和骨骼肌中脂質(zhì)代謝物的累積，進(jìn)一步加重IR[23-25]，是T2DM發(fā)展的主要危險因素。本實驗結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組的FFA顯著上升（P<0.05）;經(jīng)石斛合劑治療后，F(xiàn)FA較模型組顯著下降（P<0.05），說明石斛合劑可通過降低血液FFA水平，減少外周組織脂質(zhì)代謝物積累，改善胰島素抵抗和糖尿病。

InsR是細(xì)胞胰島素信號跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一站[26]，其表達(dá)異常是胰島素抵抗及糖代謝紊亂的重要原因。FoxO1是受胰島素信號負(fù)性調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子[27]，通過激活胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可引起下游的信號分子FoxO1發(fā)生磷酸化降解，從而降低FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性，減少糖異生酶表達(dá)，從而抑制肝臟糖異生。本實驗研究中，肝組織免疫組化結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組FoxO1和PEPCK表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），InsR表達(dá)顯著降低（P<0.01）;而經(jīng)石斛合劑和二甲雙胍治療后，InsR表達(dá)均上調(diào)，F(xiàn)oxO1和PEPCK表達(dá)均明顯下調(diào)，與模型組比較差異顯著（P<0.05或P<0.01）。與二甲雙胍組比較，石斛合劑組下調(diào)FoxO1表達(dá)更顯著。蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組p-PKB/PKB比值顯著降低，p-FoxO1表達(dá)明顯減少（P<0.05），F(xiàn)oxO1表達(dá)明顯增多（P<0.05）。經(jīng)治療，石斛合劑組和二甲雙胍組p-PKB/PKB，p-FoxO1表達(dá)均明顯增加（P<0.05），F(xiàn)oxO1表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）;兩組比較，二甲雙胍組p-PKB/PKB，p-FoxO1表達(dá)增加更為顯著（P<0.05）。上述實驗結(jié)果說明本研究中糖尿病模型大鼠由于p-PKB/PKB減少，胰島素通路分子的信號減弱，導(dǎo)致FoxO1磷酸化降解減少，引起糖尿病模型大鼠FoxO1增多，從而促進(jìn)糖異生關(guān)鍵酶PEPCK表達(dá)和肝糖輸出。而石斛合劑可通過上調(diào)p-FoxO1的蛋白表達(dá)，促進(jìn)FoxO1磷酸化降解，減少糖尿病模型大鼠FoxO1蛋白表達(dá)水平，從而抑制肝糖異生，改善糖代謝，其療效與二甲雙胍相類。

總之，石斛合劑能明顯降低糖尿病模型大鼠FBG、FINS、FFA水平，可能與促進(jìn)胰島素信號通路蛋白InsR、p-PKB，p-FoxO1蛋白表達(dá)，減少FoxO1、PEPCK蛋白表達(dá)有關(guān)，說明石斛合劑能通過調(diào)節(jié)PKB/FoxO1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制糖異生，調(diào)節(jié)糖脂代謝，增強胰島素敏感性，從而有效防治糖尿病。

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