黃精對(duì)聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠TGF-β1、ICAM-1基因表達(dá)的影響

王曉慧，宮銘海，楊波，鄭向群，劉寧，周忠光*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.天問山農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150323)

肝臟疾病已經(jīng)成為臨床常見疾病之一，對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大的威脅。肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是多種慢性肝病發(fā)展的必經(jīng)階段，肝細(xì)胞具有很強(qiáng)的再生能力，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷之后，會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)和代償性的修復(fù)反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)的沉積，如果損傷因素持續(xù)存在，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積從而引起肝纖維化，如果沒有得到有效的干預(yù)，肝纖維化程度會(huì)持續(xù)加重，很快轉(zhuǎn)化為肝硬化甚至肝癌[1-2]。延緩或控制HF的繼續(xù)發(fā)展，甚至逆轉(zhuǎn)HF，使患者肝臟的組織結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的功能得以提高或恢復(fù)，減少惡性肝臟疾病的發(fā)生，一直是醫(yī)學(xué)工作者努力的目標(biāo)[3-4]。

黃精在我國(guó)是一味常用的補(bǔ)益良藥，古代醫(yī)書記載其有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、養(yǎng)肝健脾益腎等功效[5]，同時(shí)也是一種保健食品，唐代就流行服食黃精來強(qiáng)健身體、保持容顏[6]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，黃精具有保護(hù)肝臟、抗菌消炎、降脂、降糖等多種藥理作用[7]，本文通過建立多種因素聯(lián)合誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，觀察黃精對(duì)大鼠肝臟的保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要藥品與試劑

黃精提取液(西安天瑞生物技術(shù)有限公司，生藥量10 g/mL)；四氯化碳(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；牛欄山二鍋頭；4%多聚甲醛固定液(福州飛凈生物科技有限公司)；水合氯醛(天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；HE染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；TGF-β1、ICAM-1 ELISA法測(cè)定試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)；Trizol Reagent(Invitrogen)；異丙醇(分析純)；三氯甲烷(分析純)；DEPC水；逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)；RNase抑制劑(TOYOBO)；dNTPs(Sangon)；Taq DNA聚合酶(TAKARA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與耗材

48只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號(hào):SCXK(黑)2018-001。適應(yīng)性飼養(yǎng)、造模和給藥過程均在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成，實(shí)驗(yàn)室溫度為20～24 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，換氣量11～13次/h。標(biāo)準(zhǔn)飼料、清潔飲用水由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，高脂低蛋白飼料在79.5%標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上添加20%豬油和0.5%膽固醇。

1.3 主要儀器與設(shè)備

2135型組織切片機(jī)(德國(guó)徠卡)；TD5AWS臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；Motic BA210顯微鏡(廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國(guó)Motic)；RT-6100酶標(biāo)分析儀(深圳生命科學(xué)股份有限公司)；熒光定量PCR儀(美國(guó)stratagene公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、模型的建立以及給藥

40只大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：正常對(duì)照組、模型組、黃精中劑量組(10 g/kg)、黃精高劑量組(15 g/kg)，每組10只，正常對(duì)照組大鼠自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)鼠糧、飲用清潔水源，其余各組大鼠采用聯(lián)合誘導(dǎo)方法建立大鼠肝纖維化模型，即喂養(yǎng)高脂飼料，以20%酒精作為唯一飲用水源，將40% CCl4溶于橄欖油內(nèi)，在頸后進(jìn)行皮下注射(第一次注射劑量為0.5 mL/100 g,以后每隔3 d注射1次，劑量為0.3 mL/100 g)，模型建立期6周。第6周末隨機(jī)選取3只大鼠處死，摘取肝臟制作病理切片，觀察確認(rèn)造模成功后，黃精中、高劑量組給予相應(yīng)劑量黃精灌胃治療，正常組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，每日1次，持續(xù)6周。最后一次灌胃給藥后不再給予飼料，但仍可飲水，次日麻醉后進(jìn)行取材。

2.2 組織切片的制作

大鼠麻醉后，開腹摘取肝臟，經(jīng)生理鹽水漂洗后，在肝臟左葉同一部位取材，經(jīng)甲醛溶液固定48 h后，按照常規(guī)操作步驟依次進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋和切片，按HE染色試劑盒染色后，在光鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化。

2.3 ELISA法測(cè)定血清TGF-β1、ICAM-1含量

大鼠麻醉后，用真空采血管自腹主動(dòng)脈取血置于抗凝管內(nèi)，室溫下靜置1 h后，放入離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)各組血清中TGF-β1、ICAM-1的含量。

2.4 肝臟TGF-β1、ICAM-1基因表達(dá)水平的測(cè)定

漂洗后的肝臟，在肝臟右葉同一部位取組織塊放入凍存管內(nèi)，經(jīng)液氮轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆茫?jīng)RT-PCR檢測(cè)肝臟TGF-β1、ICAM-1基因表達(dá)水平的變化。

TGF-β1、ICAM-1及內(nèi)參引物均由上海艾博思生物科技有限公司設(shè)計(jì)。GAPDH引物序列為：上游5′-GATGACATCAAGAAGGTGGTGA-3′，下游5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC-3′，總長(zhǎng)度206 bp；TGF-β1引物序列為：上游5′-CATGGAGCTGGTGAAACGGAAG-3′，下游5′-GACTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3′，長(zhǎng)度74 bp；ICAM-1引物序列為：上游5′-GCCATACGTACCCTGTCGTC-3′，下游5′-5GGAAGCTGGACAGCCAGGC-3′，長(zhǎng)度115 bp。肝臟組織總RNA用Trizol法提取，所得RNA溶解于DEPC處理的ddH2O中。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整度，采用分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度，確定提取的總RNA質(zhì)量較好后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件為95 ℃，3 min變性；94 ℃，20 s，62 ℃，40 s，共40個(gè)循環(huán)。對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，mRNA表達(dá)的相對(duì)水平=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT指其余樣品的ΔCT值和對(duì)照樣品相應(yīng)基因的ΔCT值之差。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 黃精對(duì)聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果可見，如圖1所示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞排列成條索狀，以中央靜脈為中心向四周放射狀排列，肝細(xì)胞輪廓清晰，未見脂肪變性和炎細(xì)胞分布；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，小葉間可見大量粗條狀結(jié)締組織增生，肝細(xì)胞腫脹壞死，可見彌漫性脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤(rùn)；黃精中、高劑量組大鼠肝臟病變明顯減輕，脂肪變性明顯減少，近乎消失，炎細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)域減少。

圖1 黃精對(duì)聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×400)

3.2 黃精對(duì)聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠血清TGF-β1、ICAM-1水平的影響

ELISA結(jié)果顯示，如表1所示，模型組大鼠血清與正常組相比TGF-β1、ICAM-1水平顯著提高(P<0.01)，而黃精治療組大鼠血清TGF-β1、ICAM-1水平比模型組顯著下調(diào)(P<0.01)。

表1 黃精對(duì)聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠血清TGF-β1、ICAM-1水平的影響

3.3 黃精對(duì)聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠TGF-β1、ICAM-1基因表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，如表2所示，模型組大鼠與正常組相比TGF-β1、ICAM-1基因表達(dá)水平有顯著提高(P<0.01)，而黃精治療組大鼠血清TGF-β1、ICAM-1水平比模型組顯著下調(diào)(P<0.01)。

表2 黃精對(duì)聯(lián)合誘導(dǎo)肝纖維化模型大鼠TGF-β1、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平的影響

4 討論

現(xiàn)代生活環(huán)境中，多種因素如高脂飲食、大量飲酒、化學(xué)性藥物、病毒、炎癥、毒素和自身免疫性疾病的累加，都會(huì)造成肝細(xì)胞損傷，長(zhǎng)期持續(xù)發(fā)展可以轉(zhuǎn)變?yōu)橹靖?、肝硬?liver cirrhosis，LC),甚至肝癌等眾多肝臟疾病。在眾多慢性肝病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是一個(gè)必經(jīng)環(huán)節(jié)[8]。如果沒有得到有效的干預(yù)，肝纖維化程度會(huì)持續(xù)加重，很快轉(zhuǎn)化為肝硬化甚至肝癌。現(xiàn)代研究已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)病程發(fā)展至肝硬化階段時(shí)，已經(jīng)很難治愈，而在肝纖維化階段，則是可以逆轉(zhuǎn)的[9-10]。因此，如何預(yù)防肝纖維化，延緩肝纖維化發(fā)展，尋找抑制肝纖維化發(fā)展過程中的可能靶點(diǎn)，是治療慢性肝病，防止肝硬化甚至肝癌出現(xiàn)的重中之重。

在肝纖維化的形成過程中，有眾多因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其中，ICAM-1是一種細(xì)胞黏附因子，在肝損傷因素作用下會(huì)大量表達(dá)，參與肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝損傷的發(fā)生[11-12]；TGF-β1是纖維化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子之一，與肝纖維化程度密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖，并促使其分化為肌成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)生成增加；同時(shí)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的產(chǎn)生，并促進(jìn)組織抑制因子(TIMP-1)的生成，從而使得細(xì)胞外基質(zhì)的降解量減少，細(xì)胞外基質(zhì)的生成大于降解，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，引起肝纖維化[13-16]。本研究顯示，模型組大鼠肝纖維化明顯，血清和肝組織中TGF-β1、ICAM-1表達(dá)顯著升高，提示細(xì)胞黏附引發(fā)的炎癥反應(yīng)以及肝星狀細(xì)胞的增殖活化是肝纖維化發(fā)生過程中的重要因素；而黃精治療組大鼠的肝纖維化程度有明顯減輕，且血清和肝組織中TGF-β1、ICAM-1表達(dá)明顯降低，說明黃精對(duì)肝纖維化模型大鼠的肝臟有保護(hù)作用，該保護(hù)作用可能與其抑制了血清和肝組織中TGF-β1、ICAM-1的表達(dá)，從而減輕了炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成有關(guān)。