LncRNA-ATB 對乳腺癌細胞增殖、遷移和凋亡的影響

劉安娜，駱沿極，肖創(chuàng)清

（湖南師范大學附屬第二醫(yī)院/中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第921醫(yī)院檢驗科，長沙 410003）

乳腺癌（breast carcinoma，BC）是全球重要公共衛(wèi)生問題，是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是20～59 歲女性惡性腫瘤死亡的主要原因。目前，BC 的發(fā)病率仍較高，嚴重威脅女性身心健康［1］。而BC 的診斷主要依靠傳統(tǒng)腫瘤標志物、影像學及病理檢查，以手術(shù)、放化療及內(nèi)分泌治療為主，近年來分子靶向治療也逐漸成為熱點。我們?nèi)孕柽M一步研究和發(fā)現(xiàn)新的特異性指標，提高BC 的早期診斷水平，也需要尋找更好的分子靶點以促進治療效果的提高，使該病死亡率降低。

長鏈非編碼RNA（lncRNA-activated by TGF-β，lncRNA-ATB）是位于第14 號染色體，長度約80kb 的lncRNA［2］。目前有文獻報道lncRNA-ATB 在多種惡性腫瘤中呈高表達，如肝細胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌等，并且參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡過程［2-6］。也有研究證明其在BC 中呈異常表達［7］，但目前對lncRNAATB 調(diào)控BC 細胞具體功能及機制的研究仍較少。本文通過研究lncRNA-ATB 對BC 細胞體外增殖、遷移、凋亡等生物學過程的影響，探討lncRNA-ATB 在BC 細胞中的作用，以期為BC 患者的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231 購自上海中喬新舟生物科技有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自北京康為世紀公司，lncRNA-ATB 引物及特異干擾siRNA引物由上海生物工程公司合成。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司；DMEM 培養(yǎng)基、碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）購自美國Sigma 公司；胰酶消化液、雙抗（青鏈霉素）購自碧云天公司；RNA 提取試劑TRIzol、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen公司；Transwell 小室購自Corning 公司；Annexin V-APC細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7 和MDAMB-231 細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清（FBS）+1%雙抗DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 特異干擾RNA 序列合成及細胞轉(zhuǎn)染 應(yīng)用ATB 特異性siRNA 序列信息如下：si-ATB-1：正義5′-GCACAGAGCAACUCUAUAATT-3′，反義5′-UUAUAGAGUUGCUCUGUGCTT-3′；si-ATB-2：正義5′-GAGCCGCUAAUUAAUUGAUTT-3′，反義5′-AUCAAUUAAUUAGCGCCUCTT-3′；si-ATB-3：正義5′-GCUAAGGAAAGAUCCAAAUTT-3′，反義5′-AUUUGGAUCUUUCCUUAGCTT-3′；陰性對照：正義5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義5-′ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。利用Lipofectamine2000 將siRNA 轉(zhuǎn)染至MCF-7 和MDAMB-231 細胞，細胞密度為每毫升1×105個，共設(shè)5 組：①空白對照組：乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231 細胞組；②陰性對照組：在MCF-7、MDA-MB-231 細胞中轉(zhuǎn)染陰性對照序列；③si-ATB-1：將siRNA-ATB-1 序列轉(zhuǎn)染至MCF-7、MDA-MB-231 細胞中，同樣將si-ATB-2和si-ATB-3 轉(zhuǎn)染至MCF-7、MDA-MB-231 細胞中成為第4 組和第5 組，轉(zhuǎn)染48 小時后采用實時熒光定量PCR 檢測siRNA 對lncRNA-ATB 的抑制率。

1.2.3 RNA 提取及q RT-PCR 檢測 按Trizol 說明書，采用苯酚-氯仿提取法，分別提取上述細胞中總RNA 提取細胞總RNA，分光光度計測定RNA 純度及濃度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄合成c DNA，以c DNA 作為模板進行PCR 特異性擴增，檢測lncRNA-ATB 的基因表達量。LncRNA-ATB 引物序列：正義5′- AGTTTTCTGTTCTGCCGTCT -3′，反義5′- CCTTACATGGCGTTTAGTCCTG -3′；內(nèi)參β-actin：正義：5′-ACCCTGAAGTACCCCATCGAG-3′，反義：5′- AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3′，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，循環(huán)40 次，采用2-△△Ct 法計算各組細胞中LncRNA-ATB 表達水平。

1.2.4 細胞克隆形成實驗 分別取轉(zhuǎn)染48h 上述5 組細胞，經(jīng)胰酶消化后再用DMEM 高糖培養(yǎng)基重懸細胞，以每孔200 個細胞的密度接種于6 孔板內(nèi)，置37°C 、5%CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3 周，2～3 天換液一次，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，PBS 液浸洗2 次，每孔加入4%多聚甲醛固定細胞15min，去固定液，結(jié)晶紫染液室溫染色30min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，細胞拍照。10%的醋酸浸泡，使脫色，550nm 處，酶標儀測定吸光度（OD）值，重復(fù)三次結(jié)果。

1.2.5 Transwell 細胞遷移實驗 分別取轉(zhuǎn)染48h 上述5 組細胞，經(jīng)胰酶消化離心后，再用無血清DMEM 培養(yǎng)基重懸細胞至重懸細胞至2×106個細胞/mL，基質(zhì)膠包被的Transwell 小室上室中每孔接種100μL，下室每孔均加入500μL 10%FBS 完全培養(yǎng)基置37℃培養(yǎng)箱中放置48h 后，吸出上室培養(yǎng)基，用PBS 洗3 遍，棉球擦去上室殘余細胞，用4%多聚甲醛固定20min，去除固定液，用結(jié)晶紫染色5min，水洗5 次，加入10%的醋酸浸泡脫色，550nm 處酶標儀測定吸光度（OD）值，重復(fù)三次，取平均值。

1.2.6 細胞凋亡實驗 取適量上述轉(zhuǎn)染后的各組細胞，用結(jié)合緩沖液500uL 懸浮細胞，加入5μL Annexin V-APC 混勻后，再加入5μL PI，混勻；室溫避光反應(yīng)15min；采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標準差，多組間采用單因素方差分析，組間比較采用Bonferroni 法，以P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)lncRNA-ATB 基因效率驗證 采用qRTPCR 檢測各組lncRNA-ATB 的相對表達量，圖1 可見，在MCF-7 細胞中，空白組、si-NC 組、si-ATB-1 組、si-ATB-2 組、si-ATB-3 組中l(wèi)ncRNA-ATB 相對表達量分別為1.01±0.13、1.09±0.04、0.16±0.01、0.41±0.03、0.27±0.02?？梢妔i-ATB-1 組、si-ATB-2 組、si-ATB-3 組lnc RNA-ATB 的表達量顯著低于空白組及NC 組（P＜0.05），空白組與NC 組無明顯差異（P＞0.05）。在MDA-MB-231 細胞中，空白組、si-NC 組、si-ATB-1組、si-ATB-2 組、si-ATB-3 組lncRNA-ATB 表達量分別0.83±0.08、0.76±0.09、0.18±0.01、0.44±0.09、0.23±0.02?？梢妔i-ATB-1 組、si-ATB-2 組、si-ATB-3組lncRNA-ATB 表達水平較空白組及NC 組明顯降低（P＜0.05），空白組與NC 組無顯著差異（P＞0.05）。在這兩種細胞系中，si-ATB-1 組lncRNA-ATB 的表達量較si-ATB-2 及si-ATB-3 低，因此選擇si-ATB-1 轉(zhuǎn)染lncRNA-ATB 進行后續(xù)實驗。

圖1 MCF-7、MDA-MB-231細胞lncRNA-ATB表達水平比較與空白組及NC組比較，* P＜0.05

2.2 下調(diào)lnc RNA-ATB 后兩種乳腺癌細胞克隆形成能力 圖2 可見，兩組細胞克隆集落生長情況有所差異，在MCF-7 細胞中，空白組、si-NC 組及si-ATB-1 組OD 值分別為1.343±0.010、1.327±0.003、0.985±0.007。si-ATB-1 組細胞OD 值明顯較空白組及si-NC 組低（P＜0.05），空白組與si-NC 組無明顯差異（P＞0.05）。在MDA- MB-231 細胞中，空白組、si-NC組及si-ATB-1 組OD 值分別為1.365±0.011、1.331±0.015、0.847±0.011，空白組及si-NC 組測得OD 值明顯高于si-ATB-1 組（P＜0.05），空白組與si-NC 組間無顯著差異（P＞0.05）。因此，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA-ATB的表達可降低乳腺癌細胞克隆形成能力。

圖2 下調(diào)lncRNA-ATB對MCF-7、MDA-MB-231細胞克隆形成能力的影響與空白組及NC組比較，* P＜0.05

2.3 下調(diào)lncRNA-ATB 后兩種乳腺癌細胞遷移能力 圖3 可見，在MCF-7 細胞及MDA-MB-231 細胞中下調(diào)lncRNA-ATB 后，采用Transwell 實驗分析各組細胞遷移能力，MCF-7 細胞中空白組、si-NC 組、si-ATB-1組測得OD 值分別是0.734±0.026、0.730±0.027、0.551±0.019，si-ATB-1 組與空白組及NC 組比較OD值顯著降低（P＜0.05），而空白組與NC 組無明顯差異（P＞0.05）。MDA-MB-231 細胞中空白組、si-NC 組與si-ATB-1 組OD 值分別為1.507±0.026、1.432±0.037、1.140±0.067，si-ATB-1 組OD 值明顯小于空白組及si-ATB-1 組（P＜0.05），空白組與NC 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由此我們可見，下調(diào)lncRNA-ATB 后的兩種乳腺癌細胞遷移能力明顯下降。

圖3 下調(diào)lncRNA-ATB對MCF-7、MDA-MB-231細胞transwell遷移能力的影響與空白組及NC組比較，*P＜0.05

2.4 下調(diào)lncRNA-ATB 對乳腺癌細胞凋亡的影響 圖4 中，在MCF-7 細胞中，si-ATB-1 組、空白組及NC組細胞凋亡率分別為（7.19±0.26）%、（3.26±0.34）%、（2.61±0.32）%，下調(diào)lncRNA-ATB 的MCF-7 細胞凋亡率明顯高于空白組及NC 組（P＜0.05）。在MDAMB-231 細胞中，si-ATB-1 組、空白組及NC 組細胞凋亡率分別為（6.88±0.17）%、（3.34±0.12）%、（3.35±0.14）%，空白組及NC 組細胞凋亡率明顯低于si-ATB-1 組（P＜0.05），提示下調(diào)lncRNA-ATB 基因可促使乳腺癌細胞凋亡。

3 討論

圖4 下調(diào)lncRNA-ATB對MCF-7、MDA-MB-231細胞凋亡的影響與空白組及NC組相比，*P＜0.05

許多研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-ATB 作為一種癌基因在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，并且參與腫瘤細胞生長、侵襲、遷移和凋亡的過程。目前在BC 的相關(guān)研究中，也發(fā)現(xiàn)了其在BC 組織中表達水平明顯高于相鄰正常組織，但在BC 細胞水平的研究仍較少，因此，從細胞分子層面探索BC 的發(fā)生和轉(zhuǎn)移侵襲的機制，將為BC 患者基因治療提供新的靶點。

本實驗通過特異s i R N A 靶向抑制B C 細胞lncRNA-ATB 的表達，再通過克隆平板形成實驗，發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA-ATB 表達水平后BC 細胞的增殖能力明顯下降。其可能的機制：（1）lncRNA-ATB 可作為一種競爭內(nèi)源性RNA（ceRNA），競爭性結(jié)合miRNA 反應(yīng)元件，從而影響下游靶基因的表達［8］，促進惡性腫瘤細胞的增殖。（2）miR-200c 被認為是lncRNA-ATB 直接結(jié)合位點，LncRNA-ATB 可通過抑制miR-200c 的水平進一步促進癌細胞的生長，同時上調(diào)miR-200 目標基因ZEB1 和ZEB2［9，10］。（3）LncRNA-ATB 還可以競爭性結(jié)合miR-590-5p 上調(diào)NF-90 水平影響肺鱗癌細胞增殖能力［11］。

之后，我們在兩種轉(zhuǎn)染siRNA-ATB 的BC 細胞中進行了transwell 遷移實驗，我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)lncRNA-ATB的BC 細胞組較陰性對照組遷移率顯著降低，其機制離不開上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），上皮細胞失去黏附和緊密連接能力，獲得間充質(zhì)細胞的特性［12，13］。這個過程的發(fā)生伴隨著上皮標記物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達水平的降低和間充質(zhì)標記物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）等的表達水平的升高［14］。一方面，lncRNA-ATB 可促進N-cadherin 和vimentin 的表達，抑制E-cadherin 的表達，從而促進EMT 的過程［11，15，16］；而另一方面，miRNA也可調(diào)控EMT 的過程，lnc RNA-ATB 通過TGF-β/ miR-200s / ZEB 軸誘導癌細胞EMT，促進癌細胞發(fā)生侵襲和遷移［2，3］。

最后，我們采用流式細胞術(shù)檢測了下調(diào)lncRNAATB 的BC 細胞組和陰性對照組的細胞凋亡情況，實驗發(fā)現(xiàn)前者細胞凋亡率明顯提高，因此我們認為下調(diào)lncRNA-ATB 可促進BC 細胞凋亡。已有研究表明細胞凋亡程序失調(diào)導致腫瘤的發(fā)生，細胞凋亡程序的調(diào)控受到許多因素的調(diào)節(jié)，最常見的細胞凋亡因子包括B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白家族和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）。Bcl-2 蛋白家族由促凋亡因子和抗凋亡因子兩組蛋白組成，Bax 作為Bcl-2 蛋白家族中的成員之一促進細胞的凋亡，而Bcl-2 作為Bcl-2 家族成員之一是一種抗凋亡因子，可以下調(diào)Bax 的表達從而以抑制凋亡的發(fā)生，促凋亡因子和抗凋亡因子之間的失衡導致細胞凋亡的失調(diào)；Caspases-3 是caspases 家族中重要的角色，它在多種凋亡因子的作用下激活，誘導細胞的凋亡［17］。下調(diào)lncRNA-ATB 的表達可下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax 和激活caspase-3 來促進癌細胞凋亡［18］。

綜上，lncRNA-ATB 在乳腺癌細胞的惡性生物學過程起重要的作用，下調(diào)lncRNA-ATB 的水平可使BC細胞的增殖和遷移能力明顯下降，并促使BC 細胞的凋亡。因此，它有望成為BC 患者預(yù)后評估的生物學標志物和基因治療的新靶點。