甲狀腺乳頭狀癌預后標志物的研究

陳 帥，羅錦琳，羅 霽，張超杰，鄒聯(lián)洪，3，范培芝

（1.湖南師范大學第一附屬醫(yī)院/湖南省人民醫(yī)院，長沙 410002；2.湘雅常德醫(yī)院，常德 415003；3.急危重癥代謝組學湖南省重點實驗室，長沙 410002）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌器官最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在過去三十年間增加了三倍多［1］［2］，雖然甲狀腺乳頭狀癌（thyroid papillary carcinoma，PTC）患者可獲得良好的預后［3］，但仍有一部分的甲狀腺乳頭狀癌的患者會發(fā)生復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移［4］。目前有許多關于疾病的生物信息學研究，但有關PTC 的生物信息學研究卻不多見，固在本研究中，我們期望通過生信的方法來初步探索PTC 在分子水平的機制研究。

1 資料與方法

臨床資料：在2016 年9 月～2018 年9 月就診于湖南省人民醫(yī)院診斷為PTC 的患者中隨機選取3 位患者，在術中收集PTC 患者的甲狀腺乳頭狀癌組織及相對應的癌旁組織標本（距腫瘤大于2cm），我們將其收取的標本用于轉(zhuǎn)錄組芯片的相關研究。本研究收集相關標本均得到湖南省人民醫(yī)院倫理委員會的批準同意，患者或其法定監(jiān)護人對本次研究方法及內(nèi)容均知情同意，并簽字認可。所有的患者病理和臨床相關資料均齊全。

表1 甲狀腺乳頭狀癌患者一般臨床資料

1.1 轉(zhuǎn)錄組芯片檢測 用Trizol 試劑組織RNA 試劑盒分別從冷凍組織中提取總RNA。采用基因芯片技術對基因化學進行LncRNA、mRNA 分析。簡單地說，將rRNA 去除后，制備生物素化Arna（CrNA）。得到原始視圖人類基因表達陣列（CAT）。再進行雜交和掃描。所有樣品均經(jīng)技術復制件處理?；蛐酒瑨呙鑳xGeneChip Scanner 3000 7G 用于掃描完成的陣列。圖像用基因芯片命令控制臺（AGACC）提取，用表達式控制臺軟件進行分析。

1.2 LncRNAs 和差異基因篩選 將獲取的基因芯片數(shù)據(jù)進行標準化處理，使用差異倍數(shù)法篩選出相關差異表達的lncRNAs 和mRNAs，以Fold-chang ≥2，P 值≤0.05，作為篩選符合差異表達的入組條件。

1.3 差異基因的GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 通過DAVID 在線分析工具對甲狀腺乳頭狀腺癌差異表達基因進行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析識別基因譜的分子功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析探討這些基因在這些路徑中的潛在功能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 差異基因蛋白互作網(wǎng)絡分析 通過STRING 數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/）對差異基因進行蛋白互作網(wǎng)絡分析（protein protein interaction network，PPI），找出在PTC 中作用的關鍵基因及關鍵通路，初步探討PTC的相關分子機制，為PTC 的治療和預后評估提供理論依據(jù)。

1.5 TGCA 數(shù)據(jù)采集及處理 采用癌癥基因組圖譜（TGCA）數(shù)據(jù)庫中檢索了具有臨床信息和基因表達譜的PTC 病例。使用R 包“OIsurv”將基因的表達水平定義為為高表達值（表達值＞中值）或低表達值（表達值＜中值）。采用Kaplan-Meier 法進行生存曲線分析。采用對數(shù)秩檢驗進行單因素生存分析。

1.6 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0 軟件，采用雙面對數(shù)秩檢驗（Kaplan-Meier）來分析15 個基因在TGCA 數(shù)據(jù)庫中PTC 臨床數(shù)據(jù)樣本中的總體生存率（OS）及無名生存期（DFS）差異的統(tǒng)計學意義。P 值＜0.05 具有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌中差異表達的基因 為了分析PTC 中差異表達的LncRNAs，我們對3 例PTC 和與之相匹配的癌旁正常甲狀腺組織中篩選出的差異mRNA和Lnc RNA 進行了基因組分析。根據(jù)篩選出的差異表達基因芯片數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)228 個Lnc RNA 在PTC和配對非癌組織之間有差異表達（差異倍數(shù)≥2.0，P＜0.05）。其中207 個LncRNAs 下調(diào)，21 個LncRNAs上調(diào)。n336302 所對應的lncRNA（差異倍數(shù)：26.32）是上調(diào)最大的LncRNA，n407932 所對應的lncRNA 是下調(diào)最大的lncRNAs（差異倍數(shù)：263.1579），結(jié)果如圖1A、B。

同樣，我們采用差異倍數(shù)≥2.0，P＜0.05 的標準篩選甲狀腺乳頭狀癌的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)共有364 個mRNA 在PTC 和成對癌旁非癌組織中差異表達。其中，有82 個mRNA 表達上調(diào)，282 個mRNA 表達下調(diào)。上調(diào)的差異基因有FN1、MXRA5、DUSP6、TGFβR1、CTGF，其中纖維連接蛋白1（Fibronectin1，F(xiàn)N1）是上調(diào)差異基因中差異倍數(shù)最大的基因（FC=94.12）。下調(diào)的差異基因有TPO、GOLGA8Q、FCGBP、KIT、PLA2R1等，TPO（甲狀腺過氧化物酶）是其中下調(diào)最明顯的基因（FC=400），結(jié)果如圖1C、D。

2.2 差異基因的GO 功能富集分析及KEGG 通路分析 差異基因在GO 分析中分為三個功能群：生物過程、分子功能及細胞成分。根據(jù)KFGG 通路分析，在篩選的差異表達基因中共有13 條通路富集，分別是“小細胞肺癌”、 “甲狀腺激素合成”、胰液分泌”、“TGF-β信號通路”、“補體和凝血級聯(lián)”、“色氨酸代謝”、“蛋白多糖在癌癥中的作用”、“胃酸分泌”、“胰高血糖素信號”、“ECM-受體相互作用”、“礦物吸收”、“焦點粘連”和“金葡菌感染”（圖1E）。差異基因在生物過程中主要富集于“負增長調(diào)節(jié)”?！暗鞍酌附Y(jié)合”在分子功能中顯著富集。在細胞組成中，差異基因主要富集在“細胞外小體”（圖1F）。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌中差異表達的基因A表示差異LncRNAs的火山圖，B為差異LncRNAs的熱圖，C表示篩選出的差異基因的火山圖，D表示差異基因的熱圖，火山圖顯示差異基因的表達，log 2值（折疊變化）＞1.5，P＜0.05。E表示KEGG通路排名前十的富集圖，F(xiàn)表示上調(diào)差異基因GO功能分析各條目前5位

2.3 差異基因蛋白互作網(wǎng)絡分析 我們使用STRING在線分析軟件進一步分析差異表達基因中的關鍵基因，將364 個差異表達基因進行在線分析，得出如下差異基因的蛋白共表達網(wǎng)絡圖。篩選條件：score ≥0.4。并且score 得分越高表明兩基因間的相互作用越強（圖3A）。為進一步篩選出作用的關鍵基因，我們選取了score 得分最高，即相互作用最強基因，ATP6V1A、TGFβR1、BCL2、SPARC、CFH、ATP6V1F、ITGβ1、FN1、ITGA8、KCNQ1、CFI、SMAD9、BID、ITGAV 及KCNJ2 等15 個關鍵基因（圖2 B）。TGCA 數(shù)據(jù)庫中進行生存分析顯示，對DFS 有差異的是FN1（圖3 A）、SPARC（圖3 B）；與OS相關的是TGFβR1（圖3 4C）、SMAD9（圖3 D）。

3 討論

PTC 是世界上最常見的內(nèi)分泌相關癌癥之一，其發(fā)病率在過去的近30 年里幾乎增加兩倍［5］。有研究表明，TERT 突變、BRAF V600E 突變和RET/PTC 重排等遺傳變異都是腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的原因之一［6-8］。PTC 的確切發(fā)病機制仍不清楚。因此，識別和鑒定與PTC 相關的關鍵基因具有十分重要的意義。在目前的研究中，我們的結(jié)果提供了一個全面的生物信息學分析的基因和途徑，可能參與了PTC 的進展，我們將篩選出的4 個基因進行簡要介紹。

纖維連接蛋白1（FN1）參與細胞的粘附和遷移過程，包括胚胎發(fā)生、傷口愈合、凝血、宿主防御、轉(zhuǎn)移，并參與各種生化過程［9］。FN1 在多種腫瘤中表達，既是促癌基因又是抑癌基因。同時研究顯示，在甲狀腺乳頭狀癌中，F(xiàn)N1 促進甲狀腺乳頭狀癌的增殖、粘附、遷移和侵襲［7］；FN1 的過表達是甲狀腺癌侵襲性的重要因素，我們研究同樣顯示，F(xiàn)N1 在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達是上調(diào)的，生存分析提示，高表達的FN1 與甲狀腺乳頭狀癌的預后正相關，提示FN1 在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)揮致癌基因的作用，F(xiàn)N1 是甲狀腺乳頭狀癌的一個潛在靶點。

圖2 A圖為PTC患者中相關差異表達基因蛋白共表達的網(wǎng)絡圖，B圖為STRING在線軟件篩選的15個關鍵基因的蛋白共表達網(wǎng)絡圖

圖3 根據(jù)Kaplan-Meier估計的TCGA數(shù)據(jù)

基質(zhì)細胞蛋白SPARC（分泌蛋白酸性，富含半胱氨酸，又稱骨連接蛋白或BM-40）是一種膠原結(jié)合蛋白，具有誘導細胞聚集和影響細胞增殖的功能［10］。SPARC在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮著重要作用，是一種多面蛋白。SPARC 在甲狀腺癌中的報道較少，本研究生存分析顯示高表達SPARC 的甲狀腺乳頭狀癌患者具有更長的生存預后，提示SPARC 在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，但其具體機制仍有待進一步驗證。

轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）信號通路在調(diào)節(jié)細胞生長、分化、發(fā)育中具有重要的作用，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關。TGFβR1 在TGFβ信號通路傳導中起著關鍵的作用。在甲狀腺癌中，TGF-β1 誘導高遷移率組A（HMGA 1）使得促進甲狀腺癌的增殖及侵襲。通過顯微解剖中央和浸潤區(qū)腫瘤組織的寡核苷酸芯片分析發(fā)現(xiàn)人乳頭狀甲狀腺癌組織中TGF-β1 的表達高于正常甲狀腺組織［11］。

我們對甲狀腺乳頭狀癌差異基因的信號通路富集分析結(jié)果同樣提示TGF-β信號通路參與了甲狀腺腺癌的發(fā)生發(fā)展。TGF-β1、SMAD9 在甲狀腺乳頭狀癌中表達上調(diào)，生存分析提示與SMAD9 與TGF-β1 甲狀腺乳頭狀癌的總生存（OS）相關。